Name: 用于疫苗接种目的的mRNA负载的聚（β-氨基酯）纳米颗粒的合成和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学习使用聚（β-氨基酯）聚合物制备mRNA纳米颗粒的方法，通过简单步骤封装核酸并验证其稳定性。该技术适用于疫苗开发和免疫治疗研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢MINECO/FEDER（项目号：SAF2015-64927-C2-2-R、RTI2018-094734-B-C22 和 COV20/01100）提供的经费支持。CGF感谢IQS博士奖学金的支持。

<ol><li>Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+existing+live+vaccines+prevent+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Can existing live vaccines prevent COVID-19.</a> Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).</li>
<li>Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+mRNA+vaccines+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances in mRNA vaccines for infectious diseases.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).</li>
<li>Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+did+we+get+a+COVID-19+vaccine+in+less+than+1+year%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year.</a> Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).</li>
<li>Folegatti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+the+ChAdOx1+nCoV-19+vaccine+against+SARS-CoV-2%3A+a+preliminary+report+of+a+phase+1%2F2%2C+single-blind%2C+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial.</a> The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).</li>
<li>Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA%3A+The+new+revolution+in+nucleic+acid+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines.</a> Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).</li>
<li>Ulmer, J. B., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+innovations+in+mRNA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent innovations in mRNA vaccines.</a> Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).</li>
<li>Kranz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNA+delivery+to+dendritic+cells+exploits+antiviral+defence+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy.</a> Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).</li>
<li>Milane, L., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+approval+of+nanotechnology-based+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines%3A+impact+on+translational+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery+and+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine.</a> Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3(2020).</li>
<li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).</li>
<li>Guerrero-Cázares, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+show+high+efficacy+and+specificity+at+DNA+delivery+to+human+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo.</a> ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).</li>
<li>Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreducible+cationic+polymer-based+nanoparticles+for+efficient+and+environmentally+triggered+cytoplasmic+siRNA+delivery+to+primary+human+brain+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells.</a> ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).</li>
<li>Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligopeptide-terminated+poly%28%CE%B2-amino+ester%29s+for+highly+efficient+gene+delivery+and+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).</li>
<li>Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+tunability+as+a+powerful+strategy+to+control+electrostatic+interaction+for+high+efficiency+silencing%2C+using+tailored+oligopeptide-+modified+poly+%28beta-amino+ester%29s+%28PBAEs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs).</a> Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).</li>
<li>Fornaguera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+delivery+system+for+targeting+antigen-presenting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033(2018).</li>
<li>Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. Á, Cascante, A., Borrós, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+freeze-drying+protocol+for+OM-PBAE+nucleic+acid+polyplexes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes.</a> International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).</li>
<li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+to+characterize+and+purify+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles.</a> International Journal of Polymer Science. , (2018).</li>
<li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polymeric+nanoparticle+dispersions+for+biomedical+applications%3A+size%2C+surface+charge+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability.</a> Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).</li>
<li>Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).</li>
<li>Fan, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-assisted+nanoparticles+for+delivery+of+mRNA+cancer+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine.</a> Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).</li>
<li>Le Moignic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+mRNA+trimannosylated+lipopolyplexes+as+therapeutic+cancer+vaccines+targeting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells.</a> Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).</li>
<li>Banerji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccines+to+prevent+COVID-19+disease+and+reported+allergic+reactions%3A+Current+evidence+and+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%3A+In+Practice%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).</li>
<li>Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+delivery+of+RNA+therapeutics%3A+from+concept+to+clinical+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality.</a> Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).</li>
<li>Dosta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+anti-microRNA-712+to+inflamed+endothelial+cells+using+poly%28%CE%B2-amino+ester%29+nanoparticles+conjugated+with+VCAM-1+targeting+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide.</a> Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).</li>
<li>Segovia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+doped+with+nanoparticles+for+local+sustained+release+of+siRNA+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).</li>
</ol>

作者无任何披露事项，也无任何利益冲突。

去年新冠疫情暴发后，疫苗在传染病防控中的重要性凸显，成为关键组成部分8。全球科学家的努力使得多种疫苗得以推向市场。历史上首次，mRNA疫苗因其能够在数月内快速设计并适应任何新抗原的特性，实现了此前假说所预期的成功5,6,21。mRNA（信使核糖核酸）是指将DNA中编码信息用于驱动蛋白质合成的核酸分子。在此用于疫苗接种时，mRNA编码来自致病微生物的抗原蛋白（或在治疗性肿瘤疫苗中编码肿瘤抗原）8,22。因此，科学界亟需明确的mRNA疫苗合成方案。
基于这一设想，本文旨在描述一种利用专有聚合物纳米颗粒合成mRNA疫苗的简便方法24。如实验方案部分所述，首先通过两步法合成聚合物：第一步基于伯胺...

