Name: 通过 3D 相关聚焦离子束铣削制备样品，用于高分辨率冷冻电子断层扫描 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 了解三维相关聚焦离子束铣削技术，用于哺乳动物、酵母和细菌细胞的冷冻电子断层扫描样品制备。该方法通过冷冻荧光显微镜精确定位目标蛋白，实现稀有细胞结构的高分辨率成像。

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感谢Inga Wolf对信息技术基础设施的支持，Florian Beck提供的计算支持，以及Oda H. Schiøtz对稿件的审阅。Philipp S. Erdmann的部分经费来自亚历山大·冯·洪堡返国研究员奖学金，Florian Wilfling的部分经费来自欧洲分子生物学组织长期奖学金（EMBO Long-term Fellowship ALTF 764-2014）。Anna Bieber获得了勃林格殷格翰基金博士生奖学金的支持。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

1. 实验方案中的关键步骤
优化细胞培养和载网冷冻参数是该工作流程的基础。在项目初期，投入时间优化标记策略、细胞分布和标记微珠的分布，并测试不同的载网制备和滤纸吸附参数，是非常值得的。使用经过优化的快速冷冻样品将显著促进后续处理过程。
对于任何透射电子显微镜（TEM）实验，均需要制备玻璃态冰样品。对于HeLa等较大的哺乳动物细胞，每个网格方格中以1-2个细胞为宜，但即使细胞密度较高，仍可能形成良好的玻璃态冰。可选地，可在哺乳动物细胞（例如HEK293、HeLa）中通过在冷冻前10分钟将2.5-10%（v/v）的甘油加入培养基中孵育，以改善玻璃化效果23。如有条件，可使用图案化载网以确保细胞的精确定位与均匀分布，从而提高玻璃化质量以及后续的关联成像效果24。
尽管在工作流程中可以选择特定细胞，但显示目标生物学特征的细胞数量过少会显著降低整体通量。为了提高目标蛋白阳性细胞中的相关性，应使用足够明亮的荧光染料。这一点在内源性表达水平下尤为重要。我们发现，在冷冻条件下，mVenus通常优于EGFP，因其亮度更高25，且具有蓝移效应，使其在冷冻条件下仍适用于标准的GFP滤光片设置26。对于非点状目标结构，还需权衡波长与定位精度之间的关系（阿贝衍射极限）。
高效的三维关联成像还要求载网具有良好的机械稳定性，并需谨慎操作。虽然可以使用标准的带碳支持膜的金或铜载网，但根据具体项目情况，使用更刚性的SiO2薄膜可显著提高成功率。然而，目前尚未明确确定以下哪一项是成功实现三维关联成像的最关键因素：(a) 机械稳定性，或 (b) 匹配基底与薄膜之间的热膨胀系数以减少冷冻皱褶27。此外，对于拾取脆弱的金载网，可使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂层的培养皿5。
除了确保样品稳定性外，还需谨慎选择 FLM 成像参数，以获得高质量的荧光图像序列，从而在 FIB 切割过程中实现最佳定位。建议对 FLM 数据测试不同的去噪28或反卷积技术，因为这些方法可显著改善标志点（fiducials）和细胞信号的定位效果。在将荧光信号与 FIB-SEM 图像进行关联时，对标记微珠（fiducial beads）的良好采样至关重要。这些微珠应均匀分布在细胞周围，并尽可能位于不同的 z&#160;高度上。建议通过检查那些被有意排除在标志点模型之外、但可凭肉眼清晰关联的微珠的预测位置与实际位置，来验证关联结果的一致性。还应始终考虑 3DCT 的均方根误差（RMSE）值，以评估配准的一致性。
由于聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）腔室中研磨材料和残留水的沉积（即再污染）会在片层两侧添加非晶态物质，从而增加有效片层厚度，因此将精细研磨后的片层长时间保留在显微镜中通常会因额外的电子散射事件而降低透射电镜（TEM）数据质量。因此，研磨通常采用两步法进行：首先对所有位置进行粗研磨（即研磨至约800 nm），然后进行精研磨（至约150–250 nm），并在最后一个片层完成后立即卸载载网。然而，通过逐个位点处理目标区域，即在同一片层上连续完成粗研磨和精研磨，可获得更优的相关成像效果，因为这种方式不会给片层留下发生弯曲或变形的时间。但这种方法会根据系统的再污染速率，限制每张载网上可制备的片层数量。当再污染速率为20 nm/h时，可在1–1.5小时内制备4–6个片层。
