Name: 将小鼠成纤维细胞直接重编程为黑素细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学习使用Mitf、Sox10和PAX3三种转录因子将小鼠成纤维细胞直接重编程为黑素细胞的高效方法。该技术操作简便、稳定性强，为白癜风等色素脱失疾病的治疗提供了新策略。

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本研究部分得到了中国国家自然科学基金（82070638 和 81770621）以及江苏省自然科学基金（BK20180281）的资助。

本研究经江苏大学实验动物管理与使用委员会批准（UJS-IACUC-AP--20190305010）。实验严格遵循国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）制定的标准进行。本研究未涉及人类实验，因此无需获得人类研究伦理委员会的批准。有关试剂的详细信息，请参见材料表。
1. 转录因子的高浓度慢病毒包装系统的构建
<ol>
	<li>病毒浓缩物的制备图1A，B)
	<ol>
		<li>接种 1.5 × 106 将HEK-293T细胞接种至60 mm培养皿中，并用正常培养基培养（见 表1) 在37 °C、含5% CO₂的湿润化培养箱中2. 
		注意：如果需要分批包装病毒，可使用100 mm细胞培养皿（详见 表2).</li>
		<li>24 小时后，确保 HEK-293T 细胞在转导当天达到 80–90% 汇合度，并将培养基更换为 3.5 mL DMEM（每 1 cm² 面积加入 150 µL DMEM）2。将细胞置于含5% CO₂的湿润化培养箱中，在37 °C下孵育2 2小时。 
		注意：更换的培养基必须不含血清，以便细胞能够 &#34;饥饿处理&#34; 以提高质粒转染效率。</li>
		<li>制备质粒混合物（混合物A），其中包含3 µg的Mitf、Sox10、Pax3、Sox2、Sox9或Snai2目的质粒，1 µg的包装质粒PMD2.G，以及2 µg的包装质粒PSPAX2。用无血清DMEM将混合物A的体积补至150 µL。制备转染试剂混合物（混合物B），加入12 µL转染试剂（该体积为所有质粒总质量的两倍），并用无血清DMEM将混合物B的体积补至150 µL。 
		注意：配制混合液时，应缓慢加入液体，以避免产生气泡。</li>
		<li>将混合液A与混合液B在室温下静置5分钟后混合。室温孵育20-30分钟以形成转染复合物。</li>
		<li>从培养箱中取出HEK-293T细胞，将培养基更换为DMEM + 2% FBS，逐滴加入步骤1.1.4中的混合液，并轻轻混匀液体。</li>
		<li>8小时后，更换为3.5 mL正常培养基。换液后，分别在24小时和48小时收集病毒上清液。</li>
		<li>将两个不同时间点收集的病毒上清液混合，于200 × g 在4 °C下离心5分钟。将上清液通过0.45 µm滤器过滤，收集于50 mL无菌锥形管中。 
		注意：24 小时收集的病毒可在 4 °C 保存，并与 48 小时收集的病毒混合。</li>
		<li>通过在 6000 × g 条件下离心浓缩病毒上清液 g 在4 °C下过夜（约16 h）。离心后应确保病毒沉淀可见于锥形管底部。</li>
		<li>缓慢倒出上清液。将病毒沉淀物溶解于正常培养基中，培养基体积为原体积的1/100。th 病毒上清液体积的，使用P1000微量移液器轻轻吹打，直至形成均匀的混合液。根据需要将浓缩后的病毒分装至微量离心管中，于−80 °C保存。 