传染病对全球数百万人构成了严重威胁，至今仍是部分发展中国家的主要死亡原因之一。预防性疫苗接种是现代社会预防和控制传染病最有效的干预措施之一1,220 年科学领域的这些关键里程碑th-世纪的相关性已因近期由SARS-CoV-2病毒引发的全球新冠肺炎大流行而受到关注3认识到高效疫苗对遏制疾病传播的重要性，整个生物医学界的通力合作在不到一年的时间内成功推动了多种预防性疫苗上市4.
传统上，疫苗由减毒（具有活性但毒力降低）或灭活（无生命活性的病毒颗粒）的病毒组成。然而，对于一些不容许安全误差的疾病，使用病毒颗粒并不可行，此时则采用蛋白质亚单位。尽管如此，亚单位通常难以整合多个表位/抗原，且需要佐剂来增强疫苗的免疫效力5,6。因此，开发新型疫苗类型的需求显而易见。
正如当前大流行所展示的，基于核酸的新型疫苗候选物在避免漫长研发过程、提供高度通用性的同时，还能实现有效的患者免疫接种，具有显著优势。mRNA疫苗即为一例，其最初被设计为实验性癌症疫苗。这得益于mRNA能够自然地诱导抗原特异性T细胞反应3,5,6,7。由于mRNA是编码抗原蛋白的分子，仅需更换其序列，即可快速改造疫苗以针对同一微生物的不同变异株、不同菌株、其他病原微生物，甚至转化为癌症免疫治疗手段。此外，mRNA疫苗在大规模生产成本方面也具有优势。然而，mRNA存在一个显著障碍，限制了其裸露给药的应用：在富含核酸酶的生理环境中，其稳定性和完整性易受破坏。因此，需要采用一种纳米级载体来保护mRNA，并将其递送至抗原呈递细胞2,8。
在此背景下，聚（β-氨基酯）（pBAE）是一类具有生物相容性和可生物降解性的聚合物，因其带正电荷，能够高效地将mRNA包裹成纳米级颗粒9,10,11。这类聚合物含有酯键，可在生理条件下被酯酶轻易降解。在众多pBAE候选材料中，末端修饰有阳离子寡肽的pBAE表现出更强的能力，可形成较小的纳米颗粒，通过内吞作用高效穿透细胞膜并转染所包载的基因物质。此外，由于其具备缓冲能力，内体酸化过程可促进内体逃逸12,13。具体而言，一种特定类型的pBAE，其主链上含有疏水性基团（即所谓的C6 pBAE），以增强其稳定性，并结合末端寡肽（60%的聚合物修饰为三赖氨酸，40%修饰为三组氨酸），该体系在肠外给药后可选择性地转染抗原呈递细胞，诱导mRNA编码抗原的呈递，进而实现小鼠免疫，相关研究已近期发表14。此外，已有研究证实，此类制剂能够克服纳米医学制剂中的一个主要瓶颈步骤：可在不损失其功能活性的前提下进行冷冻干燥，从而实现在温和干燥环境下的长期稳定储存15。
在此背景下，本方案的目的是向科学界提供mRNA纳米颗粒的制备方法，通过描述该方案中的关键步骤，推动高效疫苗的生产，以用于传染病预防和肿瘤治疗的应用。
以下方案描述了合成寡肽末端修饰的聚（β-氨基酯）——OM-pBAE 聚合物的完整操作流程，该聚合物将用于后续的纳米颗粒制备。本方案中也包含了纳米颗粒的配方制备步骤。此外，还提供了确保实验成功的关键步骤及典型结果，以保证所获得的制剂能够满足必要的质量控制表征要求，从而判断结果为阳性或阴性。本方案的概要见图1。

