Name: 荧光活化细胞分选-放射性配体处理组织（FACS-RTT）以确定放射性信号的细胞来源 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 了解FACS-RTT技术用于阿尔茨海默病细胞水平蛋白表达研究的方法。该技术利用TgF344-AD大鼠模型，实现高灵敏度细胞分辨率定量分析，为神经退行性疾病机制研究提供重要工具。

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本工作由瑞士国家科学基金会（资助号：320030-184713）资助。作者BBT和KC由Velux基金会（项目号：1123）资助。作者ST获得了瑞士国家科学基金会（早期博士后流动奖学金，编号：P2GEP3_191446）、Prof Dr. Max Cloetta基金会（临床医学加奖学金）以及Jean和Madeleine Vachoux基金会的支持。

所有实验程序均分别符合瑞士日内瓦州人类与动物实验伦理委员会、州级研究伦理委员会（CCER）以及日内瓦州卫生总署的规定。数据报告遵循《动物研究：报告》 体内 实验（ARRIVE）指南
1. SPECT 相机的准备与校准
<ol>
	<li>打开相机，加载操作软件（参见材料表）。点击归零 XYZ 载物台按钮以执行归零操作。</li>
	<li>设置实验，包含一次持续 10 分钟的扫描采集。将步进模式设为精细，将采集模式设为列表模式（用于记录完整的发射光谱）。</li>
	<li>设置扫描床，并确保加热系统、呼吸传感器和麻醉装置功能正常且固定牢固（图 1A-D）。然后，将一个模体（即含有已知浓度125I 的 2 mL 溶液置于 2 mL 微离心管中）放置在动物头部将要定位的位置（居中放置，图 1E）。</li>
	<li>通过屏幕底部三个图像辅助，滑动三个维度的光标来设定扫描区域。确保模体与动物的扫描体积相同。</li>
	<li>使用步骤 1.2–1.4 中设定的参数开始对模体进行扫描，以便后续校准。</li>
</ol>
2. SPECT 成像的工作区设置
<ol>
	<li>使用消毒性杀病毒剂清洁工作区，并在所有表面铺上软纸。</li>
	<li>确保异氟烷和氧气各自的储罐中有足够的供应。</li>
	<li>准备一根24 G导管，剪除蝶形导管的翼片，以便更清晰地观察大鼠尾静脉。</li>
	<li>拔出针头后，用肝素溶液（25000 U/mL）完全填充导管以进行涂层。然后将针头重新插入导管中，以防止导管插入后血液凝固。</li>
</ol>
3. [125I]CLINDE 放射性示踪剂的合成
警告：放射性物质可能具有足够的电离能量，影响活细胞的原子并损害其遗传物质（DNA）。
<ol>
	<li>务必在经授权可进行放射性实验的适当环境中操作。 
	注意：操作放射性物质时，应穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括手指和身体剂量计。尽量与任何放射源保持安全距离。</li>
	<li>在手套箱内的热循环仪中，将100 µg三丁基锡前体与碘化钠（Na125I）（见材料表）及5 µL 37%过乙酸溶于100 µL乙酸中，于70 °C孵育20分钟。</li>
	<li>用含50%乙腈（ACN）的水溶液稀释反应液至总体积为500 µL。将500 µL稀释后的反应液注入反相色谱柱（见材料表）。</li>
	<li>采用线性梯度高效液相色谱法（HPLC）分离[125I]CLINDE，流动相为7 mM H3PO4中含5%-95% ACN，运行10分钟。将收集的组分用H2O稀释至终体积10 mL，然后将稀释后的样品注入浓缩柱（见材料表）。</li>
	<li>用300 µL无水乙醇从柱上洗脱[125I]CLINDE，随后在室温下将乙醇置于真空离心浓缩仪中蒸发40分钟。</li>
	<li>将含有[125I]CLINDE的残留物溶于300 µL无菌生理盐水中，制备成储备液。</li>
	<li>测定其放射性活度后，用无菌生理盐水稀释储备液，获得500 µL中含0.037 MBq的溶液。</li>
	<li>通过高效液相色谱法（HPLC）纯化示踪剂。使用450 nm波长的标准校准曲线确定洗脱时间，并分离单一放射性峰。采用七种不同浓度的非放射性CLINDE标准品（0.1 µg、0.5 µg、0.75 µg、1 µg、1.5 µg、2 µg和5 µg，溶于400 µL含50% ACN的溶液中）绘制标准校准曲线。通过放射性薄层色谱法（radio TLC）检测单一放射性峰，确定放射化学纯度，并确保其纯度高于60%。</li>
