Name: 研究辅助供氧对囊性纤维化气道微生物组影响的模型的设计与开发 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 了解辅助供氧对囊性纤维化气道微生物组影响的体外模型设计与开发方法。该方案利用人工痰液培养基模拟生理环境，通过气体置换技术实现不同氧浓度培养条件。

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部分工作在海洋生物学实验室完成，得到了海洋生物学实验室、美国能源部（DE-SC0016127）、美国国家科学基金会（MCB1822263）、霍华德·休斯医学研究所（资助号 5600373）以及西蒙斯基金会捐赠的支持。

本研究获得了 Partners 机构审查委员会的批准（方案编号：2018P002934）。纳入标准包括提供书面知情同意书的成年囊性纤维化患者。无排除标准。根据方案指南，所有痰液样本均在囊性纤维化患者与其临床医生预约的门诊就诊期间采集。
1. 人工痰液培养基的制备
注意：此处列出的用量适用于制备 1 L 最终人工痰液培养基，并假设使用材料表中列出的特定试剂。若制备其他体积或使用不同试剂，必须相应调整用量，以确保获得相同的最终产物。目标浓度详见表 1。
<ol>
	<li>人工痰液化学混合物（ASCM） 
	注意：ASCM 占最终培养基总体积的 25%。该成分性质稳定，可批量或预先配制。若需后续使用，应将化学混合物进行高压灭菌，并在室温下安全保存。
	<ol>
		<li>混合各化学储备溶液。
		<ol>
			<li>配制1 M NaCl储备液：每升无菌水中加入58.44 g NaCl。</li>
			<li>配制1 M KCl储备液：每升无菌水中加入74.55 g KCl。</li>
			<li>制备 1 M MgSO₄4 储备液：加入 246.47 g MgSO₄4·7H2每升无菌水中加入 120.37 克无水 MgSO₄。</li>
			<li>配制1 M葡萄糖储备液：每升无菌水中加入180.16 g葡萄糖。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对化学储备液以及一个空的250 mL瓶进行高压灭菌。高压灭菌条件至少达到标准值：121 °C、15 PSI，持续30分钟。</li>
		<li>向一个空的 250 mL 瓶中加入 80.59 mL 无菌水。</li>
		<li>加入 152.30 mL 的 1 M NaCl 储备液至混合物中。</li>
		<li>加入15.8 mL的1 M KCl储备液至混合液中。</li>
		<li>加入 610 µL 1 M MgSO₄4 将储备液加入混合物中。</li>
		<li>加入700 µL的1 M葡萄糖储备液至混合液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人工痰液黏蛋白混合物（ASMM） 
	注意：ASMM 占最终培养基体积的 50%。请确保 ASMM 与最终批次的培养基在同一天配制。
	<ol>
		<li>向一个空的1 L瓶中加入450 mL无菌水。</li>
		<li>加入50 mL 10倍浓缩磷酸盐缓冲液（PBS）至瓶中。</li>
		<li>向瓶中加入一个一次性磁力搅拌子。</li>
		<li>高压灭菌含有 PBS 的瓶子和搅拌子。</li>
		<li>称取10 g黏蛋白粉末，加入PBS中。</li>
		<li>剧烈振荡瓶子以进行初步混匀。</li>
		<li>将瓶子置于带有磁力搅拌器的加热板上。将温度调至中高，目标温度为 50 °C，搅拌速度设为 1100 rpm。逐渐提高转速，以防止搅拌子脱离磁铁飞出。
		<ol>
			<li>加热并搅拌15分钟。</li>
			<li>戴上耐热手套拿起瓶子。观察溶液中是否有黏蛋白粉末析出。</li>
			<li>如果黏蛋白粉末未完全溶解，将瓶子放回加热/搅拌器中，每次加热5分钟，直至完全溶解。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>让黏蛋白混合物冷却至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人工痰液生物混合物（ASBM） 
	&#8203;注意：ASBM 占最终培养基体积的 25%。需在配制最终培养基的当天制备，且与其他混合液不同，其组分不得接触任何热源。
	<ol>