整个载网或粗切 lamella 的移动超过 &#62;300 nm 将导致相关性差或无法完成关联（另见下文讨论的局限性）。因此，应定期检查，例如通过比较聚焦离子束（FIB）切削前、中、后阶段的离子束（IB）图像。显示显著移动（&#62;300 nm）的位点应予以舍弃。应优化样品制备（即载网类型、细胞密度和冷冻投入参数；参见方案第1节）和切削策略，以避免此类移动。如步骤3.6所述，通过逐位点切削并减小 lamella 宽度，可显著减少 lamella 弯曲。如前所述，尽管应力释放切口15的设计旨在减少 lamella 弯曲，但它们常导致解耦的 lamella 发生协同移动，从而实际上阻碍关联。可使用集成的荧光显微镜（FLM）系统来解决此问题。
2. 方法的改进与故障排除
在进入冷冻条件之前，强烈建议对活细胞成像中的样品进行充分的表征。优化细胞样品、处理方案，并在进入冷冻工作流程前明确预期的信号类型，可显著提高实验成功率。
在本工作流程中，使用配备低温载台的独立荧光显微镜对样品进行成像，随后将载网转移至聚焦离子束显微镜中。然而，该方法已在集成荧光显微镜的FIB-SEM系统中得到验证，因此无需转移样品即可获取荧光图像29,30,31。利用此类集成系统，可在聚焦离子束切削过程中及之后对感兴趣区域进行成像，以检测目标荧光信号是否存在，同时不会增加最终薄片被污染的风险。然而，必须注意所用显微镜的光学参数，例如，低数值孔径（NA）物镜将限制对定位标记微珠和目标信号定位的精确度。尽管如此，集成的荧光显微镜装置有助于更好地应对载网和薄片的轻微形变，因为荧光显微图像序列可不断更新，并与最新的扫描电镜（SEM）和离子束（IB）图像进行比对。
在FIB切割与TEM数据采集之间，除了对薄片进行荧光成像外，还可采用TEM后的相关成像来验证薄片位置的准确性及切割的正确性5,6。
在整个相关联的工作流程中，尤其是在进行透射电子显微镜（TEM）操作时，建议将投影的荧光数据叠加到聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）/TEM图像上。此类经典的关联显微成像（CLEM）视图有助于更直观地理解细胞的哪些部分被包含在薄片中，同时也可作为有效的验证手段，用于确认关联定位的准确性。
3. 该方法的局限性
3D 相关聚焦离子束（FIB）方法需要能够附着标记微珠的样品。因此，该方法目前仅限于投入冷冻的载网样品。对于高压冷冻（HPF）的（组织）样品，目前只能进行二维-二维的相关分析。潜在的解决方案可能是使用内部标记物（例如细胞器、染色的脂滴）32,33。最终的相关成功率取决于多种因素，包括样品质量、荧光显微镜系统、薄片厚度以及目标结构的大小。采用所述3D配准方法的关联精度在最终的离子束图像上估计约为200–300 nm，大致相当于FIB加工薄片的典型厚度7。因此，明显小于此尺寸的细胞结构目前难以精确定位。此外，加工区域过度移动（&#62;300 nm）也会降低关联精度，这一问题可能通过将荧光显微镜（FLM）系统集成到FIB/SEM仪器中来解决。在加工过程中出现明显变形或弯曲的薄片，无论如何都应从后续流程中排除。
总体而言，目前冷冻荧光成像技术受限于阿贝衍射极限。随着超分辨冷冻荧光显微技术的日益广泛应用（以及商业化），尤其是在与聚焦离子束/扫描电子显微镜（FIB/SEM）联用实现即时操作的情况下，对细胞结构的更精确靶向成像可能成为现实。
4. 方法的意义
与非靶向和事后关联技术相比，三维关联FIB切片技术能够在耗时且资源密集的透射电镜（TEM）步骤之前选择合适的区域，从而实现更高效的数据采集和项目规划。此外，关联的荧光数据提供了额外的信息层，对于解释断层图像以及将冷冻电子断层成像（cryo-ET）结果整合到多尺度研究中具有关键作用，尤其是在处理无定形蛋白组装体或尺寸过小而无法进行模板匹配及子断层平均分析的结构时。
5. 重要性及潜在的未来应用
结合先进的工作流程，如高压冷冻样品的低温提拉技术34,35、低温聚焦离子束-扫描电镜三维成像36以及超分辨率荧光成像26,37,38,39，三维靶向薄片制备技术不仅有望用于解析孤立细胞中的生物学过程，还可使组织和患者样本适用于聚焦离子束切削及低温电子断层扫描。因此，该技术将能够在高分辨率下解析病理过程，从而成为实现纳米级活检的关键组成部分。