	<li>通过测定450 nm处的紫外吸收值以及利用非放射性参照化合物建立的校准曲线，计算放射性配体的比活度。确保比活度大于1000 GBq/µmol。</li>
</ol>
4. [125I]R91150 放射性示踪剂的合成
注意：请遵循与 CLINDE 合成部分中所述相同的安全规则。
<ol>
	<li>在手套箱中，将300 µg R91150前体与3 µL无水乙醇、3 µL冰醋酸、15 µL无载体Na125I（参见材料表）（10 mCi）溶于0.05 M NaOH的溶液以及3 µL 30% H2O2混合，孵育30分钟。</li>
	<li>将全部反应液注入反相色谱柱（参见材料表）。</li>
	<li>采用等度高效液相色谱法（乙腈/水50/50，10 mM乙酸缓冲液）以3 mL/min流速分离得到[125I]R91150。</li>
	<li>用H2O稀释[125I]R91150，定容至10 mL。</li>
	<li>将10 mL稀释后的反应液上样至富集柱（参见材料表）。</li>
	<li>用300 µL无水乙醇从柱中洗脱[125I]R91150。</li>
	<li>将乙醇在室温下置于真空离心浓缩仪中孵育40分钟以蒸发除去。</li>
	<li>将含有[125I]R91150的残留物溶于300 µL生理盐水中。</li>
	<li>通过高效液相色谱法纯化示踪剂。使用450 nm波长的标准校准曲线确定洗脱时间，并收集单一放射性峰。通过放射性薄层色谱检测单峰以确定放射化学纯度，确保其纯度高于98%。</li>
</ol>
5. 动物准备
<ol>
	<li>在诱导室中使用3%异氟烷对TgF344-AD大鼠（雄性或雌性，2-24月龄）进行称重并麻醉。待大鼠深度麻醉后，将诱导室中的异氟烷流量降至2%（0.4 L/min，100% O2）。</li>
	<li>将动物置于配备麻醉面罩的预热垫上，以2%异氟烷（0.4 L/min，100% O₂）维持麻醉2).</li>
	<li>在动物眼部涂抹眼用凝胶润滑剂，并通过呼吸监测确认麻醉深度；必要时调整麻醉剂量。</li>
	<li>在尾静脉中插入24 G导管。</li>
</ol>
6. SPECT 采集
<ol>
	<li>将动物转移至相机载物台&#160;配备设定为38°C的温控加热垫（图1E).</li>
	<li>将动物头部固定在咬合杆上，并安装头部支撑装置。</li>
	<li>在60分钟扫描中设置实验，共采集60帧，每帧1分钟。重复使用步骤1中设置的所有其他参数。点击 更新图像 更新动物位置的按钮。</li>
	<li>通过屏幕底部三个维度的三幅图像，滑动游标来设定扫描区域。</li>
	<li>注入500 µL的放射性示踪剂（[125I]CLINDE 或 [125I]R91150)，然后用 300 µL 无菌 0.9% NaCl 冲洗管腔。同时点击 开始采集 开始扫描。</li>
	<li>扫描过程中，需确保动物处于持续麻醉状态，并监测其呼吸频率。必要时调整异氟烷的流量。</li>
	<li>扫描结束后，迅速通过断头法处死麻醉动物。</li>
</ol>
7. 扫描重建
<ol>
	<li>打开扫描重建软件（参见材料表），然后打开数据集，查找在扫描文件夹中生成的[filename].parameters文件。</li>
	<li>选择目标同位素。注意，列表模式参数允许在此步骤中选择多个同位素。</li>
	<li>设置以下参数：0.4 mm体素尺寸、4个（POS-EM）子集、6次迭代（相当于24ME-EM）、无后滤波，以及对应同位素的衰变校正。将输出格式设为NIfTI，然后选择开始SPECT重建。</li>
</ol>
8. 大鼠脑组织提取
<ol>
	<li>在与扫描过程相同的麻醉过程中&#160;并在通过以下方式确认动物处于深度麻醉状态后&#160;监测&#160;其呼吸频率，随后通过断头器进行断头，并迅速将头部转移至解剖台。</li>
	<li>用剪刀从后向前小心地剪开头顶部的皮肤，直至眼睛中点位置。</li>
	<li>切除颅底和颈椎周围的多余肌肉。</li>
	<li>接下来，小心地将剪刀的一个刀片插入颅骨后部的枕骨大孔，然后用手术钳去除颅骨后部。</li>
	<li>然后，使用手术钳小心地移除颅骨的上部。老年雄性大鼠的颅骨可能较厚，应将其分小块移除，以避免损伤脑组织。</li>
	<li>用剪刀小心地剪除脑膜。脑膜可能在提取过程中损伤脑组织，为预防损伤应将其去除。</li>
	<li>去除颅骨顶部后，将动物头部翻转，用小型扁平刮勺小心切断视神经和三叉神经，轻柔地取出脑组织。</li>