<table><tbody><tr><td>1,4-丁二醇二丙烯酸酯</td><td>Sigma Aldrich</td><td>123048</td><td></td></tr><tr><td>1-己胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>219703</td><td></td></tr><tr><td>5-氨基-1-戊醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411744</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Panreac</td><td>141007</td><td></td></tr><tr><td>CD11b 抗体</td><td>BD</td><td>550993</td><td></td></tr><tr><td>CD86 抗体</td><td>Bioligend</td><td>105007</td><td></td></tr><tr><td>氯化羟胺</td><td>Panreac</td><td>181023</td><td></td></tr><tr><td>氘代氯仿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>Cys-His-His-His 肽</td><td>Ontores</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Cys-Lys-Lys-Lys 肽</td><td>Ontores</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 试剂（用于制备无 RNase 水）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>该试剂用于处理 MilliQ 水以去除缓冲液中的任何 RNase</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Panreac</td><td>212770</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGFP mRNA</td><td>TriLink Technologies</td><td>L-7601</td><td></td></tr><tr><td>OVA mRNA</td><td>TriLink Technologies</td><td>L-7610</td><td></td></tr><tr><td>RiboGreen 试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>11570626</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-小鼠 AlexaFluor488 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab450105</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纳米颗粒追踪分析仪</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoSight NS300</td><td></td></tr><tr><td>核磁共振波谱仪</td><td>Varian</td><td>400 MHz</td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Nano ZS</td><td>用于测定 ζ 电位和流体动力学尺寸</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 软件</td><td>Malvern Panalytical</td><td>MAN0515-02-EN-00</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpress 软件</td><td>Agilent</td><td>未指定</td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer 软件</td><td>Malvern Panalytical</td><td>DTS Application</td><td>用于分析表面电荷和流体动力学尺寸</td></tr></tbody></table>

用于疫苗接种的mrna负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

疫苗接种是现代社会最重大的成功之一，在控制和预防疾病方面不可或缺。传统疫苗由完整或部分病原体组成。然而，挑战依然存在，开发新型疫苗技术势在必行。在此背景下，用于免疫目的的mRNA技术已展现出更优的性能，这一点已由两种预防SARS-CoV-2感染的mRNA疫苗快速获批所证实。除在预防病毒感染方面取得成功外，mRNA疫苗还可用于癌症的治疗性应用。
然而，由于核酸酶的存在，mRNA在体内不稳定且被迅速清除，导致其无法以裸露形式进行递送。在此背景下，纳米药物，特别是聚合物纳米颗粒，成为关键的mRNA递送系统。因此，本文旨在描述一种基于专有聚合物纳米颗粒的mRNA疫苗候选物的制备与检测方案。本文将讨论所用聚（β-氨基酯）聚合物的合成与化学表征、其与mRNA复合形成纳米颗粒的过程，以及其冻干方法。这一步骤对于降低储存与运输成本至关重要。最后，还将介绍用于验证其递送能力所需的各项检测 体外 转染并成熟模型树突状细胞的步骤将被标明。由于该方案具有高度通用性，可使这些疫苗用于预防或治疗多种疾病，因此将惠及疫苗研究领域的科学界。

聚合物的合成与表征 
OM-pBAE 的合成步骤见图2。如图2A所示，获得 OM-pBAE 的第一步是通过将胺类（1-己胺和5-氨基-1-戊醇，比例为1:1）加入二丙烯酸酯（1,4-丁二醇二丙烯酸酯）中合成 C6-pBAE。该反应在90 °C下持续搅拌反应20小时。随后，将寡肽溶液加入上一步反应所得的 C6 聚合物溶液中（图2B）。最后，在25 °C下以 DMSO 作为溶剂，持续搅拌反应20小时完成合成。图2C展示了 OM-pBAE 的结构，即聚合反应的最终产物。所得聚合物通过1H-NMR 进行表征（见补充图S2）。在表征中，阳性结果是指含有7–10个单体单元（图中表示为 n + m），且两种单体单元各约占一半；而在此范围之外的任何其他数值均为阴性结果。
<p class="jove_content...