		注意：通过此方法可将病毒浓缩100倍。浓缩后的病毒（100倍浓度）可保存用于后续实验。 &#62;-80 °C 保存 1 年。避免病毒反复冻融。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>浓缩病毒滴度的检测（图1C)
	<ol>
		<li>接种 1 × 105 将HEK-293T细胞接种至6孔板的一个孔中。请额外设置一个孔作为阴性对照。将这些细胞置于含5% CO₂的湿润化培养箱中，于37 °C用普通培养基进行培养。2.</li>
		<li>24小时后，向每孔加入0.1 µL或0.2 µL的荧光浓缩病毒（100倍浓缩液），并向每孔加入4 ng/µL的阳离子聚合物转染试剂。感染后约8–12小时，更换为正常培养基。 
		注意：为了确保荧光检测的准确性和效率，感染率必须控制在10%-30%之间。加入0.1 µL或0.2 µL的浓缩荧光病毒可使感染效率维持在此范围内。浓缩病毒滴度可达到1 × 108 转导单位（TU）/mL，至少。</li>
		<li>感染后约48小时，用1 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养皿，以去除死亡细胞。</li>
		<li>使用6孔板，每孔加入250 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，室温消化1分钟。200 × g 4 °C下离心5分钟，然后弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中，将悬液加入5 mL聚苯乙烯圆底管中，检测病毒荧光（绿色荧光蛋白，GFP）的感染效率+通过流式细胞术。</li>
		<li>使用以下公式计算浓缩病毒滴度：105 （细胞体积）× 感染率（GFP+%)/加入的病毒体积（0.1 µL 或 0.2 µL）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞（图 2A）
<ol>
	<li>在室温下，用1 mL 0.1%明胶溶液包被6孔细胞培养板中的一个孔，孵育15–30分钟。确保孔底完全被0.1%明胶溶液覆盖。包被完成后，吸除0.1%明胶溶液。 
	注意：按如下方法制备 0.1% 明胶溶液（100 mL）：将 0.1 g 明胶粉末溶于 100 mL 超纯水中，置于经高压灭菌的玻璃瓶内，4 °C 保存，保存时间不超过 2 个月。</li>
	<li>接种 5 × 104 将MEFs接种至一个6孔板的孔中，该孔预先用0.1%明胶包被（同步骤2.1），并在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中用普通培养基培养这些细胞2 过夜。</li>
	<li>24小时后，确认小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）融合度达到40–50%。更换为正常培养基。</li>
	<li>第0天，从冷冻柜中取出浓缩病毒，在冰上融化。根据公式（1）。加入编码六种转录因子 Mitf、Pax3、Sox10、Sox9、Sox2 和 Snai2 的浓缩病毒（参见 材料表根据计算出的体积向每孔加入相应量，并加入终浓度为 4 µg/mL 的阳离子聚合物转染试剂。 
	细胞数量（5 × 104) × 30（感染复数，MOI）/病毒滴度（1)</li>
	<li>第1天，感染后8-12小时，吸除含病毒的培养基，更换为新鲜的正常培养基，并加入0.5 µg/mL嘌呤霉素以筛选稳定感染的细胞系。</li>
	<li>第2天，感染后48小时，逐步将上清培养基更换为重编程培养基。首先更换1/4th 总体积的培养基中加入3 µM CHIR99021。</li>
	<li>从第3天到第7天，根据细胞状态，通过更换为更高比例的重编程培养基来换液（参见 表1逐步更换为完全重编程培养基，5天内完成过渡。 