聚焦离子束（FIB）切割技术能够从冷冻固定的样品中制备薄的生物样本，避免了传统机械切片中常见的刀痕和压缩伪影等问题1。当与冷冻电子断层扫描技术（cryo-electron tomography）结合时，FIB切割可实现对细胞形态的高分辨率生物学研究，并直接在细胞内以亚纳米分辨率解析大分子复合物的结构2,3,4。尽管在随机切割的FIB薄片中容易观察到核糖体等丰度较高的结构，但许多细胞过程依赖于多个复合物的共定位，或局限于细胞内的特定区域。因此，为避免在切割过程中丢失感兴趣的生物学结构而仅依赖随机采样，必须实现高效的靶向定位。这就需要采用一种关联成像方法，将扫描电子显微镜（SEM）-FIB与冷冻荧光显微镜（FLM）的数据相结合。虽然理论上可以省略初始关联步骤，仅在透射电子显微镜（TEM）成像后整合FLM与冷冻电子断层扫描数据5,6，但荧光引导的聚焦离子束切割能够在切割前精确选择目标区域，从而显著提高数据采集效率。自该技术提出以来7，三维关联FIB切割在生物研究中的应用一直较为有限，直到我们近期利用该技术在酵母中鉴定出一种新的液-液相分离（LLPS）区室结构8。
本文介绍了一种通用的三维冷冻关联光镜与电镜（CLEM）实验方案，可用于研究从细菌、酵母到哺乳动物细胞等多种类型的样品。尽管实验使用了特定的仪器组合，但各步骤并不依赖于特定硬件，可作为现有方案的扩展，轻松转移至其他系统3,5。所用经过验证的设备清单及推荐设置详见材料表和表1。该流程包含四个关键步骤：（1）样品制备，（2）利用冷冻荧光显微镜定位感兴趣区域，（3）三维关联聚焦离子束切削，以及（4）在冷冻透射电子显微镜下对冷冻薄片进行目标结构定位，以开展冷冻电子断层成像（cryo-ET）数据采集（图1）。

<table><tbody><tr><td>自动网格</td><td>Thermo Fisher Scientific / 自制</td><td>1036173（无切口），1205101（带切口）</td><td></td></tr><tr><td>C型环</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>配备冷冻模块的Corrsight</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FLM 替代方案 1</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne COOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65011</td><td>推荐使用 1 &amp;micro;m 定位标记微珠</td></tr><tr><td>EM Grids R1/4 SiO2</td><td>Quantifoil</td><td>N1-S13nAu20-01</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 4 相机，配备柱后Selectris X能量滤波器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>相机/滤波器替代方案 1</td></tr><tr><td>FIB Aquilos 1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FIB 替代方案 1</td></tr><tr><td>FIB Aquilos 2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FIB 替代方案 2</td></tr><tr><td>FIB Quanta 3D FEG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FIB 替代方案 3</td></tr><tr><td>FIB Scios</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FIB 替代方案 4</td></tr><tr><td>K2 summit 相机，配备柱后能量滤波器 968 Quantum K2</td><td>Gatan</td><td></td><td>相机/滤波器替代方案 2</td></tr><tr><td>配备冷冻模块的Leica TCS SP8</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FLM 替代方案 2</td></tr><tr><td>等离子清洗机 PDC-3XG</td><td>Harrick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯片（0.25 mm）</td><td>plastx24.de</td><td>11645</td><td>裁剪至与滤纸相同尺寸</td></tr><tr><td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>TEM 替代方案 1</td></tr><tr><td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>TEM 替代方案 2</td></tr><tr><td>THUNDER Imager&amp;nbsp; EM Cryo CLEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FLM 替代方案 3</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>也可使用手动冲压装置</td></tr><tr><td>Whatman 滤纸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10311807</td><td>直径 55 mm；需裁剪以适配 Vitrobot</td></tr></tbody></table>