本文介绍了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单制备方案，通过更换所包载的mRNA即可轻松实现定制化。该方案涵盖了聚合物的合成、纳米颗粒的制备及其表征的完整工作流程。 体外 还描述了必要的表征方法，并增加了关于免疫接种的概念验证。

用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征

疫苗接种是现代社会最重大的成功之一，在疾病防控中不可或缺。传统疫苗曾是……

本方案具有重要意义，因为它展示了一种通过一步法简便制备包载核酸的聚合物纳米颗粒的方法。该技术的主要优势在于其多功能性，可适用于不同的核酸类型和细胞类型。此外，纳米颗粒的制备过程操作简单，例如通过反复吹打混匀即可完成，且可通过冷冻干燥延长纳米颗粒的稳定性和耐受储存条件。本实验操作将由 Laura Olmo、Coral Garcia-Fernandez、Maria Stampa Lopez-Pinto、Maria Navalon-Lopez（本实验室博士生）以及 Marta Diaz-Caballero（本实验室博士后）进行演示。为形成多聚复合物（polyplexes），请解冻预先配制好的聚合物 C6 肽和聚β-氨基酯（poly beta amino esters），并涡旋振荡溶液。用移液器将聚合物溶液上下吹打混匀后，用醋酸钠配制 12.5 毫摩尔（millimolar）的溶液。涡旋溶液并静置10分钟。接下来，将mRNA配制为0.5毫克/毫升的浓度，并用移液器混匀。再次涡旋聚合物溶液，然后在微量离心管中按1:1的比例将遗传物质溶液加入聚合物溶液中，于Thermoblock中25°C孵育30分钟。孵育后，通过将样品加入含有1至2倍体积无RNase水的微量离心管中沉淀混合物；随后为加入辅料，向mRNA与聚β-氨基酯混合物中加入等体积的20毫摩尔组缓冲液和4%蔗糖溶液，并用移液器吹打混匀。冻干时，先将多聚复合物溶液在-80°C下冷冻1小时，然后进行一次干燥，完成后立即于-20°C保存多聚复合物，以避免重新水合。对于多聚复合物的重悬，从-20°C冰箱中取出冻干的纳米颗粒，并迅速加入相应体积的超纯水，以重新分散固体并达到所需浓度。轻轻吹打直至完全重悬，溶解后剧烈吹打混匀，避免产生气泡。转染24小时后，将含有转染Hela细胞的96孔板置于显微镜下，使用10倍物镜开始通过荧光显微镜进行定性评估。首先进行白平衡校正，为软件创建背景参考，然后采集图像，以便在分析过程中与荧光图像叠加。将显微镜模式切换至反射模式，并将滤光轮移至蓝色激光以观察 EGFP。然后使用相同的曝光时间获取所有条件或孔的图像。为进行流式细胞术的定量评估，用每孔 100 微升 PBS 洗涤在 96 孔板中转染的 Hela 细胞。每孔加入25微升胰蛋白酶后吸去PBS，在37摄氏度下孵育5分钟。待细胞脱落之后，加入先前回收的培养基以中和胰蛋白酶活性，然后每孔加入31.25微升10%福尔马林固定细胞，并孵育20分钟。接下来打开流式细胞仪及其配套软件，设置实验所需的适当条件，包括样品板类型、样品体积以及其他参数，如样品间的振荡和冲洗。通过前向散射光与侧向散射光的流式数据，首先观察以区分细胞与碎片，设置适当的参数以定量转染阳性细胞的百分比。然后绘制另一幅散点图，比较脉冲幅度与脉冲高度，以圈选并区分单个细胞。转染前一天，在96孔板中每孔接种10,000个JAWS II细胞，进行过夜培养。第二天，每孔转染0.6微克mRNA，并在37摄氏度、5%二氧化碳的干燥空气培养箱中孵育24小时。次日，用25微升PBS洗涤孔中残留的细胞。吸除PBS后，加入25微升胰蛋白酶，于37摄氏度孵育5分钟，使细胞脱落。通过将先前回收的培养基加入对应的孔中来终止胰蛋白酶反应。然后离心培养板，吸除培养基，并通过每孔加入50微升PBS和2.5%甲醛固定细胞，随后将培养板在4摄氏度下孵育20分钟，再次离心培养板。然后每孔加入50微升PBS和3% BSA，在4摄氏度下孵育30分钟。孵育后再次离心培养板，然后加入50 µL含PBS和3% BSA的小鼠卵清蛋白抗体，于4 °C孵育30分钟。重复离心步骤，随后用50 µL PBS洗涤细胞。吸除PBS后，加入二抗并于4 °C孵育1小时。孵育后，重复离心和洗涤步骤。然后将细胞重悬于100 µL PBS和2.5%甲醛中，用于流式细胞术分析。对新制备和冻干的包载GFP mRNA的纳米颗粒进行理化表征，结果显示其粒径和多分散指数无显著差异。多聚复合物的透射电子显微镜结果显示，形成了直径约为50纳米的球形且单分散的纳米颗粒。包裹GFP或卵清蛋白的乐高肽及修饰型聚β-氨基酯多聚复合物的包封效率数据表明，不同类型的mRNA之间无显著差异。此处展示了JAWS II细胞系在转染后24小时EGFP表达的定性分析结果。与阴性对照组进行定量比较，GFP阳性细胞百分比显著升高，且与使用经典转染试剂进行的阳性对照相当。载有卵清蛋白mRNA的寡肽及修饰型聚β-氨基酯纳米颗粒可激活树突状细胞，表现为转染细胞中CD11b和CD86膜标志物的表达水平显著高于未转染细胞。我们的疫苗平台以mRNA作为活性成分，并结合专有聚合物，可适用于预防性疫苗以及癌症治疗。我们能够利用该技术突出其在癌症免疫治疗领域的贡献，因为我们可以将肿瘤相关抗原包裹于纳米颗粒中，从而推动癌症治疗的变革。