	注意：在此期间，必须每天使用嘌呤霉素（puromycin）和CHIR99021。在更换重编程培养基的第一天和第二天，会出现大量死亡细胞，这是正常现象，因为细胞正在逐渐适应转化过程。因此，需要逐步更换培养基，以确保细胞健康增殖。</li>
	<li>消化细胞时，加入500 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，在室温下消化3分钟。当约60%的细胞脱落时，加入两倍于消化酶体积的完全培养基终止消化。将细胞悬液收集至15 mL无菌锥形离心管中，于200 × g 4 °C下离心5分钟，弃上清，用重编程培养基重悬细胞沉淀，以3 × 10⁵细胞/60 mm无菌培养皿的密度接种细胞4/cm2在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养这些细胞。2 培养箱 
	&#8203;注意：从第8天到第21天，这些细胞每3至5天传代一次，并在60 mm无菌培养皿中培养以扩增。细胞可培养至至少第5代。</li>
</ol>
3. 直接重编程的优化与鉴定
<ol>
	<li>筛选最适转录因子
	<ol>
		<li>重复步骤 2.1–2.7，每次减少六种转录因子中的一种。用包含五种转录因子组合的病毒感染 MEFs。</li>
		<li>感染后七天，提取这些细胞的 RNA16，并使用逆转录PCR（RT-PCR）分析其黑素细胞基因的表达水平17 通过逐一剔除转录因子来筛选对转化为黑色素细胞影响最大的转录因子图3A).</li>
		<li>使用对转化为黑色素细胞影响最大的三种转录因子感染MEFs。重复步骤2.1–2.7。 
		注意：感染后7天，这些转化细胞中应可检测到黑色素细胞基因（图3B）。iMels 鉴定所用引物信息包含在 表3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导性黑色素细胞（iMels）的鉴定
	<ol>
		<li>使用免疫荧光染色18 以验证iMels表达黑色素细胞蛋白，包括TYRP-1和DCT（图 4A).</li>
		<li>黑色素特异性3,4-二羟基苯丙氨酸（DOPA）染色（图4B)
		<ol>
			<li>配制4%多聚甲醛（10 mL）：将0.4 g多聚甲醛粉末溶于10 mL PBS中，置于56 °C烘箱中2 h以促进溶解。 
			注意：该溶液在 4 °C 下保存不得超过一个月。</li>
			<li>在30 mm培养皿中培养iMels，用预热的PBS洗涤培养皿两次。加入1 mL 4%多聚甲醛固定细胞20分钟，再用PBS洗涤培养皿3次。</li>
			<li>使用前将0.01 g L-DOPA粉末溶于10 mL PBS中，配制0.1% DOPA染色液（10 mL）。将溶液置于37 °C水浴中30分钟，期间振荡数次以促进溶解。</li>
			<li>加入1 mL 新鲜配制的0.1% DOPA染色液。在37 °C烘箱中孵育2–5 h。若无棕黑色颗粒出现，可继续在37 °C孵育2 h，但不可超过 &#62;5 小时。每 30 分钟检查一次样品。</li>
			<li>用 PBS 洗涤培养皿 3 次，每次 1 分钟。加入 1 mL 苏木精染色液染细胞核 2 分钟。</li>
			<li>长期保存时，先用95%乙醇脱水3分钟，再用100%乙醇脱水5分钟。用二甲苯和中性树胶封片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>黑色素特异性马松-方塔纳染色图4B)
		<ol>
			<li>将iMels接种于30 mm培养皿中，用4%多聚甲醛固定20分钟；用PBS洗涤培养皿3次。</li>