用于高分辨率冷冻电子断层扫描的三维关联聚焦离子束切片样品制备

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）已成为研究细胞超微结构及分子复合物在其天然、冷冻水合状态下结构的首选方法。然而，cryo-ET 要求样品足够薄，以避免对入射电子束产生散射或阻挡。对于较厚的细胞样品，可通过冷冻聚焦离子束（FIB）切削技术实现。本实验方案描述了如何在 FIB 切削过程中采用三维关联成像方法，精确定位特定的细胞位点。该方法结合了三维荧光显微镜数据与 FIB-扫描电子显微镜的信息。利用该技术，可高精度地定位稀有细胞事件和结构，并通过冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）在分子分辨率水平上进行可视化观察。

本方案详细介绍了发现含有EH结构域的内吞作用蛋白1（Ede1）依赖性内吞蛋白沉积物（END）及其在自噬体中降解与滞留过程的技术流程8。END是酿酒酵母（S. cerevisiae）中一种通过液-液相分离形成的区室，在内吞事件失败后可缓冲多种参与网格蛋白介导的内吞作用（CME）的蛋白质。Ede1是该结构的主要组分之一，它既作为CME的组成部分，又作为选择性自噬受体介导这一新型液-液相分离（LLPS）区室的降解。因此，本研究在酒精脱氢酶（ADH）启动子控制下使用Ede1与EGFP的融合蛋白（EGFP-Ede1）来可视化观察END，因为Ede1的过表达会干扰内吞作用的早期阶段，从而持续诱导液-液相分离的发生。
在载有过度表达EGFP-Ede1酵母细胞和1 µm fiducial标记物的冷冻电镜载网上，选择五个位置进行GFP通道的FLM图像堆栈采集（图6A；TFS Corrsight；共聚焦模式，焦距步长300 nm，扫描范围10 µm）。随后将载网转移至FIB仪器（Quanta 3D FEG）中，通过荧光图像与SEM载网概览图之间的2D-2D关联比对，确定已采集FLM图像堆栈的载网方格位置（参见步骤3.2）。
针对每个选定的区域，使用低电流（10 pA，1200倍放大）采集离子束图像，并在3DCT中记录相应的基准标记位置。在选定具有目标生物学特征的位置并将其三维位置与FLM图像堆栈进行拟合后，将所得的变换应用于预测的END位置，进而确定薄片制备的位点（图6B）。本研究示例中采用相对于网格表面倾斜11°的FIB束（45° FIB摆动预倾角；18°样品台倾角）。将感兴趣的位置转移后，通过测量预测位置与FIB图像中显著标志物（如孔洞、冰污染、基准标记珠）之间的距离，手动绘制FIB加工图案（图6D）。通过有意排除在FLM和IB图像中均可清晰识别的标记珠，评估配准的准确性，随后比较其在离子束图像中的实际位置与预测位置（例如，图6B、C中的菱形标记）。对于图6C所示区域，配准相关性结果准确（即FLM中标记珠的预测位置与其在离子束图像中的对应位置完全重合，3DCT报告的配准亚像素RMSE值极低）。因此，在预测位置（位点B）切割薄片，并精细铣削至约200 nm的厚度（最终图案偏移量）。
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig06.jpg" /> 
图6：酵母细胞内吞蛋白沉积物（END）的三维关联定位代表性结果。（A）研磨前载网的扫描电镜（SEM）概览图。彩色方框表示此前已采集荧光图像堆栈的网格区域。（B-C）单个网格区域内的三维关联。通过在荧光显微图像（B，此处显示为最大强度投影）和离子束图像（C）中匹配多个对应的标记微珠（彩色方框），验证三维配准的准确性；随后利用菱形标记的微珠位置进行预测验证。接着，在离子束图像视图中预测了两个潜在研磨位点处目标信号的位置（红色圆圈）。（D）B位点的放大图，显示三个目标信号点（红色圆圈）的预测位置以及初始研磨图案（黄色方框）。第四个荧光信号点预测位置远低于其他信号点，因此在研磨过程中未被纳入目标（灰色圆圈）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在成功完成聚焦离子束（FIB）切片并将载网转移至冷冻透射电子显微镜（Titan Krios，300 kV 工作电压，配备 Gatan K2 直接电子探测器和 Bioquantum 能量过滤器）后，使用 SerialEM 记录载网的概览图像，并用于定位含有薄片的方格区域。针对每一片薄片，采集概览图像，并在 3DCT（3D-2D）中利用相应的标记微珠对荧光显微镜（FLM）数据进行三维配准。随后，利用由标记微珠计算出的变换关系，预测目标生物学结构的位置（图 7A）。以更高倍率记录的薄片概览图像进行拼接，并通过清晰可见的参照特征（例如标记微珠）实现感兴趣区域的关联定位。此外，也可使用多种软件生成传统的关联显微成像（CLEM）概览图10,12。
根据相关性分析，图7A所示的薄片中发现了四个可能用于采集断层图像的位点。然而，其中也包含了一个在三维关联FIB切削过程中未被靶向的位点（参见图6D；灰色圆圈），以及一个被冰污染遮挡的位点（图7；灰色方框）。因此，仅能在两个位点成功记录断层图像（图7B）。总体而言，关联成功率约为75%，即在预测位点处成功找到经历转移至透射电镜并保留完整结构的薄片，并观察到END结构（共12个关联位点）。在完成断层图像重建、分割及模板匹配后，可在其天然环境中可视化单个END结构（图7C、D）。这包括环绕END的窗孔状内质网（ER）、偶尔与之接触的脂滴，以及被排除在LLPS区室之外的核糖体。综上所述，本研究展示了三维关联FIB切削技术如何从完整细胞中获取稀有生物学过程的分子水平信息。
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig07.jpg" /> 