	<li>将大脑小心地转移至冰上一个平坦、洁净的玻璃表面，以进行解剖。</li>
	<li>使用扁平金属刮勺和剃须刀片解剖脑部感兴趣区域。将组织置于2 mL离心管中，称量所获取的组织重量。可直接使用脑组织进行细胞分离，或迅速置于液氮中冷冻，以备后续使用。</li>
</ol>
9. 细胞分离
<ol>
	<li>务必在洁净且无菌的环境中操作。建议在二级生物安全柜（BSC）内进行操作。确保进入生物安全柜的手套和所有设备均为无菌状态。</li>
	<li>为准备细胞分选，请遵循 Jaclyn M. Schwarz14 的实验方案。 
	注意：本实验中使用了市售的神经组织解离试剂盒（见材料表）进行细胞制备。
	<ol>
		<li>将样品放入含有 1 mL HBSS（无钙、无镁）的 2 mL 离心管中，离心（300 × g，2 分钟，室温 = RT），弃去上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
		<li>加入 1900 µL 酶混合液-1，在 37 °C 孵育 15 分钟，每 5 分钟轻轻翻转混匀一次。</li>
		<li>加入 30 µL 酶混合液-2，用移液器 1（见材料表）来回轻柔吹打 30 次，然后在 37 °C 孵育 15 分钟，每 5 分钟轻轻翻转混匀一次。</li>
		<li>使用移液器 2 轻柔吹打混匀，再使用移液器 3 吹打混匀，随后在 37 °C 孵育 10 分钟以解离组织。</li>
		<li>用 80 µm 细胞筛过滤细胞，加入 10 mL HBSS（无钙、无镁），离心（300 × g，10 分钟，室温），弃去上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
		<li>为去除髓鞘，将沉淀重悬于 400 µL 髓鞘去除缓冲液（见材料表）中，然后加入 100 µL 髓鞘去除磁珠（见材料表），在 4 °C 孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入 5 mL 髓鞘去除缓冲液，离心（300 × g，10 分钟，室温），弃去上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
		<li>加入 500 µL 髓鞘去除缓冲液，将离心管放入磁力柱中。用 1 mL 髓鞘去除缓冲液洗涤磁力柱四次。</li>
		<li>离心（300 × g，2 分钟，室温），弃去上清液，注意不要扰动沉淀。短暂涡旋（2 秒）以解离细胞，加入 5 µL Fc 阻断剂 CD32。再次涡旋，4 °C 孵育 5 分钟。</li>
		<li>加入 100 µL 目标一抗混合液，在 4 °C 孵育 20 分钟。</li>
		<li>离心（350 × g，5 分钟，4 °C），弃去上清液，注意不要扰动沉淀。将离心管倒置在软纸上吸干残留液体。</li>
		<li>短暂涡旋（2 秒）后，加入 100 µL 二抗混合液，在 4 °C 孵育 15 分钟。</li>
		<li>加入 2 mL 髓鞘去除缓冲液，离心（350 × g，5 分钟，4 °C），弃去上清液，注意不要扰动沉淀。将离心管倒置在软纸上吸干残留液体。将细胞重悬于 250 µL 无菌 PBS 中，并立即进行细胞分选。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 细胞分选
<ol>
	<li>准备一个含500 µL无菌PBS的微量离心管，用于收集分选的细胞。</li>
	<li>每1000 µL细胞悬液中加入10 µL Hoechst，以染色活细胞的细胞核，并将其与死细胞区分开。</li>
	<li>尽快将细胞转移至4 °C的细胞分选仪。</li>
	<li>首先根据前向散射光和侧向散射光对细胞进行分选，然后分选Hoechst阳性细胞；接着根据目标抗体对细胞进行分选，分别收集阳性染色的细胞。注意将阳性细胞与自发荧光细胞区分开。</li>
	<li>计数每种目标细胞群的分选细胞数量。</li>
</ol>
11. γ计数
<ol>
	<li>使用与SPECT校准相同的模体溶液，取10 µL稀释于1 mL水中，对γ计数系统进行校准。 
	注意：由于γ计数系统的精度更高，因此需要对模体溶液进行稀释。</li>
	<li>将分选后细胞的离心管放入γ计数系统中，并按照制造商的操作说明进行γ计数。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