			<li>加入1 mL染色试剂盒（Masson-Fontana染色试剂盒）中的A液（氨性硝酸银溶液）（参见 材料表），将培养皿放入暗盒中，并将暗盒置于56 °C的烘箱中加热15–40分钟。 
			注意：如果在烘箱中孵育15分钟后仍不可见棕黑色颗粒，请将样本重新放回56 °C烘箱继续孵育，但不要超过 &#62;40 分钟。可在暗盒中加入一些水以防止干燥。</li>
			<li>吸去溶液A，用蒸馏水洗涤培养皿5-6次，每次1-2分钟。</li>
			<li>加入1 mL Masson-Fontana染色试剂盒中的溶液B（低渗溶液），将培养皿置于室温下孵育3–5分钟。</li>
			<li>吸除溶液B，用自来水洗涤培养皿3次，每次1分钟。</li>
			<li>从Masson-Fontana染色试剂盒中加入1 mL溶液C（中性红染液），将培养皿置于室温下孵育3-5分钟。</li>
			<li>吸除溶液C，用蒸馏水洗涤培养皿3次，每次1分钟。</li>
			<li>加入1 mL 100%乙醇进行快速脱水，3分钟后吸除乙醇。 
			注意：染色样本经二甲苯和中性树胶封片后可长期保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

病毒的质量对于本方案中直接重编程为黑色素细胞的成功至关重要。本方案中包装和浓缩病毒的方法简单且易于重复，不依赖任何其他辅助浓缩试剂。大多数实验室均可成功实施本方案。为确保浓缩病毒的质量，需特别注意以下几点：一是HEK-293T细胞的状态。尽管HEK-293T细胞为永生化细胞，但用于制备浓缩病毒的细胞必须是传代次数在10代以内的健康细胞（随着传代次数增加，病毒滴度会下降）。
另一个关键点是转染试剂（本实验中为脂质体转染试剂lipofectamine）的使用比例。由于加入转染试剂后细胞可能受到损伤，必须反复验证试剂与质粒的比例，以确保细胞处于最佳状态以及病毒的质量。在本系统中，使用2:1的转染试剂与质粒比例最适合HEK-293T细胞进行病毒包装。此外，整个操作过程中的所有步骤均需轻柔处理。由于病毒颗粒在包被后可能被吸附，从而影响病毒滴度，因此在病毒包装过程中不建议对培养皿进行任何基质包被。由于HEK-293T细胞可能发生脱落，更换上清液时必须格外小心，尤其是在收集24小时后的病毒上清液后添加新鲜培养基时。其他需要考虑的因素还包括细胞密度、转染时间的长短以及培养基中的血清含量。这些因素均...

白癜风是一种严重影响患者身心健康皮肤疾病。由于代谢异常、氧化应激、炎性介质生成、细胞脱离以及自身免疫反应等多种原因，功能性黑素细胞丢失，黑素分泌停止，从而导致白癜风的发生1,2。该疾病发病率广泛，尤其在面部影响显著。目前主要治疗方法包括系统性使用糖皮质激素和免疫调节剂。光疗可用于全身性或局部性病变，此外还有手术治疗，如钻孔皮肤移植和自体黑素细胞移植3,4,5。然而，采用药物治疗和光疗的患者容易复发，且这些疗法的长期疗效较差。手术治疗具有创伤性，且疗效仅中等2,6。因此，亟需开发一种新的、有效的白癜风治疗策略。
诱导多能干细胞（iPSCs）的重编程过程通过转录因子 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 的介导，使这些细胞从终末分化状态逆转至多能状态。7然而，由于存在致瘤风险以及生产周期较长，该技术在临床应用中受到了质疑8直接重编程是一种将一种终末分化细胞转化为另一种终末分化细胞的技术。9该过程通过合适的转录因子实现。多种细胞已成功实现直接重编程，包括心肌细胞。10神经元11和耳蜗毛细胞12一些研究人员甚至直接对皮肤组织进行了重编程 原位，可用于伤口修复13直接重编程的优势包括缩短等待时间、降低成本、降低致癌风险、减少伦理问题，以及更深入地理解细胞命运决定的机制9.