图7：利用冷冻电子断层扫描技术可视化END的代表性结果。 (A低倍透射电子显微镜下观察到的研磨位点整体形貌 图6 可轻松与 FLM 最大强度投影相关联（图6B）以定位感兴趣的生物学特征（红色叉号）。B在第二步中，可关联更高倍率（拼接）的图像，并设定断层扫描图采集位置（黄色框）。由离焦信号产生的位置（灰色框，参见 图 6D）被忽略。C-D利用这种三维关联聚焦离子束（FIB）方法，可以在其天然环境中观察内吞蛋白沉积物（END）。内质网（ER）、核糖体、膜结构和脂滴等结构均可被识别和可视化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>等离子清洗仪设置</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harrick Plasma Cleaner PDG-3XG：</td>
			<td colspan="3">射频设置：“HI”，30 秒；氮气等离子体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>加样杆设置</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Vitrobot Mk IV：</td>
			<td colspan="3">湿度 100%；吸水力 = 8；吸水时间 = 10 秒；等待时间 0 秒；（此设置适用于大多数悬浮细胞和贴壁细胞）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB GIS 位置与时间参数</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanta 3D FEG：</td>
			<td colspan="3">倾转角 = 0，旋转角 = -180，&#160; Z 位置 = 13.5，温度设定值 = 26.15°，时间 = 8 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Scios：</td>
			<td colspan="3">倾转角 = 0，旋转角 = -180，Z 位置 = 9.8，温度设定值 = 28° C，时间 = 7 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Aquilos 1：</td>
			<td colspan="3">软件预设位置，温度设定值 = 28°，时间 = 7 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Aquilos 2：</td>
			<td colspan="3">软件预设位置，温度设定值 = 28°，时间 = 7 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIB 溅射镀膜仪设置</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum System：</td>
			<td colspan="3">在 Quorum 样品制备腔内：10 mA，40 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Scios：</td>
			<td colspan="3">10 W，500 V，250 mA，0.2 mbar，15 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Aquilos 1：</td>
			<td colspan="3">1 kV，10 mA，10 Pa，15 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Aquilos 2：</td>
			<td colspan="3">1 kV，10 mA，10 Pa，15 秒</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>断层扫描图像采集</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios Gi2</td>
			<td colspan="3">K2 相机，Gatan Bioquantum 能量过滤器</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">20 eV 狭缝；剂量对称倾转方案（Hagen），步长 2°；从 +10°（样品片预倾转！）开始至 +70° 和 -50°</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios Gi4</td>
			<td colspan="3">Falcon 4；Selectris X 能量过滤器</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">10 eV 狭缝；剂量对称倾转方案（Hagen），步长 2°；从 +10°（样品片预倾转！）开始至 +70° 和 -50°</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>荧光显微镜图像采集</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrsight（共聚焦模式）</td>
			<td colspan="3">物镜：Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0.9 NA Pol；图像堆栈采集参数：x-y 像素尺寸 = 161.25 nm，z 步长 = 300 nm。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 Cryo-Confocal</td>
			<td colspan="3">物镜：Leica HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM；图像堆栈采集参数：x-y 像素尺寸 = 84 nm，z 步长 = 300 nm。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：已测试设备及建议设置

