用于高分辨率冷冻电子断层扫描的三维关联聚焦离子束切片样品制备
2021年10月25日
本文介绍了一种用于引导冷冻电子断层成像样品制备的三维关联聚焦离子束切削技术流程。首先通过冷冻荧光显微镜确定荧光标记的目标蛋白的三维位置，随后对该位置进行聚焦离子束切削。该方案适用于哺乳动物细胞、酵母细胞和细菌细胞。
三维关联聚焦离子束（FIB）切片技术使得特定甚至稀有的细胞事件能够被低温透射电子显微镜（Cryo-TEM）观察到，从而可在天然环境中直接揭示这些事件的超微结构。该关联工作流程提高了在复杂细胞环境中精确定位稀有细胞结构的成功率，并有助于对其作出明确鉴定。
演示该实验步骤的将是相关冷冻电子断层扫描技术专家 Anna Bieber 和 Christina Capitanio。首先对接种细胞的载网进行冷冻荧光显微镜观察，通过在荧光和反射模式下获取宽视野概览图像开始实验，随后选择具有荧光信号的合适网格区域。
在确保细胞和微珠均匀分布在每个方格中心区域后，选择200目网格中既可被聚焦离子束-扫描电子显微镜（FIB-SEM）又可被透射电子显微镜（TEM）访问的方格，并且所选方格应距离网格边缘至少三个方格以上。在每个选定的网格方格上，使用适当的聚焦步长采集荧光图像序列。应使用高数值孔径物镜以提高光子计数和定位精度。
使用数值孔径为0.9的物镜，在共聚焦显微镜上以300纳米的步长采集图像堆栈，并对奈奎斯特采样频率进行过采样。记录多色图像堆栈，并将载网置于液氮中保存，直至后续使用。可使用载网上的切口或取向标记，以确保其在后续放入透射电子显微镜时的正确方位。
将载网装入冷冻聚焦离子束-扫描电子显微镜（cryo FIB-SEM）仪器中。确保铣削方向与透射电子显微镜（TEM）的倾斜轴垂直。使用等离子体镀膜仪和气体注入系统，在FIB-SEM系统预设的样品台位置对载网进行保护性有机金属层镀覆。
接下来，记录扫描电镜（SEM）网格的概览图像，并与荧光显微镜（FLM）概览图像进行二维关联。通过手动检查所记录的网格概览图像或使用软件包来确定网格方格。在 FLM 和 SEM 网格概览图中选择并标记四个对应的方格位置，并计算标记点之间的变换关系，以实现 FLM 与 SEM 图像的关联配准。
然后，将标记物置于已采集 FLM 图像堆栈的相应网格方格中心，以预测其在 SEM 视图中的位置。对于每个关联的网格方格，选择合适的 FIB 刻蚀角度，用低束流离子束成像，并选取与荧光数据匹配的视野位置和放大倍数。对于 200 目网格，采集包含单个网格方格（包括网格条）的 FIB-SEM 数据。
然后，对同一区域拍摄扫描电镜（SEM）图像，以帮助在荧光图像和离子束图像中识别对应的微珠。使用三维相关分析工具 3D CT，将原始或去卷积后的三维荧光显微镜（FLM）图像序列与每个位置的二维离子束图像进行配准。在荧光数据中，选择四个标记微珠，右键点击位置列表，通过信号在 X、Y 和 Z 方向的高斯拟合确定微珠的三维坐标。随后，在离子束图像中选择对应的微珠，进行初步的三维关联。类似地，增加更多微珠参与配准，以检验关联的准确性。
通过检查在荧光和离子束图像中均可明确识别的定位标记微珠的预测位置与实际位置，排除部分微珠。在三维CT中，可查看均方根误差（RMSE）值以评估相关性的一致性。确保RMSE值较小，且处于定位精度的数量级范围内。
接下来，选择目标细胞信号，并在FLM图像序列中拟合其三维位置，然后应用变换以预测在离子束视图中的目标位置。对于每个相关联的方格，将目标特征的预测位置传递至FIB-SEM仪器，以确定薄片铣削图案的位置。若每个细胞存在多个信号，则应布置图案以在同一薄片中包含尽可能多的兴趣点。
先对 lamella 进行粗切，然后进行精细切削，以获得 150 至 250 纳米的最终厚度。将载网装入透射电子显微镜时，确保 lamella 的取向与倾斜轴垂直。对每个含有 lamella 的载网方格采集网格拼接图像和概览图像，选择合适的放大倍数和曝光时间，以便在 TEM 图像中清晰显示标志微珠，同时不显著增加总的电子剂量。
获取每块薄片的高分辨率透射电子显微镜（TEM）图像。将荧光显微镜（FLM）图像序列与TEM网格方格及薄片的概览图像在三维电子计算机断层扫描（3D CT）中进行配准和三维-二维关联。在透射电镜中，从低倍到高倍逐步完成荧光显微镜与透射电镜的关联。转移位置后，在已关联的位置设置并运行倾斜序列，然后采用适当的放大倍数、离焦量和总剂量，以由薄片确定的预倾斜角度开始图像采集，倾斜方案采用剂量对称模式。
可选择手动或批量采集图像。在代表性分析中，通过低倍透射电子显微镜（TEM）对切削位点进行整体观察，以定位感兴趣的生物学特征。随后，将高倍放大图像与荧光显微镜（FLM）的最大强度投影图像进行关联，并据此设定断层扫描图像的采集位置。
在获取的图像中，可以在其天然环境中观察到内吞蛋白沉积物。样品的优化非常关键。应优化载网制备，以实现细胞在研磨区域的良好分布，并在大多数载网方格中看到足够数量且清晰可见的定位标记微珠。
三维相关性切片技术有助于揭示不同细胞过程的超微结构，例如每个细胞中自噬的逐步进展，并可用于捕获一种新型的相分离区室。
概述
本研究提出了一种用于三维关联聚焦离子束（FIB）切片的实验方案，旨在为冷冻电子断层扫描（cryo-TEM）制备细胞样品。该方法通过使用冷冻荧光显微镜确定在哺乳动物、酵母和细菌细胞中荧光标记蛋白的三维位置，从而增强在天然细胞环境中超微结构细节的成像能力。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞生物学
