改良的酶保护实验用于研究Staphylococcus aureus的内化作用及抗菌化合物的胞内活性

酶保护法可用于研究金黄色葡萄球菌的内化程度及其在贴壁细胞内的存活能力，以及抗菌化合物的效果。改进后的酶保护法大大简化了技术操作，并能够从弱贴壁细胞和悬浮细胞中回收内化的细菌。本次实验操作将由我实验室的医学博士及博士研究生 Josselin Rigaill 演示。

感染实验前两天，将A549上皮细胞以每毫升2.0 × 10⁵个细胞的密度接种于24孔板的每个孔中，并在36°C、5% CO₂条件下培养48小时，直至细胞达到100%汇合度。实验当天，移除并弃去用于A549细胞计数的三个孔中的废弃培养基，每孔加入1毫升完全感染培养基，其中含有5 µg/mL Hoechst 33342和1 µg/mL碘化丙啶。将细胞孵育30分钟，然后使用宽场荧光显微镜对细胞数量进行计数，并计算细胞活力。

制备细菌悬液时，取25毫升完全感染培养基加入离心管中，并在36°C下预热。接着，使用细胞密度计将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）悬液用完全感染培养基调整至OD值为0.5，然后根据每孔细胞数量，用完全感染培养基稀释菌液，制备20毫升用于细胞接种的细菌悬液，使感染复数（MOI）为1。随后，使用自动螺旋接种仪测定用于细胞接种步骤的稀释后细菌悬液中的金黄色葡萄球菌载量，并将琼脂平板在36°C下培养18至24小时。

第二天，使用菌落计数器统计菌落数量，以计算每种测试菌株的准确感染复数（MOI）。在细胞接种前，通过低倍显微镜观察24孔板的每个孔，确保细胞状态健康且生长正常，随后移除并弃去24孔板中的用过的细胞培养基，向含有100%汇合度细胞的每个孔中加入500 µL细菌悬液。将细胞在36 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。

为了利用改进的酶保护法对细胞内细菌进行定量，需按照文稿中所述方法配制4倍裂解缓冲液、2% Triton X-100、胰蛋白酶-EDTA以及溶葡萄球菌素工作液。接着，通过将6毫升完全感染培养基加入250微升溶葡萄球菌素工作液中，配制总体积为6.25毫升的含溶葡萄球菌素完全感染培养基。然后，向每孔中加入250微升含溶葡萄球菌素的完全感染培养基，并用手轻轻旋转培养板，使液体轻柔振荡。

为了使溶葡萄球菌酶能够杀灭胞外细菌，将细胞在36摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时，然后通过向每孔加入10微升浓度为20微克/毫升的蛋白酶K，在室温下孵育2分钟以灭活溶葡萄球菌酶。接着，加入250微升4倍裂解缓冲液，通过渗透压休克裂解细胞，并在36摄氏度孵育10分钟。孵育结束后，用移液器将细胞裂解液上下吹打数次，以确保细胞完全裂解并充分混匀，随后使用自动螺旋接种仪测定每孔中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的载量，并将琼脂平板在36摄氏度孵育18至24小时。

第二天，使用菌落计数器计数菌落数量，以计算每孔细胞内的金黄色葡萄球菌载量。图中展示了A549上皮细胞对两种金黄色葡萄球菌菌株的内化情况。通过包含洗脱步骤以去除溶葡萄球菌酶的酶保护实验，SF8300野生型菌株和缺失fnbA与fnbB基因的同基因突变株的平均细胞内载量分别为每毫升4.46和0.49 log cfu。

采用改良的酶保护法，即利用蛋白酶K使溶葡萄球菌素失活，测得的载菌量分别为每毫升4.53和0.56 log cfu。此处展示了使用酶保护法测定的万古霉素、利福平和左氧氟沙星对金黄色葡萄球菌的胞内活性。对照组的平均胞内载菌量为每毫升4.57 log cfu，万古霉素组为4.51，利福平组为3.03，左氧氟沙星组为2.91。

为了去除酶而进行的剧烈洗涤往往会脱落感染程度最高的细胞，这可能导致结果不准确，从而支持采用改进后的实验方案。改进后的酶保护实验使得研究金黄色葡萄球菌在类器官中的内化过程更加简便，并且可以轻松地适配于高内涵筛选系统，通过将类器官置于该系统中即可实现。