本文介绍了一种用于引导冷冻电子断层成像样品制备的三维关联聚焦离子束切削技术流程。首先通过冷冻荧光显微镜确定荧光标记的目标蛋白的三维位置，随后对该位置进行聚焦离子束切削。该方案适用于哺乳动物细胞、酵母细胞和细菌细胞。

冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）已成为在天然状态下研究细胞超微结构和分子复合物的首选方法，……

三维关联聚焦离子束（FIB）切片技术使得特定甚至稀有的细胞事件能够被低温透射电子显微镜（Cryo-TEM）观察到，从而可在天然环境中直接揭示这些事件的超微结构。该关联工作流程提高了在复杂细胞环境中精确定位稀有细胞结构的成功率，并有助于对其作出明确鉴定。演示该实验步骤的将是相关冷冻电子断层扫描技术专家 Anna Bieber 和 Christina Capitanio。首先对接种细胞的载网进行冷冻荧光显微镜观察，通过在荧光和反射模式下获取宽视野概览图像开始实验，随后选择具有荧光信号的合适网格区域。在确保细胞和微珠均匀分布在每个方格中心区域后，选择200目网格中既可被聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）又可被透射电子显微镜（TEM）访问的方格，并且所选方格应距离网格边缘至少三个方格以上。在每个选定的网格方格上，使用适当的聚焦步长采集荧光图像序列。应使用高数值孔径物镜以提高光子计数和定位精度。使用数值孔径为0.9的物镜，在共聚焦显微镜上以300纳米的步长采集图像堆栈，并对奈奎斯特采样频率进行过采样。记录多色图像堆栈，并将载网置于液氮中保存，直至后续使用。可使用载网上的切口或取向标记，以确保其在后续放入透射电子显微镜时的正确方位。将载网装入冷冻聚焦离子束-扫描电子显微镜（cryo FIB-SEM）仪器中。确保铣削方向与透射电子显微镜（TEM）的倾斜轴垂直。使用等离子体镀膜仪和气体注入系统，在FIB-SEM系统预设的样品台位置对载网进行保护性有机金属层镀覆。接下来，记录扫描电镜（SEM）网格的概览图像，并与荧光显微镜（FLM）概览图像进行二维关联。通过手动检查所记录的网格概览图像或使用软件包来确定网格方格。在 FLM 和 SEM 网格概览图中选择并标记四个对应的方格位置，并计算标记点之间的变换关系，以实现 FLM 与 SEM 图像的关联配准。然后，将标记物置于已采集 FLM 图像堆栈的相应网格方格中心，以预测其在 SEM 视图中的位置。对于每个关联的网格方格，选择合适的 FIB 刻蚀角度，用低束流离子束成像，并选取与荧光数据匹配的视野位置和放大倍数。对于 200 目网格，采集包含单个网格方格（包括网格条）的 FIB-SEM 数据。然后，对同一区域拍摄扫描电镜（SEM）图像，以帮助在荧光图像和离子束图像中识别对应的微珠。使用三维相关分析工具 3D CT，将原始或去卷积后的三维荧光显微镜（FLM）图像序列与每个位置的二维离子束图像进行配准。在荧光数据中，选择四个标记微珠，右键点击位置列表，通过信号在 X、Y 和 Z 方向的高斯拟合确定微珠的三维坐标。随后，在离子束图像中选择对应的微珠，进行初步的三维关联。类似地，增加更多微珠参与配准，以检验关联的准确性。通过检查在荧光和离子束图像中均可明确识别的定位标记微珠的预测位置与实际位置，排除部分微珠。在三维CT中，可查看均方根误差（RMSE）值以评估相关性的一致性。确保RMSE值较小，且处于定位精度的数量级范围内。接下来，选择目标细胞信号，并在FLM图像序列中拟合其三维位置，然后应用变换以预测在离子束视图中的目标位置。对于每个相关联的方格，将目标特征的预测位置传递至FIB-SEM仪器，以确定薄片铣削图案的位置。若每个细胞存在多个信号，则应布置图案以在同一薄片中包含尽可能多的兴趣点。先对 lamella 进行粗切，然后进行精细切削，以获得 150 至 250 纳米的最终厚度。将载网装入透射电子显微镜时，确保 lamella 的取向与倾斜轴垂直。对每个含有 lamella 的载网方格采集网格拼接图像和概览图像，选择合适的放大倍数和曝光时间，以便在 TEM 图像中清晰显示标志微珠，同时不显著增加总的电子剂量。获取每块薄片的高分辨率透射电子显微镜（TEM）图像。将荧光显微镜（FLM）图像序列与TEM网格方格及薄片的概览图像在三维电子计算机断层扫描（3D CT）中进行配准和三维-二维关联。在透射电镜中，从低倍到高倍逐步完成荧光显微镜与透射电镜的关联。转移位置后，在已关联的位置设置并运行倾斜序列，然后采用适当的放大倍数、离焦量和总剂量，以由薄片确定的预倾斜角度开始图像采集，倾斜方案采用剂量对称模式。可选择手动或批量采集图像。在代表性分析中，通过低倍透射电子显微镜（TEM）对切削位点进行整体观察，以定位感兴趣的生物学特征。随后，将高倍放大图像与荧光显微镜（FLM）的最大强度投影图像进行关联，并据此设定断层扫描图像的采集位置。在获取的图像中，可以在其天然环境中观察到内吞蛋白沉积物。样品的优化非常关键。应优化载网制备，以实现细胞在研磨区域的良好分布，并在大多数载网方格中看到足够数量且清晰可见的定位标记微珠。三维相关性切片技术有助于揭示不同细胞过程的超微结构，例如每个细胞中自噬的逐步进展，并可用于捕获一种新型的相分离区室。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过 3D 相关聚焦离子束铣削制备样品，用于高分辨率冷冻电子断层扫描