		<li>在4 °C冰箱或冰上解冻100x维生素储备液。 
		&#8203;注意：将维生素母液预先分装成每份10 mL，以减少冻融循环次数。</li>
		<li>向已灭菌的250 mL空瓶中加入124.24 mL无菌水。</li>
		<li>加入 25.76 mL 的 50 倍必需氨基酸储备液至混合液中。</li>
		<li>向混合物中加入 80.14 mL 的 100 倍非必需氨基酸储备液。</li>
		<li>加入10 mL（已解冻的）100倍维生素母液至混合液中。</li>
		<li>加入1 mL 1000倍微量金属储备液至混合液中。</li>
		<li>加入8.33 mL的30%蛋黄乳剂至混合物中。</li>
		<li>加入 400 µL 浓度为 10 g/L 的铁蛋白储备液。</li>
		<li>通过手动振荡充分混匀溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人工痰液培养基（ASM）
	<ol>
		<li>向装有ASMM的1 L瓶中加入250 mL ASCM。</li>
		<li>向培养基瓶中加入 250 mL ASBM。</li>
		<li>用碱性 MOPS 缓冲液（1 M）滴定培养基，使窄范围 pH 试纸显示 pH 值达到 6.3。滴定前，培养基混合液酸性过强。</li>
		<li>将制备好的人工痰液培养基置于4 °C冰箱中冷藏，直至准备进行过滤。</li>
		<li>开始过滤过程时，将200 mL未过滤的人工痰液培养基转移至装有0.22 µm孔径滤膜的真空过滤系统中。</li>
		<li>将过滤系统连接至真空泵，开启真空泵并调节至70 mbar，然后将滤室置于4 °C冷室中的轨道摇床上，以90 rpm振荡。
		<ol>
			<li>补充额外的150 mL培养基，因为会有相当量的培养基被过滤。完全过滤1 L培养基需要1–2天。</li>
			<li>用额外的滤器重复操作，直至所有培养基过滤完毕。 
			注意：请勿通过同一个0.22 µm滤器过滤超过350 mL的培养基，因为黏蛋白会随时间推移堵塞滤器。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将过滤后的人工痰液培养基置于4 °C冰箱中冷藏，直至使用。为获得最佳效果，建议在配制后一个月内使用该培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 氧气鼓泡
<ol>
	<li>曝气装置设置 
	注意：该方案通常只需完整执行一次，之后可根据需要通过简单的维护保持装置运行。有关氧气曝气系统的示意图，请参见图1。
	<ol>
		<li>获取压缩空气和氧气钢瓶，并妥善固定。 
		警告：钢瓶在高压下若操作不当极为危险。确保钢瓶完全密封并牢固固定，关闭时无泄漏，并且所有操作人员均已接受充分的使用培训。</li>
		<li>使用扳手将空气减压阀连接至压缩空气钢瓶。为在减压阀上获得最佳流量读数，应尽可能将减压阀以直立位置安装。</li>
		<li>将氧气减压阀连接至压缩氧气钢瓶，同样尽可能以接近直立的位置安装。根据氧气钢瓶类型，可能需要反向旋转以拧紧。</li>
		<li>将来自两个减压阀的管路连接至一个Y型接头，以合并两路气体流。</li>
		<li>将Y型接头的输出端连接至中心T型三通阀。</li>
		<li>将中心T型三通阀的一侧连接至气体压力表。</li>
		<li>将气体压力表的另一侧连接至一个直径为25 mm、孔径为0.22 µm的无菌注射器滤器。</li>
		<li>将第二个直径为25 mm的注射器滤器连接至一个无活塞的注射器上，用于曝气过程中的气体释放。</li>
		<li>将中心T型三通阀的最后一个端口连接至第二个T型三通阀，用于氧气监测。</li>
		<li>将一个直径为25 mm的注射器滤器连接至该第二个T型三通阀的一侧，并连接管路以安装18 G针头。</li>
		<li>将第二个T型三通阀的最后一个端口连接至氧气监测装置。</li>
		<li>将一段截断的管路连接至氧气监测装置的另一侧，作为监测过程中的气体释放口。 
		警告：在测试或使用氧气曝气系统时，务必仔细检查T型三通阀的位置，确保其与系统预期气路一致。否则将导致系统内压力积聚，造成组件失效甚至分离。</li>
		<li>为维护系统并保持其最佳性能，建议采取以下措施：
		<ol>
			<li>在连接处充分使用聚四氟乙烯胶带（如特氟龙胶带），可显著增强密封性，降低因内部压力导致组件松脱的风险。</li>