据我们所知，该技术首次描述了一种能够更深入理解放射性示踪剂在活体细胞水平上结合变化的方法。in vivo 结合变化的放射性示踪剂可通过本方案进行量化分析，本方案以[125I]CLINDE（TSPO）和[125I]R91150（5HT2AR）为例，介绍了一种在细胞水平上定量放射性示踪剂结合的多尺度方法。
该技术具有足够的稳健性和灵敏度，可精确定位多种胶质细胞改变的细胞来源，其检测范围涵盖由脂多糖（LPS）诱导的强烈炎症反应，到阿尔茨海默病（AD）大鼠模型中观察到的更为细微的胶质细胞变化，从而为研究提供重要的补充信息 体内 核神经影像学，确定了SPECT所获得信号的微胶质细胞来源。该研究进一步表明，FACS-RTT甚至能够以5HT为例，在细胞尺度上分辨神经受体密度的变化2AR (图3C最后，研究提供了该技术在人类死后组织中应用的证据，显示阿尔茨海默病（AD）受试者星形胶质细胞和小胶质细胞中的TSPO浓度升...

神经退行性疾病（如阿尔茨海默病，AD）的特征是神经元丢失，并伴随症状的逐渐加重。AD 是痴呆症最常见的病因，占所有病例的 60%–70%，全球约有 5000 万人受其影响1。在神经病理学层面，AD 的两个主要特征是细胞外淀粉样β（Aβ）斑块的积聚和细胞内 Tau 蛋白形成的神经原纤维缠结。胶质细胞的改变也与 AD 相关2，并可能涉及多种神经递质系统的功能障碍3,4。
TgF344-AD 大鼠品系经过基因改造，通过表达人源 APP 和 PS1ΔE9 转基因来模拟阿尔茨海默病（AD），从而导致可溶性和不可溶性 Aβ-40 与 Aβ-42 的表达以及淀粉样斑块的形成5。该模型还表现出 Tau 蛋白的过度磷酸化形式的累积，进而引发 tau 蛋白病。从 9 至 24 个月龄开始，这些大鼠会逐渐发展出 AD 的典型病理特征，并伴随认知功能障碍5,6,7,8,9。
正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和放射自显影是基于γ射线发射与定量的技术。放射性示踪剂可通过以下方式定量 体内 （PET 和 SPECT）或 离体/体外 （放射自显影）。这些灵敏的技术有助于理解多种脑部疾病（如阿尔茨海默病）的发病机制。事实上，在神经炎症方面，已有大量研究评估18 kDa易位蛋白（TSPO），一种 体内 神经炎症标志物，使用放射性标记示踪剂如[11C]-(R)-PK11195 或 [11C]PBR28（综述见10此外，已采用放射性示踪剂研究神经递质系统的改变11,12,13.
然而，这些技术无法确定放射性信号的细胞来源。这可能会妨碍对 PET/SPECT 中放射性配体结合改变所涉及生物学基础的解释。例如，在针对神经炎症的 TSPO 研究中，明确 TSPO 的增加或减少是源于星形胶质细胞还是小胶质细胞的变化，具有至关重要的意义。为克服这些问题，已开发出荧光激活细胞分选结合放射性配体处理组织技术（FACS-RTT），该技术可分别评估每种细胞类型的放射性配体结合情况，并量化每个细胞中靶蛋白的密度。因此，这一创新技术与 PET 和 SPECT 成像具有高度互补性和兼容性。
本研究沿两个方向应用了该技术：一是使用TSPO特异性放射性配体研究神经炎症，二是评估5-羟色胺系统。在第一个方向中，旨在明确TSPO信号在急性炎症反应中的细胞来源。因此，在通过脂多糖（LPS）注射诱导神经炎症后，对大鼠脑组织进行体内[125I]CLINDE SPECT成像研究，随后应用FACS-RTT技术。此外，相同的成像与FACS-RTT方案也被应用于12月龄和24月龄的TgF344-AD转基因大鼠及其匹配的野生型（WT）大鼠。第二个方向旨在通过离体按细胞类型评估5-HT2A受体密度，确定该大鼠模型中5-羟色胺系统改变的来源。