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我们提出了一种用于大分子高分辨率结构研究的冷冻生物样品冷冻聚焦离子束微加工薄片制备方案 原位 使用冷冻电子断层扫描技术。本方案提供了制备高质量、高重复性薄片的指南，用于对细胞内大分子的结构进行表征 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）.

样品制备与冷冻聚焦离子束微加工 酿酒酵母 用于冷冻电子断层扫描

低温电子断层扫描中对大规模数据采集日益增长的需求，要求具备高通量的成像采集流程。本文所述方案实现了先进的采集策略的最新进展，旨在最大限度地提高断层扫描数据采集的时间效率和通量。...

冷冻电子断层扫描数据采集优化策略

本实验方案描述了使用 Tomo5 进行高分辨率冷冻电子断层扫描远程数据采集，以及使用 emClarity 进行后续数据处理和子断层平均化的方法。以脱铁铁蛋白为例，详细展示了获得分辨率为 2.86 Å...

冷冻电子断层扫描远程数据采集与亚断层图像平均法

该工作流程利用低温三重共定位成像平台，能够针对尺寸微小（轴向尺寸&lt;1...

使用低温荧光、电子与离子束联用显微镜对细胞进行靶向切割的工作流程

本方案通过整合高压冷冻（HPF）与华夫格法、低温聚焦离子束（cryo-FIB）拾取技术以及剂量对称平行采集，实现了厚组织样品冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的标准化，可获得均一厚度的薄片和玻璃化样品，从而实现可重复的 原位...

厚组织冷冻电子断层成像工作流程在小鼠海马体中的应用

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