研究辅助供氧对囊性纤维化气道微生物组影响的模型的设计与开发
August 3rd, 2021
该协议的目标是开发一个模型系统，用于高氧对囊性纤维化气道微生物群落的影响。 人工痰培养基模拟痰液的组成，高氧培养条件模拟了辅助氧气对肺微生物群落的影响。
这些方案旨在模拟补充氧气使用对囊性纤维化患者肺部微生物组的体外影响。该培养基配方旨在反映囊性纤维化患者的痰液的生理组成。喷射过程引入了在不同氧气条件下培养的能力。
人造痰培养基的改变使其能够模仿其他慢性肺部疾病，并在其他条件下模拟微生物群落，例如并发囊性纤维化和糖尿病患者中的不同葡萄糖浓度。人工痰培养基制备步骤的概述显示了制备的ASCM，ASMM和ASBM的混合。拖把缓冲液用于将pH滴定至6.3，并在轨道振荡器上的冷室中对介质进行过滤器灭菌。
首先，通过将250毫升ASCM添加到含有ASMM的一升瓶中来制备人造痰培养基。然后将250毫升ASBM加入中瓶中。使用基本的一摩尔拖把缓冲液滴定培养基，使其在pH纸上达到6.3的pH值。
将人造痰液冷藏在四摄氏度下直至过滤。然后开始过滤过程，将200毫升未经过滤的人造痰液转移到带有0.22微米孔径过滤器的真空过滤系统中。将过滤系统连接到真空泵后，打开真空泵，然后将腔室放在轨道式振动器上，在四摄氏度的冷室中以每分钟90次旋转的速度振荡。
在过滤350毫升介质后更换过滤器，以克服堵塞问题。经过相当量的过滤后，在额外的150毫升介质中进行过滤。用额外的腔室重复过滤，直到所有介质都被过滤掉。
氧气喷射概述，显示将患者痰液加入高压灭菌血清瓶中的人工痰液培养基中。然后用气体混合物喷洒密封的血清瓶。最后，将血清瓶孵育以获得培养物Alec Watts，间隔24小时，以进行随后的元基因组学测序。
要开始血清瓶培养，请在500毫升高压灭菌的血清瓶上标记样品标识符，接种日期和时间以及目标氧百分比。在生物罩中，向每个正在设置的血清瓶中加入24毫升人造痰液培养基。为了获得适合每种培养条件的足够样品体积，如有必要，用无菌磷酸盐缓冲盐水稀释样品，然后用18号针头匀浆痰，并向每个血清瓶中加入一毫升患者痰液。
接下来，使用无菌镊子，将高压灭菌的橡胶塞放在每个血清瓶的顶部，按下橡胶塞而不接触塞子的底部。从抽油烟机上取下瓶子后，应用并压接铝封条。取下密封件的中心，用酒精擦拭布擦拭瓶子的顶部，然后将瓶子密封件通过本生燃烧器火焰。
现在，将无菌的18号针头固定在带有过滤器的柱塞式注射器上，首先将贴有的气体释放注射器插入瓶中。现在，将无菌的18号针固定在系统的气体输出端，并将气体输出针插入瓶中。将 T 形结从储罐通过氧气监测仪。
在验证流经系统的目标氧气浓度后，目标每分钟大约五升气体流量。将 T 形结从储罐重新路由到气体输出。当气体开始流过血清瓶时，请密切注意压力表，如果压力意外增加，请立即关闭系统。
运行后，氧气以每分钟5升的速度在血清瓶中喷射一分钟，设置允许10次空气交换，并确保内部气氛达到所需的100%氧气浓度。取出气体释放，18号针。在让血清瓶中的压力积聚到一个大气压后，立即取出气体输出针。
将血清瓶在37摄氏度的培养箱振荡器中以每分钟150次旋转的速度孵育，间隔3，24小时。每隔 24 小时采集一次 Alec Watts 进行下游分析，每次都重新分配样本。这里的例子显示了培养物在孵化前后的样子。
在培养过程中测量了保持37摄氏度的痰液样品的流出氧和pH值。在12小时和24小时的喷射间隔下，氧气浓度随着时间的推移大致保持，在所有三种情况下观察到氧气浓度的适度下降。测量的pH值在生理范围内，随时间没有显着变化。
未培养痰液和培养痰液中微生物负荷、多样性和群落组成的比较显示，培养痰液中微生物负荷增加了20倍。多样性指标表明，社区组成得以保存，而文化过程引入的全球差异最小。通过元基因组测序对培养和未培养痰液中的120种微生物物种进行了比较分析。
在未培养和养殖的样本中鉴定出46个这些物种。35只在未培养的样本中被专门鉴定，39只在培养的样本中被专门鉴定。对于在正常21%氧浓度下从患者样本分离物中培养的人造痰液培养的常见CF肺病原体，生成基于吸收剂的生长曲线。
ASM中600纳米处的光密度没有随时间变化，只有阴性对照表明无污染培养物。观察到的典型生长曲线模式表明ASM培养基可用于使用光学方法生成生长曲线。宏基因组测序在这里用于描述微生物群落组成。
其他技术，如元转录组学测序可用于评估基因表达或代谢组学以评估代谢物的产生。
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概述
本协议概述了一个模型系统，用于研究高氧对囊性纤维化气道微生物群落的影响。它利用人工痰培养基来复制痰液组成，并在高氧条件下模拟补充氧对肺部微生物群的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 呼吸健康
- 囊性纤维化研究
背景
- 囊性纤维化患者常常经历改变的肺部微生物群。
- 补充氧可以影响肺部微生物群。
- 人工痰培养基设计用于模仿囊性纤维化的生理条件。
- 了解这些相互作用可以为治疗策略提供信息。
研究目的
- 开发一个用于研究高氧对肺部微生物群影响的模型。
- 利用人工痰培养基培养微生物群落。
- 探索对囊性纤维化和其他慢性肺病的影响。
使用的方法
- 人工痰培养基（ASCM）的制备。
- 通过曝气引入不同的氧气条件。
- 使用mops缓冲液进行pH滴定，以达到最佳条件。
- 在受控环境中对培养基进行滤光灭菌。
主要结果
- 成功模拟高氧条件下的微生物群落。
- 证明了人工痰培养基适用于不同疾病。
- 确定了葡萄糖水平和微生物生长之间的潜在相互作用。
- 为未来关于肺部微生物群的研究提供了框架。
结论
- 该模型有效地模拟了补充氧对肺部微生物群的影响。
- 人工痰培养基可以修改以用于各种慢性肺病。
- 这项研究有助于理解囊性纤维化中的微生物动态。
常见问题
Executive Industry Relevance
Modeling the impact of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome addresses a critical gap in understanding how hyperoxic conditions influence microbial community dynamics. This capability enables predictive assessment of therapeutic interventions and supports risk-adjusted decisions in respiratory drug discovery pipelines. The approach enhances translational continuity by providing a physiologically relevant in vitro system for mechanistic de-risking and target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial community responses to oxygen modulation in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the effects of hyperoxia on pathogen and commensal populations.