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioVet</td><td>BioVet</td><td></td><td>生命体征检测软件</td></tr><tr><td>Bondclone C18 反相色谱柱</td><td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Des-Sur</td><td>日内瓦大学医院</td><td></td><td>病毒灭活剂</td></tr><tr><td>Fc阻断剂 / 抗CD32抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB550270</td><td>适用于大鼠</td></tr><tr><td>FITC标记的抗大鼠CD90抗体</td><td>Biolegend</td><td>202504</td><td>适用于大鼠</td></tr><tr><td>肝素</td><td>B. Braun</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱仪（HPLC）</td><td>Knauer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>321312</td><td>24 G导管</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td>ZDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Lacryvisc</td><td>Alcon</td><td>2160699</td><td></td></tr><tr><td>LS柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>美皮护软胶带</td><td>3M</td><td>F51DA01</td><td></td></tr><tr><td>MILabs-Uspect II</td><td>MILabs</td><td></td><td>SPECT相机软件</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>细胞分选仪</td></tr><tr><td>髓鞘去除磁珠II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-733</td><td>包含磁珠和髓鞘去除缓冲液</td></tr><tr><td>0.9%氯化钠无菌溶液</td><td>B. Braun</td><td>395202</td><td></td></tr><tr><td>神经组织解离试剂盒（P型）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>包含酶混合物、移液管1、2和3</td></tr><tr><td>尼龙筛网片</td><td>Amazon</td><td>CMN-0074-10YD</td><td>宽度40英寸，孔径80微米</td></tr><tr><td>过氧乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>R91150 pr&amp;eacute;cursor</td><td>CERMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 柱</td><td>Waters</td><td></td><td>浓缩柱</td></tr><tr><td>碘化钠 Na&lt;sup&gt;125&lt;/sup&gt;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三丁基锡前体</td><td>CERMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-SPECT Rec2.38c</td><td>MILabs</td><td>Version Rec2.38c</td><td>SPECT图像重建软件</td></tr><tr><td>USPECT II</td><td>MILabs</td><td></td><td>SPECT相机</td></tr><tr><td>Wizard 3&quot;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>γ计数器</td></tr></tbody></table>

荧光激活细胞分选-放射性配体处理组织法（facs-rtt）用于确定放射性信号的细胞来源

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

胶质细胞可能在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病，AD）的病理生理过程中具有重要影响。这些细胞的改变可能与促炎状态相关。TgF344-AD 大鼠品系被设计用于表达人源 APP 和人源 PS1。ΔE9 基因，编码淀粉样蛋白 Aβ-40 和 Aβ-42，随年龄增长表现出淀粉样病理改变和认知功能缺陷。本研究采用 TgF344-AD 大鼠模型，评估 18 kDa 转运蛋白（TSPO，胶质细胞活化的标志物）结合的细胞来源以及 5HT2A受体（5HT2AR）受体水平，这些受体在阿尔茨海默病（AD）中可能受到干扰。本文介绍的技术是荧光激活细胞分选结合放射性配体标记组织技术（FACS-RTT），一种可定量、特异性针对细胞类型的分析方法，可作为补充手段 体内 PET 或 SPECT 或 离体/体外 自显影技术。该方法利用细胞分选后通过γ计数器对先前成像所用的同种放射性标记示踪剂进行定量，从而以高细胞特异性和灵敏度确定放射性标记蛋白的细胞来源。例如，FACS-RTT研究显示：（i）在脂多糖（LPS）诱导的神经炎症大鼠模型中，TSPO结合增加与小胶质细胞相关；（ii）在TgF344-AD大鼠中，与野生型（WT）大鼠相比，12个月和18个月时TSPO结合的增加首先与星形胶质细胞相关，随后与小胶质细胞相关；（iii）纹状体中5HT的密度2A在相同的AD大鼠模型中，星形胶质细胞在18个月时R值降低。有趣的是，该技术可几乎推广至所有放射性示踪剂。