			<li>将总气体流速控制在10 L/min以下，以降低最大压力，防止系统故障。</li>
			<li>若怀疑存在泄漏，可使用洗涤剂溶液（如市售液体检漏剂）快速定位泄漏点，泄漏处会产生气泡。使用聚四氟乙烯胶带（如特氟龙胶带）封堵泄漏。</li>
			<li>每两周更换一次氧气曝气系统中直径为25 mm的注射器滤器，具体频率视使用情况而定。随着时间推移，滤器中截留的颗粒会降低气体流速并引起压力积聚。</li>
			<li>在进行测量前，使用含21%氧气的压缩空气对氧气监测仪进行校准。</li>
			<li>系统使用完毕后，关闭钢瓶阀门，并从减压阀释放残余气体，直至气流完全停止。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血清瓶培养物的曝气
	<ol>
		<li>用样本编号、接种日期/时间及目标氧气浓度标记500 mL已灭菌的血清瓶。</li>
		<li>在生物安全柜中，向每个待用的血清瓶中加入24 mL人工痰液培养基。</li>
		<li>使用18 G针头将1 mL患者痰液匀浆（如样本量不足，可用无菌生理盐水稀释）加入每个血清瓶中。</li>
		<li>使用无菌镊子将已灭菌的橡胶塞盖在每个血清瓶口上。</li>
		<li>压紧橡胶塞，注意不要用手接触塞子的底面。</li>
		<li>将瓶子移出生物安全柜，套上铝盖并压紧封口，然后移除铝盖中心部分。</li>
		<li>用酒精棉片擦拭瓶口，并通过本生灯火焰灼烧灭菌。</li>
		<li>将带有滤器的无活塞注射器连接一根无菌18 G针头，作为气体释放装置，先将其插入瓶中。</li>
		<li>将另一根无菌18 G针头连接至系统气体输出端，并同时插入血清瓶中。</li>
		<li>将来自钢瓶的T型三通阀气路切换至氧气监测仪，确认系统中流动的气体达到目标氧气浓度。目标气体流速约为5 L/min。</li>
		<li>将来自钢瓶的T型三通阀气路重新切换至气体输出端，气体开始流入血清瓶。 
		警告：在氧气曝气过程中，请密切注意压力表。若压力异常升高，应立即关闭系统。</li>
		<li>以5 L/min流速向血清瓶曝气1分钟，可实现约10次空气置换，确保瓶内气氛达到目标分压。</li>
		<li>移除用于气体释放的18 G针头。</li>
		<li>使血清瓶内压力升至+1个大气压（海平面为2个大气压），然后立即移除气体输出针头。 
		注意：维持正压有助于长期保持高氧环境。</li>
		<li>将血清瓶置于37 °C、150 RPM的摇床培养箱中，连续培养72小时，每24小时取样一次用于后续分析，取样后重新曝气并放回培养，共完成三个24小时周期。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>出口气体氧气浓度测定
	<ol>
		<li>使用含21%氧气的压缩空气校准氧浓度仪，然后关闭气源。</li>
		<li>将血清瓶的进气管路接入氧气监测仪，并在末端连接一根无菌针头。</li>
		<li>将针头穿过橡胶塞插入血清瓶内。</li>
		<li>等待出口气体读数稳定。由于血清瓶出气流速较低，可能需要长达2分钟。记录相对于室内空气的最大偏差值（即与21%相差最远的数值）。</li>
		<li>若需进行多次测量，每次测量之间应用压缩空气冲洗系统。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

在本研究中，一个 体外 该模型基于人工痰液培养基和每日对血清瓶进行通气处理，旨在研究高氧环境对肺部微生物群落的影响。该模型可维持较高的氧气浓度，并支持囊性纤维化患者痰液中鉴定出的微生物生长。
该方法包含若干关键步骤。首先是选择使用过滤除菌而非加热灭菌来处理人工痰液培养基。过滤除菌可防止黏蛋白及其他对热敏感的培养基成分发生变性，从而获得澄清的培养基，适用于微生物生长的光学测定。尽管其他方案中也曾提出采用过滤除菌10，但我们发现，在过滤过程中加入轨道振荡对于防止滤膜堵塞至关重要；若未采取此措施，即使仅过滤少量配制好的培养基也会导致滤膜堵塞。虽然由于黏蛋白在滤膜上的滞留，过滤后的人工痰液培养基中黏蛋白终浓度可能低于预期值，但已有研究表明，囊性纤维化患者（pwCF）的痰液中黏蛋白浓度低于非囊性纤维化人群21。本方案中采用的起始黏蛋白浓度为1%，高于其他使用过滤除菌方法的方案——例如有研究使用0.5%的起始浓度10，而常规配方中黏蛋...

