荧光激活细胞分选-放射性配体处理组织法（FACS-RTT）用于确定放射性信号的细胞来源

该方案是对活体成像的补充，能够实现对放射性示踪剂在细胞类型和细胞水平上的定量分析，其分辨率尺度不同于活体实验所获得的尺度。该技术的主要优势在于其高灵敏度，以及通过使用放射性配体和细胞分选所实现的细胞级分辨率。

打开相机并加载操作软件。点击 Home XYZ 载物台按钮以执行归位。设置实验程序，包含一次10分钟的扫描采集。

将步进模式设置为精细，采集模式设置为列表模式，以记录完整的发射光谱。设置检查床，并确保加热系统、呼吸传感器和麻醉系统功能正常且连接牢固。然后，在动物头部将要放置的位置放置一个模体。

通过屏幕底部三幅图像辅助，滑动三个维度的游标来设定扫描区域。确保模体与动物的扫描体积相同。使用先前设定的参数开始对模体进行扫描，以用于后续校准。

务必在经批准可进行放射性实验的适当环境中操作。在手套箱内的热循环仪中，将100微克三丁基锡前体与碘化钠及5微升37%过乙酸溶于100微升乙酸中，于70摄氏度孵育20分钟。用50%乙腈水溶液将反应液稀释至终体积500微升。

将500微升稀释后的反应液注入反相色谱柱。使用线性梯度高效液相色谱法，在7毫摩尔磷酸缓冲液中以5%至95%乙腈梯度洗脱10分钟，分离CLINDE。将分离产物用水稀释至终体积为10毫升，然后将稀释后的反应液注入浓缩柱。

用 300 微升无水乙醇从柱中洗脱 CLINDE，然后在室温下将乙醇置于真空离心浓缩仪中孵育 40 分钟以蒸发除去。将含有 CLINDE 的残余物用 300 微升生理盐水稀释，制成储备液。测定其放射性后，用生理盐水进一步稀释储备液，得到 500 微升、放射性活度为 0.037 兆贝可的溶液。

使用冷参照化合物建立标准曲线，并求解线性回归方程：Y 等于 AX 加 B，以获得系数 A 和 B。X 代表冷化合物的质量，Y 代表曲线下的面积。根据标准曲线及放射性配体的曲线下面积，通过在 450 纳米处测量紫外吸收值，确定放射性配体的曲线下面积。

估算放射性配体的质量并测量其活性。确保比活性大于每微摩尔1,000吉贝可。单击“更新图像”按钮以更新动物位置。

通过屏幕底部三个维度的三幅图像，滑动游标来设定扫描区域。将实验设置为60分钟的扫描，共包含60帧，每帧1分钟。其余所有参数均沿用初始设置。

注入500微升放射性示踪剂，然后用300微升无菌0.9%氯化钠溶液冲洗管路。同时，单击“开始采集”以启动扫描。打开扫描重建软件，然后打开数据集，查找在扫描文件夹中生成的文件名参数文件。

选择目标同位素。请注意，列表模式参数允许在此步骤中选择多个同位素。根据论文中的描述，设置不同的重建参数，如体素大小、子集数量和迭代次数。

选择输出格式为 NIFTI，然后选择开始 SPECT 重建。使用扁平金属刮刀和剃刀剥离脑部感兴趣区域。将组织放入一个 2 毫升离心管中，并称量所获得的组织重量。

将样品放入含有1毫升无钙、无镁HBSS的2毫升离心管中，然后在室温下以300 × g离心2分钟，去除上清液时注意不要扰动沉淀。加入1,900微升酶混合液一，于37摄氏度孵育15分钟，每5分钟轻轻翻转离心管以混匀。加入30微升酶混合液二。

用1,000微升移液器轻轻吹打混合液30次。然后在37摄氏度孵育15分钟，每隔5分钟轻轻颠倒管子混匀一次。孵育前，先用200微升移液器轻轻吹打混合，再用10微升移液器吹打混合，随后在37摄氏度孵育10分钟，以解离组织。

使用70微米细胞筛过滤细胞，并加入10毫升无钙镁的HBSS。在室温下以300 × g离心10分钟，去除上清液，注意不要扰动沉淀。为去除髓鞘，将沉淀重悬于400微升髓鞘去除缓冲液中，然后加入100微升髓鞘去除磁珠，在4摄氏度下孵育15分钟。

加入5毫升髓鞘去除缓冲液，室温下以300 × g离心10分钟。加入500微升髓鞘去除缓冲液，将悬浮的沉淀物放入磁力分离柱中。用1毫升髓鞘去除缓冲液洗涤柱子4次。

在室温下以300 × g离心两分钟，去除上清液，注意不要扰动沉淀。短暂涡旋以分散细胞，加入5 µL Fc阻断剂CD32。加入100 µL目标一抗混合液，在4 °C孵育20分钟。

在4°C条件下，以350 × g离心5分钟，去除上清液，注意不要扰动沉淀。将离心管倒置在软纸上轻压吸去残留液体。短暂涡旋振荡离心管，然后加入100 µL二抗混合液，在4°C孵育15分钟。

加入1毫升髓鞘去除缓冲液，重复离心。弃去上清液，将离心管倒置在软纸上轻压吸去残留液体。用250微升无菌PBS重悬细胞，立即进行细胞分选。

野生型大鼠的活体SPECT扫描显示，在脂多糖注射部位的CLINDE结合高于脑对侧区域。经过荧光激活细胞分选放射性配体处理组织（FACS-RTT）的离体样本显示，仅在小胶质细胞中存在更高数量的CLINDE结合位点，表明脑同侧CLINDE信号的细胞来源为小胶质细胞。在12月龄TgF344-AD大鼠中，跨膜转运蛋白（TSPO）结合的增加仅限于星形胶质细胞。

在24月龄大鼠中，由于星形胶质细胞和小胶质细胞的改变，观察到TSPO结合增加。在更年老的TgF344-AD大鼠中，纹状体星形胶质细胞的5HT2AR密度较野生型降低。当对人源AD死后样本进行FACS-RTT分析时，与年龄匹配的对照组相比，AD受试者的皮层星形胶质细胞和小胶质细胞均表现出TSPO的过度表达。

操作放射性物质时，应遵循放射防护指南，并穿戴适当的个人防护装备。实验结束后，务必对工作环境进行去污处理。在此实验流程之后，可对分离的细胞群体进行蛋白质定量和基因表达分析。