尽管直接重编程方法已被广泛应用，但目前尚无明确的方法可将皮肤细胞直接重编程为黑色素细胞，尤其是由于需要考虑的转录因子种类繁多14,15。已有研究使用转录因子Mitf、Sox10和Pax3将皮肤细胞直接重编程为黑色素细胞14。相比之下，另一项研究则采用MITF、PAX3、SOX2和SOX9的组合，将皮肤细胞直接重编程为人类黑色素细胞15。在本实验方案中，尽管采用了不同的筛选方法，但仍如先前研究所述14，使用Mitf、Sox10和Pax3的组合实现了将皮肤细胞直接重编程为黑色素细胞的相同结果。建立一种从其他皮肤细胞生成黑色素细胞的系统，可为将白癜风患者自身的其他皮肤细胞转化为黑色素细胞提供可行策略。因此，构建一种简单且高效的直接重编程方法，以成功生成黑色素细胞，具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Millipore</td><td>SLHVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>95%/100% 乙醇</td><td>LANBAO</td><td>210106</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td>储存液浓度 40 mg/mL&lt;br/&gt; 工作浓度 24 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgG2a</td><td>Invitrogen</td><td>A21137</td><td>使用时稀释比例为 1:500</td></tr><tr><td>抗生素（青霉素/链霉素）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>抗 TRP1/TYRP1 抗体</td><td>Millipore</td><td>MABC592</td><td>宿主/同种型：小鼠 IgG2a&lt;br/&gt; 种属反应性：小鼠/人&lt;br/&gt; 使用时稀释比例为 1:200</td></tr><tr><td>抗 TRP2/DCT 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab74073</td><td>宿主/同种型：兔 IgG&lt;br/&gt; 种属反应性：小鼠/人 使用时稀释比例为 1:200</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>储存液浓度 10 mM&lt;br/&gt; 工作浓度 3 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>霍乱毒素</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>储存液浓度 0.3 mg/mL&lt;br/&gt; 工作浓度 20 pM</td></tr><tr><td>Cy3 山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-144</td><td>使用时稀释比例为 1:500</td></tr><tr><td>DMEM（高糖）</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DMSO&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 使用前需热灭活</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>GFP-PURO 质粒（Mitf、Sox10、Pax3、Sox2、Sox9 和 Snai2）</td><td>汉恒生物科技有限公司</td><td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Abcam</td><td>ab220365</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>人源 EDN3</td><td>American-Peptide</td><td>88-5-10A</td><td>储存液浓度 100 &amp;mu;M&lt;br/&gt; 工作浓度 0.1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>储存液浓度 100 &amp;micro;g/mL&lt;br/&gt; 工作浓度 0.5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>L-DOPA</td><td>Sigma</td><td>D9628</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>转染试剂，储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Masson-Fontana 染色试剂盒</td><td>Solarbio</td><td>G2032</td><td>储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>Solarbio</td><td>G8590</td><td>储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>室温储存</td></tr><tr><td>佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯（TPA）</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td>储存液浓度 1 mM&lt;br/&gt; 工作浓度 200 nM</td></tr><tr><td>聚凝胺（Polybrene）</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>阳离子聚合物转染试剂；储存液浓度 8 &amp;mu;g/&amp;micro;L&lt;br/&gt; 工作浓度 4 ng/&amp;micro;L</td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>重组人 bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>储存液浓度 4 &amp;mu;g/mL&lt;br/&gt; 工作浓度 10 ng/mL</td></tr><tr><td>重组人胰岛素</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>I3536</td><td>储存液浓度 10 mg/mL&lt;br/&gt; 工作浓度 5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>重组人 SCF</td><td>R&amp;D</td><td>255-SC-010</td><td>储存液浓度 200 &amp;mu;g/mL&lt;br/&gt; 工作浓度 100 ng/mL</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>储存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma</td><td>1330-20-7</td><td>室温储存</td></tr></tbody></table>

小鼠成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

黑素细胞功能的丧失会导致白癜风，严重影响患者的身体和心理健康。目前，白癜风尚无有效的长期治疗方法。因此，开发一种便捷且有效的白癜风治疗手段势在必行。通过再生医学技术将皮肤细胞直接重编程为黑素细胞，似乎是一种具有前景的新型治疗策略。该方法旨在将患者自身的皮肤细胞直接重编程为功能性黑素细胞，以弥补白癜风患者黑素细胞的缺失。然而，该方法需首先在小鼠模型中进行验证。尽管直接重编程技术已被广泛应用，但目前尚无明确的将细胞直接重编程为黑素细胞的标准操作流程。此外，可用的转录因子数量众多，筛选难度较大。
本文介绍了一种浓缩型慢病毒包装系统方案，用于制备可将皮肤细胞重编程为黑色素细胞的转录因子，包括 Sox10、Mitf、Pax3、Sox2、Sox9 和 Snai2。通过该浓缩慢病毒载体，将上述所有转录因子导入小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），实现 MEFs 向诱导性黑色素细胞（iMels）的直接重编程。 体外此外，研究人员对这些转录因子进行了筛选，并优化了成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞的体系。诱导产生的黑色素细胞（iMels）在基因或蛋白水平上均显著上调了黑色素相关特征标志物的表达。这些结果表明，将成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞可能成为治疗白癜风的一种有效新策略，同时也验证了黑色素细胞发育的机制，为后续进一步实现成纤维细胞向黑色素细胞的直接重编程提供了理论基础。 体内.