囊性纤维化（CF）是一种遗传性疾病，其特征是无法清除肺部的浓稠黏液，导致反复感染和肺功能进行性下降，常常需要进行肺移植或导致死亡。囊性纤维化患者（pwCF）的呼吸道微生物组似乎与疾病活动性相关1，微生物多样性降低与不良的长期预后相关2,3。在针对pwCF的临床研究中，补充氧疗与更严重的疾病进展相关4,5，尽管传统上，氧疗的使用仅被视为疾病严重程度的一个标志6。最近一项针对呼吸衰竭患者的临床试验研究表明，患者较高的氧水平反而与严重细菌感染增加和死亡率升高相关7，提示补充氧气可能参与了疾病的发病机制。然而，补充氧气对囊性纤维化患者肺部微生物组以及相关肺和呼吸道微生物群的影响尚未得到充分研究。
由于干预措施可能存在未知的医学益处或风险，相关的后勤困难和潜在伦理问题使得机制研究通常无法直接在人体受试者上进行。在这些情况下，将人类生物样本整合到模型系统中的转化研究方法可提供重要的生物学见解。尽管利用或耐受氧气的能力传统上是微生物分类的重要组成部分，但关于向环境中治疗性引入额外氧气如何影响呼吸道微生物群落，目前所知甚少。为了阐明补充氧气对囊性纤维化患者（pwCF）呼吸道微生物组的未知影响，我们需要解决两个主要挑战：第一，构建一种在生理上近似囊性纤维化痰液成分的培养基；第二，建立一个能够在长时间内维持培养环境中高氧浓度的模型系统。
人工痰液培养基（ASM）被广泛用于在体外模拟肺部分泌的痰液ex vivo8,9,10，但目前尚无针对特定配方的明确共识。本实验方案描述了一种精心设计的人工痰液培养基配方及其制备方法，旨在生理上近似囊性纤维化患者（pwCF）的痰液。表1列出了基于已发表文献所选定的配方参数。基础化学成分和pH值均参照人类囊性纤维化痰液相关研究中确定的数值11,12,13。采用蛋黄作为低浓度生理营养物来源，添加量为终体积的0.25%10，同时加入维生素和微量元素混合物14,15。黏蛋白是痰液的关键组分16，其浓度设定为1% w/v14。尽管过滤除菌比常规的热力灭菌更为耗时，但为避免加热导致培养基关键成分发生变性，仍选择过滤除菌方式10。过滤除菌的另一优势在于可获得透明的培养基（热力灭菌可能因盐类和蛋白质沉淀或凝固而产生浑浊），从而使该人工痰液培养基可用于通过浊度变化来监测微生物生长情况。
该高氧培养模型系统基于厌氧培养技术，通过向系统中添加氧气而非去除氧气，从而建立一个用于模拟囊性纤维化患者（pwCF）补充氧气治疗效应的模型。图1 及相关的氧气鼓泡方案概述了氧气鼓泡系统的各个组成部分，这些组件可从普通实验室和医院供应商处以较低成本获得。该系统能够将压缩氧气与空气按固定比例混合，获得氧浓度范围为21%–100%的混合气体。通过集成氧气传感器，可验证输出气体混合物的浓度，并检测先前已进行过鼓泡处理的血清瓶中流出气体的组成，以确认氧浓度条件始终维持在目标范围内。
本方案概述了制备人工痰液培养基的步骤、氧气鼓泡系统的构建与使用方法，以及在不同氧气条件下培养囊性纤维化（CF）痰液样本的综合应用。

<table><tbody><tr><td>BME 维生素（100 倍浓缩液）溶液</td><td>MilliporeSigma</td><td>B6891</td><td>补充维生素的浓缩溶液。</td></tr><tr><td>压盖器，30 mm</td><td>DWK Life Sciences</td><td>224307</td><td>用于将铝盖密封至血清瓶的压盖工具。</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7021</td><td>固体葡萄糖粉末（右旋异构体）。</td></tr><tr><td>隔膜泵 ME 2 NT</td><td>VACUUBRAND</td><td>20730003</td><td>用于真空过滤的真空泵。</td></tr><tr><td>卵黄乳液</td><td>HiMedia</td><td>FD045</td><td>30% 卵黄在生理盐水中的无菌乳液。</td></tr><tr><td>阳离子化马脾铁蛋白</td><td>MilliporeSigma</td><td>F7879</td><td>铁蛋白（铁储存蛋白）溶液。</td></tr><tr><td>FIREBOY plus 安全本生灯</td><td>Integra Biosciences</td><td>144000</td><td>带用户界面和安全功能的本生灯。