测量重组Perfringolysin O透化细胞中的线粒体底物通量

因为它可以检测可能受不同病理状态或治疗影响的线粒体底物通量。例如，今天我们将其用于揭示癌细胞对二甲双胍治疗的反应。该方法仅需少量细胞，同时能为每种不同材料设置足够的重复和适当的对照。

该分析仪仅用于科研用途。该技术可识别线粒体代谢中的异常，并可用于评估影响线粒体的药物作用。本次实验操作的示范者为我实验室的本科生及科研技术人员 Karolina Vaneckova。

将 A549 细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种于 Seahorse XF 96 细胞培养微孔板的第 2 至第 11 列中，第 1 列和第 12 列作为空白背景孔，不接种细胞。空白孔中加入与细胞培养液等体积的培养基，随后将细胞置于 37°C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育，以促进细胞贴壁。

三到四小时后，在孔中加入 100 微升细胞培养基。实验组第 7 至 11 列加入 1 毫摩尔的二甲双胍，对照组加入等体积的无菌蒸馏水，然后将培养板放回培养箱。为水化传感器，使用移液器向实用板的每个孔中加入 200 微升无菌水。

然后小心地将传感器盒放回，同时将传感器浸入水中。将传感器盒置于无二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下孵育至次日。打开分析仪和控制单元。

启动仪器控制和数据采集软件，并按照文本稿件中的描述设计检测方案。在分组定义中，创建四种注射策略，其中A端口根据注入的底物不同而变化，并以底物名称或其缩写命名各策略。将寡霉素分配至B端口，FCCP分配至C端口，鱼藤酮与抗霉素A混合物分配至D端口。在孔板图中创建并命名八个分组，将各分组分配至相应的孔。

然后将该实验方案保存为可直接使用的模板。保持分析仪开关开启，使温度过夜稳定。第二天，弃去工具板中的水，并在工具板的每个孔中加入200 µL预热的校准液。

将 cartridge 放回无二氧化碳的培养箱中，直至进行检测。保持培养箱内的湿度来源，并将风扇速度调至最低或关闭，以避免校准液快速蒸发。根据文稿中的描述，使用预热的两倍线粒体检测溶液、5% BSA 和无菌水配制 5 毫升底物和抑制剂的工作溶液。

接下来，按照tax论文中所述方法，向进样口加载底物和抑制剂。在运行检测选项卡下进行校准时，单击“开始运行”以启动检测。插入已加载的传感器盒，等待校准完成。

在50毫升离心管中，通过混合两倍浓度的线粒体检测溶液、无菌水和5% BSA，配制20毫升检测培养基。加入2微升10微摩尔的重组产气荚膜溶素O，使其终浓度为1纳摩尔。轻轻吹打混匀，避免振荡和涡旋。

将试管在 37 摄氏度孵育至使用。使用多通道移液器，用预热的无钙无镁 PBS 溶液洗涤细胞和空白孔两次。弃去 PBS，每孔加入 180 微升预热的检测培养基以进行细胞通透化处理。

透化处理后，立即用含有透化细胞的细胞板替换校准传感器 cartridge 中的工具板，并开始检测。处理组的琥珀酸诱导呼吸速率较高。A549 细胞对二甲双胍处理的响应高于 Hep G2 细胞。在五到十五分钟内，与 Hep G2 细胞相比，A549 细胞在丙酮酸-苹果酸诱导呼吸中表现出更强的诱导作用。

谷氨酸-苹果酸诱导呼吸和棕榈酰肉碱-苹果酸诱导呼吸也获得了类似的结果。为达到底物和抑制剂的正确浓度，必须将正确的体积加入相应的加样孔中。

当发现某种底物的代谢途径发生变化时，有必要评估该途径中相关酶和转运蛋白的功能。