synthesis-characterization-mrna-loaded-poly-beta-aminoesters

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于疫苗接种目的的mRNA负载的聚（β-氨基酯）纳米颗粒的合成和表征

本视频展示了一种利用聚合物纳米颗粒制备mRNA疫苗候选物的方法。阳离子聚合物与带负电荷的mRNA相互作用，形成聚集体（polyplexes）。聚集体的形成可稳定mRNA，使其成为免疫治疗应用中未来mRNA疫苗的潜在候选物。...

用于疫苗接种的mRNA负载纳米颗粒的制备

本文描述了一种用于评估聚合物基因递送纳米颗粒的纳米颗粒追踪分析（NTA）和高通量流式细胞术的实验方案。NTA...

通过纳米颗粒追踪分析与高通量流式细胞术评估聚合物基因递送纳米颗粒

纳米材料为生命科学基础研究和转化应用中的可控治疗递送提供了多种机制，但其制备通常需要大多数生物医学实验室所不具备的专业技术。本文介绍了利用闪速纳米沉淀法规模化制备多种自组装纳米载体并实现治疗药物负载的实验方案。...

通过闪速纳米沉淀法快速、可放大的生物活性蛋白和免疫刺激剂组装与装载至多种合成纳米载体

在此，我们介绍一种基于干膜法制备阳离子纳米脂质体的实验方案，该方法可用于安全高效地递送 体外...

用于高效递送的阳离子纳米脂质体的制备 体外 转录的信使RNA

本文提供了一种详细的方法，用于自组装蛋白纳米颗粒（SAPNs）的纯化、复性及表征，以应用于疫苗开发。...

E. coli表达的自组装蛋白质纳米颗粒的制备：适用于需要三聚体表位呈递的疫苗

本方案描述了外膜囊泡的生物工程化，以构建“即插即用”型疫苗平台，包括其制备、纯化、生物偶联及表征。...

基于展示SARS-CoV-2受体结合域的外膜囊泡的“即插即用”纳米颗粒疫苗平台

利用微流控混合装置开发了一种自组装肽-泊洛沙胺纳米颗粒（PP-sNp），用于包封与递送 体外 转录的信使RNA。所述mRNA/PP-sNp可有效转染培养细胞 体外.

高效转染 体外 使用肽-泊洛沙胺纳米颗粒在培养细胞中转录mRNA

本文详细介绍了鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备与评价方法 体外 和...

鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备、特性、毒性及有效性评价 体外 和 体内

本方法描述了将狂犬病抗原包封于可生物降解的聚合物微粒中，其结构和材料特性可在预设延迟后实现脉冲式释放。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）对从微粒核心释放的抗原进行检测，证实了在微粒制备过程中完整三聚体狂犬病病毒糖蛋白的存在。...

制备包载狂犬病抗原的脉动型聚合物微粒

本方案制备并评估物理特性、免疫反应及 体内...

评估一种纳米乳剂佐剂疫苗针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的免疫应答

学习使用聚（β-氨基酯）聚合物制备mRNA纳米颗粒的方法，通过简单步骤封装核酸并验证其稳定性。该技术适用于疫苗开发和免疫治疗研究。

用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征

探索更多视频