</td></tr><tr><td>Hydrion pH 试纸（1.0&amp;ndash;14.0）</td><td>Micro Essential Laboratory</td><td>94</td><td>用于 1.0&amp;ndash;14.0 范围的 pH 检测试纸。</td></tr><tr><td>Hydrion pH 试纸（4.0&amp;ndash;9.0）</td><td>Micro Essential Laboratory</td><td>55</td><td>用于 4.0&amp;ndash;9.0 范围的 pH 检测试纸。</td></tr><tr><td>Hydrion pH 试纸（6.0&amp;ndash;8.0）</td><td>Micro Essential Laboratory</td><td>345</td><td>用于 6.0&amp;ndash;8.0 范围的 pH 检测试纸。</td></tr><tr><td>带安全装置的皮下注射针头-Pro EDGE，18 G</td><td>Smiths Medical</td><td>401815</td><td>带安全帽的 18 G 针头。</td></tr><tr><td>在线压力表</td><td>MilliporeSigma</td><td>20469</td><td>用于监测瓶内气体压力的压力表。</td></tr><tr><td>Innova 42 恒温摇床</td><td>Eppendorf</td><td>2231000756</td><td>组合式恒温培养/轨道摇床。</td></tr><tr><td>带针头的鲁尔锁注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309580</td><td>3 mL 注射器与 18 G 针头组合。</td></tr><tr><td>鲁尔阀套装</td><td>World Precision Instruments</td><td>14011</td><td>用于气体管路的阀门。</td></tr><tr><td>LSE 轨道摇床</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6780-NP</td><td>过滤过程中用于振荡培养基的轨道摇床。</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2773</td><td>固体泻盐（七水合硫酸镁）。</td></tr><tr><td>医用单级空气减压阀带流量计</td><td>Western Enterprises</td><td>M1-346-15FM</td><td>带 15 L/min 流量计的空气流速调节器。</td></tr><tr><td>MEM 氨基酸（50 倍浓缩液）溶液</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5550</td><td>必需氨基酸的浓缩溶液。</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸（100 倍浓缩液）溶液</td><td>MilliporeSigma</td><td>M7145</td><td>非必需氨基酸的浓缩溶液。</td></tr><tr><td>Millex-GP 滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP25SS</td><td>0.22 &amp;micro;m 聚醚砜膜无菌注射式滤器。</td></tr><tr><td>Milli-Q Academic</td><td>MilliporeSigma</td><td>ZMQS60E01</td><td>Milli-Q 无菌水过滤系统。</td></tr><tr><td>MiniOX 3000 氧气监测仪</td><td>MSA</td><td>814365</td><td>气体流中氧气百分比监测仪。</td></tr><tr><td>MOPS 缓冲液（1 M，pH 9.0）</td><td>Boston BioProducts</td><td>BBM-90</td><td>用于调节培养基 pH 的 MOPS 缓冲液。</td></tr><tr><td>猪胃黏蛋白</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2378</td><td>黏蛋白（糖基化凝胶形成蛋白）粉末。