- 显微镜与成像技术
- 三维关联分析
背景
- 原位观察细胞结构的重要性。
- 识别稀有细胞结构所面临的挑战。
- 显微镜技术的进步对三维可视化的促进作用。
使用的方法
- 三维相关聚焦离子束刻蚀。
- 哺乳动物、酵母和细菌细胞。
- 冷冻荧光成像与冷冻电子断层扫描。
主要结果
- 对稀有细胞结构的更精准靶向。
- 清晰呈现细胞过程的超微结构。
- 通过多种细胞样本验证了该方法的成功应用。
结论
- 该方案通过精确成像有效增强了对细胞过程的理解。
- 它代表了生物研究中成像与结构分析技术的重要进步。
常见问题
行业重要性概述
3D相关联的聚焦离子束（FIB）切片技术能够精确定位稀有细胞事件，从而实现高分辨率的冷冻电子断层扫描（cryo-ET），解决了结构生物学中药物靶点验证的关键瓶颈问题。该方法通过将荧光显微镜与FIB-SEM及冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）相结合，提高了在天然细胞环境中观察分子复合物的成功率，有助于在早期发现阶段进行机制层面的风险评估。这一能力增强了在与疾病相关的系统中评估治疗靶点及通路调控时的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在天然状态下可视化罕见细胞过程的超微结构细节，实现对治疗假设的探究。
- 操作价值：通过提供蛋白质定位及复合物形成的直接结构证据，减少靶点验证中的不确定性。
- 预测价值：通过清晰展示在疾病相关系统中靶点结合与通路调控情况，支持研发管线的优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：制备经过验证的生物系统，该系统具有特定位置的薄片，可用于后续的冷冻电子断层扫描分析，从而实现可靠的结构筛选。
- 可重复性：利用标记微珠和三维关联工具箱实现低均方根误差（RMSE）值，确保荧光、离子束和透射电子显微镜数据集之间的精确配准。
- 可扩展性：通过优化薄片切割模式以包含最大数量的兴趣区域，支持单个细胞内的多种信号检测，提高靶向筛选的通量。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过捕捉自噬进程和相分离区室等细胞过程的天然超微结构，架起从发现到临床前验证的桥梁。
- 机制性风险降低：直接在原位可视化内吞蛋白沉积物及其他稀有事件，减少对间接检测方法的依赖。
- 基于风险评估的推进：通过直接观察靶标在拥挤细胞环境中的行为，支持做出继续或终止项目的决策。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点假设验证到先导物发现直至临床前验证的整个发现流程，提供有助于确立早期生物学可信度的结构信息。
- 发现生物学：通过冷冻荧光显微镜识别荧光标记的目标，并实现其精确定位与切削，支持假设验证。
- 筛选：提供可直接用于检测的薄片，厚度可控（150–250 nm），且方向垂直于透射电子显微镜（TEM）倾斜轴，确保数据质量的一致性。
- 分析：生成高分辨率TEM图谱和倾转系列数据，使研究团队能够比较不同条件或扰动下的结构状态。
- 转化研究：通过保持细胞的天然环境，与临床前研究相衔接，实现与生物标志物匹配的结构验证。
- 企业级复用：建立可重复使用的关联工作流程，适用于哺乳动物、酵母及细菌系统，支持广泛的靶点验证工作。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接可视化天然冷冻水合状态下的超微结构细节，提供具有预测置信度的信息。
- 操作价值：通过三维关联、标志微珠配准以及基于均方根误差（RMSE）的准确性评估，确保标准化与可重复性。
- 战略价值：通过提高对稀有事件的靶向成功率，减少在低产出筛选中的无效投入，从而提升资本使用效率。
- 项目组合影响：通过提供关于靶标行为和复杂组装的明确结构数据，支持经风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备冷冻荧光显微镜、聚焦离子束-扫描电镜（FIB-SEM）操作以及三维关联软件方面的专业知识，以实现准确的数据配准。
- 依赖于冷冻FIB-SEM仪器、等离子体镀膜系统以及高数值孔径物镜，以实现高效的光子荧光成像。
- 需要成像团队与结构生物学团队之间进行跨团队标准化，以确保不同模态间的关联准确性。
- 需根据不同的细胞类型和载网几何形状，调整标记微球的密度和载网方格的选择，以确保可靠的靶向定位。
- 实际限制包括需要优化载网制备过程，使细胞和微球分布均匀，以最大化可用的切削位点。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Cryo-Fluorescence Light Microscopy (Cryo-FLM) of Plunge‐Frozen Grids with Cells
1:51
Focused Ion Beam (FIB) Milling
5:47
Correlative Transmission Electron Microscopy (TEM)
7:02
Results: Visualizing the Endocytic Protein Deposit in the Cell with Cryo‐ET
7:38
Conclusion