野生型大鼠在单侧注射LPS后接受了in vivo SPECT扫描，使用[125I]CLINDE放射性示踪剂（图2）。该扫描（采用放射性示踪剂注射后45–60分钟图像的叠加数据）显示，在LPS注射部位的大脑区域（图2A）中，[125I]CLINDE的结合信号高于对侧脑区（图2B）。后续对ex vivo样本进行FACS-RTT分析，验证了上述结果，并揭示[125I]CLINDE结合位点数量的增加仅存在于小胶质细胞中，表明脑同侧[125I]CLINDE信号的细胞来源为小胶质细胞（图3A）15。
使用相同的[125I]CLINDE放射性示踪剂，该方案在老年TgF3...

荧光激活细胞分选-放射性配体处理组织（FACS-RTT）是一种强大的工具，用于研究18 kDa转位蛋白或5-羟色胺5HT受体在特定组织中表达细胞的功能。2A阿尔茨海默病中受体表达的细胞尺度研究。本方案描述了 离体 FACS-RTT 在 TgF344-AD 大鼠模型中的应用

荧光激活细胞分选-放射性配体处理组织法（FACS-RTT）用于确定放射性信号的细胞来源

胶质细胞可能在神经退行性疾病（如阿尔茨海默病，AD）的病理生理过程中具有重要影响。它们……

该方案是对活体成像的补充，能够实现对放射性示踪剂在细胞类型和细胞水平上的定量分析，其分辨率尺度不同于活体实验所获得的尺度。该技术的主要优势在于其高灵敏度，以及通过使用放射性配体和细胞分选所实现的细胞级分辨率。打开相机并加载操作软件。点击 Home XYZ 载物台按钮以执行归位。设置实验程序，包含一次10分钟的扫描采集。将步进模式设置为精细，采集模式设置为列表模式，以记录完整的发射光谱。设置检查床，并确保加热系统、呼吸传感器和麻醉系统功能正常且连接牢固。然后，在动物头部将要放置的位置放置一个模体。通过屏幕底部三幅图像辅助，滑动三个维度的游标来设定扫描区域。确保模体与动物的扫描体积相同。使用先前设定的参数开始对模体进行扫描，以用于后续校准。务必在经批准可进行放射性实验的适当环境中操作。在手套箱内的热循环仪中，将100微克三丁基锡前体与碘化钠及5微升37%过乙酸溶于100微升乙酸中，于70摄氏度孵育20分钟。用50%乙腈水溶液将反应液稀释至终体积500微升。将500微升稀释后的反应液注入反相色谱柱。使用线性梯度高效液相色谱法，在7毫摩尔磷酸缓冲液中以5%至95%乙腈梯度洗脱10分钟，分离CLINDE。将分离产物用水稀释至终体积为10毫升，然后将稀释后的反应液注入浓缩柱。用 300 微升无水乙醇从柱中洗脱 CLINDE，然后在室温下将乙醇置于真空离心浓缩仪中孵育 40 分钟以蒸发除去。将含有 CLINDE 的残余物用 300 微升生理盐水稀释，制成储备液。测定其放射性后，用生理盐水进一步稀释储备液，得到 500 微升、放射性活度为 0.037 兆贝可的溶液。使用冷参照化合物建立标准曲线，并求解线性回归方程：Y 等于 AX 加 B，以获得系数 A 和 B。X 代表冷化合物的质量，Y 代表曲线下的面积。根据标准曲线及放射性配体的曲线下面积，通过在 450 纳米处测量紫外吸收值，确定放射性配体的曲线下面积。估算放射性配体的质量并测量其活性。确保比活性大于每微摩尔1,000吉贝可。单击“更新图像”按钮以更新动物位置。通过屏幕底部三个维度的三幅图像，滑动游标来设定扫描区域。