</td></tr><tr><td>天然聚丙烯带倒钩接头套件</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-1413</td><td>用于气体管路的连接器。</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA 文库制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td>用于测序过程中样本鉴定的文库制备试剂盒。</td></tr><tr><td>NovaSeq 6000 测序系统</td><td>Illumina</td><td>770-2016-025-N</td><td>用于生成样本读长的鸟枪法测序平台。</td></tr><tr><td>单级氧气减压阀带流量计</td><td>Western Enterprises</td><td>M1-540-15FM</td><td>带 15 L/min 流量计的氧气流速调节器。</td></tr><tr><td>带两个标准接头的氧气管路</td><td>SunMed</td><td>2001-01</td><td>用于连接气体系统组件的管路。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，10 倍浓缩液，pH 7.4</td><td>Molecular Biologicals International</td><td>MRGF-6235</td><td>浓缩的磷酸盐缓冲盐水溶液。</td></tr><tr><td>PC 420 电热板/搅拌器</td><td>Marshall Scientific</td><td>CO-PC420</td><td>组合式电热板/搅拌器。</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>MilliporeSigma</td><td>P9541</td><td>固体氯化钾盐。</td></tr><tr><td>PTFE 一次性搅拌子</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-513-95</td><td>一次性磁力搅拌子。</td></tr><tr><td>PTFE 螺纹密封聚四氟乙烯胶带</td><td>VWR</td><td>470042-938</td><td>用于加强气体系统连接的聚四氟乙烯胶带。</td></tr><tr><td>Q-Gard 2 纯化滤芯</td><td>MilliporeSigma</td><td>QGARD00D2</td><td>Milli-Q 系统用纯化滤芯。</td></tr><tr><td>可重复使用培养基储存瓶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>06-423A</td><td>用于配制和储存培养基的瓶子。</td></tr><tr><td>橡胶塞，30 mm，灰色溴丁基</td><td>DWK Life Sciences</td><td>224100-331</td><td>用于血清瓶的橡胶塞。</td></tr><tr><td>带模制刻度的血清瓶，500 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>223952</td><td>用于密闭培养的玻璃血清瓶。</td></tr><tr><td>小口径延长管套装</td><td>Braun Medical</td><td>471960</td><td>带鲁尔锁接头的延长管。</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3014</td><td>固体氯化钠盐。</td></tr><tr><td>内参对照 I（高微生物载量）</td><td>ZymoBIOMICS</td><td>D6320</td><td>用于绝对微生物载量计算的内参微生物（I. halotolerans 和 A. halotolerans）</td></tr><tr><td>Stericup 快速释放无菌真空过滤系统</td><td>MilliporeSigma</td><td>S2GPU02RE</td><td>250 mL 0.22 &amp;micro;m 真空过滤腔室。