- Facilitates functional target validation for interventions aimed at modulating airway microbiota.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized artificial sputum medium for reproducible microbial culture under controlled oxygen conditions.
- Enables quantitative growth curve generation for common cystic fibrosis pathogens using optical density measurements.
- Supports assay readiness for evaluating compound effects on microbial community composition and load.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with clinical airway microbiome profiles through metagenomic sequencing comparisons.
- Maintains translational relevance by preserving community diversity and composition under normoxic and hyperoxic conditions.
- Enables risk-adjusted advancement of microbiome-modulating therapies by modeling real-world supplemental oxygen exposure.
Pipeline & Workflow Integration
This model system integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven studies of oxygen effects on airway microbiota, supporting both early discovery and translational research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on oxygen-driven microbial shifts and their mechanistic implications.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for microbial growth and community analysis.
- Analytics: Provides metagenomic and optical density readouts for robust condition comparisons.
- Translational Research: Bridges in vitro and clinical microbiome data for biomarker alignment and validation.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to other chronic lung disease models and metabolic conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbiome-targeted interventions and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes microbial culture conditions and supports scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for respiratory portfolio assets by modeling clinically relevant oxygen exposures.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbiome-modulating candidates and supports cross-program data integration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culture, metagenomics, and respiratory disease modeling.
- Needs access to controlled gas sparging systems, incubator shakers, and sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of artificial sputum medium preparation and oxygen modulation protocols.
- Adaptable to model other chronic lung diseases or metabolic comorbidities by modifying medium composition.
- Limitations include the need for careful oxygen and pH monitoring to maintain physiological relevance.