将实验设置为60分钟的扫描，共包含60帧，每帧1分钟。其余所有参数均沿用初始设置。注入500微升放射性示踪剂，然后用300微升无菌0.9%氯化钠溶液冲洗管路。同时，单击“开始采集”以启动扫描。打开扫描重建软件，然后打开数据集，查找在扫描文件夹中生成的文件名参数文件。选择目标同位素。请注意，列表模式参数允许在此步骤中选择多个同位素。根据论文中的描述，设置不同的重建参数，如体素大小、子集数量和迭代次数。选择输出格式为 NIFTI，然后选择开始 SPECT 重建。使用扁平金属刮刀和剃刀剥离脑部感兴趣区域。将组织放入一个 2 毫升离心管中，并称量所获得的组织重量。将样品放入含有1毫升无钙、无镁HBSS的2毫升离心管中，然后在室温下以300 × g离心2分钟，去除上清液时注意不要扰动沉淀。加入1,900微升酶混合液一，于37摄氏度孵育15分钟，每5分钟轻轻翻转离心管以混匀。加入30微升酶混合液二。用1,000微升移液器轻轻吹打混合液30次。然后在37摄氏度孵育15分钟，每隔5分钟轻轻颠倒管子混匀一次。孵育前，先用200微升移液器轻轻吹打混合，再用10微升移液器吹打混合，随后在37摄氏度孵育10分钟，以解离组织。使用70微米细胞筛过滤细胞，并加入10毫升无钙镁的HBSS。在室温下以300 × g离心10分钟，去除上清液，注意不要扰动沉淀。为去除髓鞘，将沉淀重悬于400微升髓鞘去除缓冲液中，然后加入100微升髓鞘去除磁珠，在4摄氏度下孵育15分钟。加入5毫升髓鞘去除缓冲液，室温下以300 × g离心10分钟。加入500微升髓鞘去除缓冲液，将悬浮的沉淀物放入磁力分离柱中。用1毫升髓鞘去除缓冲液洗涤柱子4次。在室温下以300 × g离心两分钟，去除上清液，注意不要扰动沉淀。短暂涡旋以分散细胞，加入5 µL Fc阻断剂CD32。加入100 µL目标一抗混合液，在4 °C孵育20分钟。在4°C条件下，以350 × g离心5分钟，去除上清液，注意不要扰动沉淀。将离心管倒置在软纸上轻压吸去残留液体。短暂涡旋振荡离心管，然后加入100 µL二抗混合液，在4°C孵育15分钟。加入1毫升髓鞘去除缓冲液，重复离心。弃去上清液，将离心管倒置在软纸上轻压吸去残留液体。用250微升无菌PBS重悬细胞，立即进行细胞分选。野生型大鼠的活体SPECT扫描显示，在脂多糖注射部位的CLINDE结合高于脑对侧区域。经过荧光激活细胞分选放射性配体处理组织（FACS-RTT）的离体样本显示，仅在小胶质细胞中存在更高数量的CLINDE结合位点，表明脑同侧CLINDE信号的细胞来源为小胶质细胞。在12月龄TgF344-AD大鼠中，跨膜转运蛋白（TSPO）结合的增加仅限于星形胶质细胞。在24月龄大鼠中，由于星形胶质细胞和小胶质细胞的改变，观察到TSPO结合增加。在更年老的TgF344-AD大鼠中，纹状体星形胶质细胞的5HT2AR密度较野生型降低。当对人源AD死后样本进行FACS-RTT分析时，与年龄匹配的对照组相比，AD受试者的皮层星形胶质细胞和小胶质细胞均表现出TSPO的过度表达。操作放射性物质时，应遵循放射防护指南，并穿戴适当的个人防护装备。实验结束后，务必对工作环境进行去污处理。在此实验流程之后，可对分离的细胞群体进行蛋白质定量和基因表达分析。

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