本文包含一种浓缩型慢病毒包装系统的实验方案，用于产生转录因子的慢病毒，以实现成纤维细胞向黑色素细胞的直接重编程，以及从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）筛选转录因子并直接重编程为黑色素细胞的实验方案。
通过观察感染未浓缩慢病毒（1倍）和浓缩慢病毒（100倍）48小时后HEK-293T细胞中GFP的荧光强度（图1A）或流式细胞术分析结果（图1B），评估高浓度慢病毒制备的成功情况。浓缩病毒的滴度达到108 TU/mL或更高，相对较高（图1C）。
通过转录因子慢病毒感染并结合优化的重编程培养基处理，可将成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞。从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）生成诱导性黑色素细胞（iMels）的实验流程如图2A所示。在直接重编程过程中，细胞形态逐...

本文介绍了一种优化的黑色素细胞直接重编程系统，以及一种高效、高浓度的病毒包装系统，可确保直接重编程过程顺利进行。

黑素细胞功能丧失会导致白癜风，严重影响患者的身体和心理健康。目前，……

已有报道通过直接重编程生成黑色素细胞。然而，不同研究中使用了不同的转录因子。在本方案中，我们验证并减少了转录因子的数量，同时仍保持较高的重编程效率。我们建立了一种直接重编程系统，仅使用三种转录因子Mitf、Sox10和PAX3即可生成黑色素细胞，并改进了培养体系，使其更加稳定和可靠。如何再生功能性黑色素细胞是一个重要问题，可能有助于解决白癜风等色素脱失性疾病的治疗局限。正确的重编程技术可带来前瞻性突破。本技术具有操作简便、可操作性强和稳定性高的特点，更易于推广和重复。开始制备浓缩慢病毒时，将1.5 × 10⁶个HEK-293T细胞接种至60毫米培养皿中，于含5%二氧化碳的湿润培养箱中，以正常培养基在37°C条件下培养。孵育24小时后，当HEK-293T细胞融合度达到80%至90%时，将培养基更换为3.5 mL DMEM，并在含5%二氧化碳的湿润培养箱中37°C继续孵育2小时。从培养箱中取出细胞后，弃去原培养基，更换为含2% FBS的DMEM，并将新鲜配制的转染复合物混合液逐滴加入细胞中。轻轻混匀液体混合物。八小时后，更换细胞培养基，加入3.5 mL正常培养基。在24小时和48小时分别收集病毒上清液。接下来，混合在两个不同时间点收集的病毒上清液，并在4°C条件下以200 × g离心5分钟。然后将收集的上清液通过0.45微米滤器，将滤过液收集到50 mL无菌锥形管中。通过在4°C条件下以6,000 × g离心过夜，浓缩过滤后的病毒上清液。完成后，确保在锥形管底部可见病毒沉淀。缓慢倾倒上清液。用正常培养基溶解病毒沉淀，加入的培养基体积为病毒上清液的百分之一，使用P1000微量移液器轻轻吹打，直至获得均匀的100倍浓缩病毒混合液。将浓缩病毒分装至微量离心管中，于-80摄氏度保存。将1×10⁵个HEK-293T细胞接种至六孔板的一个孔中。将这些细胞在37摄氏度、含5%二氧化碳的湿润培养箱中，用正常培养基进行培养。24小时后，向每孔加入0.1至0.2微升的100倍浓缩荧光病毒。随后，向每孔加入4纳克/微升的阳离子聚合物转染试剂。病毒感染后约8至12小时，更换为正常培养基。感染后48小时，用1 mL无菌PBS洗涤培养皿，以去除死亡细胞。