</td></tr><tr><td>Super Sani-Cloth 杀菌型一次性擦拭巾</td><td>Professional Disposables International</td><td>H04082</td><td>用于灭菌的一次性杀菌擦拭巾。</td></tr><tr><td>微量元素混合液，1000 倍浓缩液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC0112668</td><td>生理浓度微量元素的浓缩溶液。</td></tr><tr><td>无衬铝盖密封，30 mm</td><td>DWK Life Sciences</td><td>224187-01</td><td>压接在橡胶塞顶部的铝盖密封件。</td></tr><tr><td>USP 医用级空气钢瓶</td><td>Airgas</td><td>AI USP200</td><td>用于鼓泡系统输入的压缩空气钢瓶。</td></tr><tr><td>USP 医用级氧气钢瓶</td><td>Airgas</td><td>OX USP200</td><td>用于鼓泡系统输入的压缩氧气钢瓶。</td></tr></tbody></table>

设计与开发用于研究补充氧气对囊性纤维化气道微生物组影响的模型

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

气道微生物群被认为在囊性纤维化（CF）及其他慢性肺部疾病的进展中发挥重要作用。传统上，微生物的分类依据是其利用或耐受氧气的能力。补充氧气是囊性纤维化患者（pwCF）常见的医疗干预手段；然而，目前关于氧气与气道微生物组的研究主要集中在缺氧（低氧）而非高氧（高氧）对以需氧菌和兼性厌氧菌为主的肺部微生物群落的影响。为弥补这一关键的知识空白，本实验方案采用一种人工痰液培养基，模拟来自囊性纤维化患者（pwCF）的痰液成分。通过滤膜除菌技术制备出透明培养基，使得光学方法可用于监测悬浮培养中单细胞微生物的生长情况。为建立高氧条件，该模型系统利用已建立的厌氧培养技术来研究高氧环境；与去除氧气相反，本方法通过每日向血清瓶中通入压缩氧气与空气的混合气体，向培养物中添加氧气。来自50名囊性纤维化患者（pwCF）的痰液样本接受了为期72小时的每日通气处理，以验证该模型维持不同氧浓度条件的能力。对来自11名囊性纤维化患者（pwCF）的培养与未培养痰液样本进行了宏基因组测序，以验证该培养基支持囊性纤维化痰液中常见共生菌和致病菌生长的能力。从112株从囊性纤维化患者（pwCF）分离的菌株中获得生长曲线，以验证该人工痰液培养基支持常见囊性纤维化病原体生长的能力。我们发现，该模型能够在囊性纤维化痰液中培养多种病原菌和共生菌，在常氧条件下恢复出与未培养痰液高度相似的微生物群落，并在不同氧浓度条件下产生不同的培养表型。这一新方法可能有助于更好地理解在囊性纤维化患者（pwCF）中使用氧气治疗对气道微生物群落及常见呼吸道病原体所产生的未预期影响。

这些方案应用于来自波士顿马萨诸塞州总医院（Massachusetts General Hospital）囊性纤维化门诊接受常规治疗的囊性纤维化患者（pwCF）所咳出的50份痰样本。每位患者的痰样本均使用人工痰液培养基，在21%、50%和100%氧气条件下进行培养，并在培养24小时、48小时和72小时时分别取0.5 mL等分试样用于检测。在取样时对培养物进行拍照，以追踪其视觉变化。此外，在培养前还预先采集了每份原始痰样本0.5 mL。这使得每位患者共获得10个独立样本，最终样本总数为500个。其中，来自11位患者的痰样本（11份未培养痰样，以及11份在21%氧气条件下培养48小时的培养后痰样）进行了核酸提取17，使用商用DNA文库构建试剂盒生成测序文库，并在全基因组测序平台上进行宏基因组测序，目标为每样本约5 Gb序列数据，采用150 bp双端测序。原始测序读长使用bioBakery工具套件进行处理18，包括质量控制、去除人源“污染”序列，以及利用MetaPhlAn3分析器进行物种分类谱型分析19...

本实验方案的目的是建立一个用于研究高氧对囊性纤维化气道微生物群落影响的模型系统。人工痰液培养基可模拟痰液的组成，而高氧培养条件则用于模拟补充氧气对肺部微生物群落的影响。

气道微生物群落被认为在囊性纤维化（CF）及其他慢性肺部疾病的进展中发挥重要作用。

