量化多巴胺能神经元形态改变与变性水平 秀丽隐杆线虫

在本视频中，我们展示了如何使用七点评分系统来量化秀丽隐杆线虫（C.elegans）多巴胺能神经元树突形态的变化。目前，针对线虫神经退行性变的量化分析方法存在较大差异。此外，一些现有的技术仅关注细胞体，对某些类型和程度的损伤不敏感。

引入该评分系统的目的在于能够全面捕捉神经退行性变在各个损伤水平上的整体情况，并提供一个通用体系，以支持秀丽隐杆线虫（C. elegans）多巴胺能神经元退行性变研究的一致性。本文将演示如何在荧光下对神经元进行成像，如何对这些神经元的树突进行评分，并预览结果的展示与解读方法。对于每个实验组，使用移液器或挑取工具将20至30条线虫转移至与成像显微镜兼容的成像平台。

常用的平台包括载玻片上带有盖玻片的2%琼脂糖垫，以及每孔体积为100微升或更少液体培养基的96孔板。让线虫完全麻痹，这可能需要数分钟。

将制备好的成像平台放入具备z轴层扫功能的成像显微镜中。首先在明场下定位线虫的头部区域，然后在成像显微镜下使用单色GFP荧光进行观察。此处显示的线虫为400倍放大倍数下的图像。

调节焦距，找到树突清晰的上下边界，将这些位置设为 z 轴层扫成像的上下限，并选择所需的步距。

此处我们使用一微米。单击以在GFP荧光通道中捕获z轴层析图像。对于每个z轴层析图像，使用显微镜软件或外部图像分析软件打开图像文件。

将图像序列载入软件，并将其压缩为单个平面化图像。通过手动或使用自动卷绕软件对处理组间和组内的图像进行对齐。每次处理一个神经元图像。

选择四条CEP树突中的一条，评估其是否存在出芽、断裂以及不规则形态，包括弯曲、扭结和曲率。建议在图像顶部为头部时从左至右进行评分，以确保评分的可重复性。根据这些准则，为每条树突分配一个评分值。

对于无可见损伤的树突，评分为0分；对于存在不规则但无肿胀或断裂的树突，评分为1分；对于出现少于5个突起肿胀（blebs）的树突，评分为2分；对于出现5至10个突起肿胀的树突，评分为3分；对于出现超过10个突起肿胀和/或断裂导致树突缺失不超过25%的情况，评分为4分；对于断裂导致树突缺失25%至75%的情况，评分为5分；若树突缺失超过75%，则评分为6分。若单个树突符合多个评分标准，应采用对应最高分值的标准进行评分。本视频相关文章中的图1所提供的代表性评分图像可作为参考。

为了演示评分方法，我们将通过为几个示例神经元图像分配评分来进行说明。首先从最上方的树突开始，该树突无可见的泡状膨大、断裂或不规则现象，因此评分为零。

第二根树突有大约14个突起，且无可见断裂，评分为4分。第三根树突由于与第二根树突重叠而无法完整观察，因此无法评分。

最下方的树突大约有11个出芽结构和几处断裂，评分为5分。在此图像中，仅有三条树突可进行评分，因为有一条树突在z轴堆栈成像中未被完整捕获。

在三个可见的树突上均无出芽现象。因此，从上到下评分应为零、零，而由于此处存在弯曲，评分为一。最后，在此图像中，所有四个树突的损失均超过75%。

此处所有树突的评分均为六分。记录所有评分。此时可解除盲法。

此处使用的评分模板可在补充文件中找到。将神经变性评分的总数除以该处理组中评分的树突总数。以每个神经变性评分下处理组内树突所占比例的形式呈现数据。

我们采用评分系统来评估经鱼藤酮处理后L4幼虫期BY200秀丽隐杆线虫（C.elegans）的神经变性情况。此处数据显示为各实验组中每个评分值所对应的树突总数比例。我们将每条评分的树突视为n=1。

在本图中，可以观察到鱼藤酮暴露引起的剂量依赖性神经变性反应，并且评分分布的具体情况也清晰显示。根据卡方独立性检验并结合多重比较的邦弗罗尼校正，这些实验组之间在统计学上存在显著差异。在本视频中，我们展示了如何使用本实验室开发的七分制评分系统，对秀丽隐杆线虫（C.elegans）中多巴胺能神经元形态改变和变性程度进行定量评估。

采用该评分方法可提高分析的一致性，并允许在不同线虫神经退行性变研究之间进行比较。我们的评分系统可用于分析来自秀丽隐杆线虫（C.elegans）实验的数据，这些实验使用细胞特异性的荧光报告基因，例如 dat-1 多巴胺转运体基因，以实现多巴胺能神经元的可视化。现在，请在本文的补充材料中查找一组带有注释的练习图像，可用于对该方法尚不熟悉的研究人员进行培训、校准及评分一致性评估。