这些实验方案旨在模拟补充氧气使用对囊性纤维化患者肺部微生物组的体外影响。该培养基配方经过优化，以模拟囊性纤维化患者痰液的生理组成。通气过程使得能够在不同氧浓度条件下进行培养。对人工痰液培养基进行调整可使其模拟其他慢性肺部疾病，并在不同条件下构建微生物群落模型，例如囊性纤维化合并糖尿病患者中不同的葡萄糖浓度。人工痰液培养基制备步骤概览显示了将制备好的 ASCM、ASMM 和 ASBM 混合的过程。使用 MOPS 缓冲液将 pH 值调节至 6.3，并在冷室中于旋转摇床上对培养基进行过滤除菌。首先，通过将250毫升ASCM加入含有ASMM的1升瓶中来制备人工痰液培养基。然后向培养基瓶中加入250毫升ASBM。用1摩尔的MOPS碱性缓冲液滴定培养基，使pH试纸显示pH值达到6.3。将人工痰液培养基在 4 摄氏度下冷藏，直至进行过滤。然后，将 200 毫升未过滤的人工痰液培养基转移至带有孔径为 0.22 微米滤膜的真空过滤系统，以开始过滤过程。将过滤系统连接至真空泵后，打开真空泵，随后将滤液收集室置于低温室（4 摄氏度）中的轨道摇床上，以每分钟 90 转的速度振荡。为避免堵塞问题，当过滤完350毫升培养基后更换滤器。过滤一定量后，额外再加入150毫升培养基进行过滤。重复使用额外的滤室进行过滤，直至所有培养基均完成过滤。氧气通气概述，演示将患者痰液加入灭菌血清瓶中的人工痰液培养基内，随后向密封的血清瓶中通入混合气体。最后，将血清瓶孵育，并在24小时时间点取培养物 Alec Watts 进行后续宏基因组测序。开始血清瓶培养的气体鼓泡前，用样本编号、接种日期和时间以及目标氧气百分比标记500毫升已灭菌的血清瓶。在生物安全柜中，向每个待用的血清瓶中加入24毫升人工痰液培养基。为获得每种培养条件下足够的样本体积，必要时可用无菌磷酸盐缓冲液稀释样本，再用18号针头将痰液匀浆化，然后向每个血清瓶中加入1毫升患者痰液样本。接下来，使用无菌镊子将已高压灭菌的橡胶塞放置在每个血清瓶的瓶口顶部，向下按压橡胶塞时避免触碰其底面。将瓶子移出超净工作台后，套上铝盖并进行压封。取下铝盖中心部分，用酒精棉片擦拭瓶口顶部，并将瓶口通过本生灯火焰灭菌。现在将一个无菌的18号针头连接到带有滤器的柱塞式注射器上，并先将连接好的排气注射器插入瓶中。接着，将另一个无菌的18号针头连接到系统的气体出口，并将该气体出口针头也插入瓶中。将来自气瓶的T型接头通过氧气监测仪进行布线。在确认流经系统的目标氧气浓度后，将气体流速调节至每分钟约五升。将三通接头从气瓶重新连接至气体输出端。当气体开始流经血清瓶时，需密切观察压力表，若压力出现异常升高，应立即关闭系统。运行后，以每分钟5升的流速向血清瓶中通入氧气1分钟，该设置可实现10次空气置换，确保瓶内气氛达到100%氧气的所需浓度。随后移除排气用的18号针头。待血清瓶内压力升至1个大气压后，立即拔除气体输出针头。将血清瓶置于37摄氏度摇床培养箱中，以每分钟150转的速度孵育，分别在3个24小时时间点进行。每次24小时时间点时取Alec Watts用于后续分析，并对样品重新通气。此处示例展示了培养物在孵育前后的可能形态。在37摄氏度条件下培养痰液样本的过程中，持续监测了流出液中的氧气和pH水平。无论是12小时还是24小时的通气间隔，三种条件下的氧气浓度均在时间过程中基本维持稳定，仅观察到氧气浓度出现适度下降。所测得的pH值均处于生理范围内，且随时间无显著变化。对未培养和培养痰液中的微生物载量、多样性和群落组成进行比较，结果显示培养痰液中的微生物载量增加了20倍。多样性指标表明，培养过程对群落组成具有较好的保留性，仅引入了轻微的整体差异。通过宏基因组测序对培养与未培养痰液中的120种微生物物种进行了比较分析。在未培养和已培养的样本中均鉴定出其中46个物种。而有35个物种仅在未培养样本中鉴定出，39个物种仅在已培养样本中鉴定出。基于吸光度生成了常见CF肺部病原体的生长曲线，这些病原体由患者样本分离物在人工痰液培养基中、正常21%氧气浓度条件下培养获得。仅含ASM的阴性对照在600纳米处的光密度随时间无变化，表明培养物无污染。观察到典型的生长曲线模式，表明ASM培养基可用于通过光学方法生成生长曲线。本研究采用宏基因组测序来描述微生物群落组成。其他技术，例如宏转录组测序可用于评估基因表达，或代谢组学用于评估代谢物的产生。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

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