随后，在室温下，每六孔板孔加入250 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。在4°C条件下，以200 × g离心5分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS中，并将细胞悬液加入5 mL聚苯乙烯圆底管中。然后将试管放入流式细胞仪中以分析样品。进行成纤维细胞的直接重编程时，将1 mL 0.1%明胶溶液加入六孔细胞培养板的一个孔中，在室温下包被。15至30分钟后，当孔壁完全被明胶覆盖后，吸除0.1%明胶溶液。随后，将5 × 10⁴个鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）接种至一个已包被0.1%明胶的六孔板孔中，并在含5%二氧化碳的湿润培养箱中，于37°C下用常规培养基培养过夜。24小时后，当MEF细胞达到40%至50%融合度时，将培养基更换为正常培养基。接着，将冷冻的浓缩病毒在冰上融化。根据公式计算所需添加的病毒体积，然后按照计算出的体积，向每孔中分别加入含有六种转录因子的浓缩病毒。向孔中加入每毫升 4 微克的阳离子聚合物转染试剂。将此视为慢病毒感染的第 0 天。第 1 天，在感染 8 至 12 小时后，将含病毒的培养基更换为新鲜的正常培养基，同时加入每毫升 0.5 微克的嘌呤霉素以筛选稳定感染的细胞系。在感染后的第二天（即第2天），将上清液培养基逐渐更换为重编程培养基。在添加3 µM CHIR99021之前，先更换总体积四分之一的培养基。从第3天到第7天，根据细胞状态，通过逐步增加重编程培养基的比例，更换培养基，以在五天内完全过渡至完全重编程培养基。接下来，在室温下用 500 微升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化酶处理细胞，消化 3 分钟。当约 60% 的细胞脱落漂浮时，加入正常培养基终止消化，培养基体积为消化酶体积的两倍。将细胞悬液收集至 15 mL 无菌锥形离心管中，在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 5 分钟。用重编程培养基重悬细胞沉淀前，先去除上清液。操作完成后，将重悬的细胞接种至60毫米无菌培养皿中。在37摄氏度、含5%二氧化碳的加湿培养箱中培养细胞。在HEK-293T细胞感染慢病毒48小时后，通过观察GFP的荧光强度或流式细胞术评估浓缩慢病毒的制备效果。浓缩病毒的滴度较高，达到10的8次方 TU/mL。在成纤维细胞的直接重编程过程中，细胞形态逐渐转变为细长的细胞突触，并出现细胞核增大。然而，细胞在第20天后逐渐老化。去除转录因子Mitf、Pax3或Sox10会导致黑色素细胞基因Tyr、TYRP1和Mlana的表达沉默，表明这三种转录因子对成纤维细胞向黑色素细胞转化的影响最为显著。因此，与使用六种转录因子相比，通过三种转录因子直接重编程诱导的黑色素细胞基因表达水平更高。为了鉴定MEF诱导产生的黑色素细胞（iMels），通过免疫荧光染色检测了黑色素细胞标志物TYRP1和DCT的表达。此外，多巴（DOPA）染色和马松-芳汀染色（Masson-Fontana staining）等黑色素特异性染色方法也显示阳性结果。293T细胞应均匀分布。此外，将转染混合物加入细胞时必须轻柔操作，以防止细胞脱落漂浮。该方案稳定且具有实用性，可用于重编程其他类型的细胞。未来医学中，该方法有望为体内直接重编程促进黑素细胞再生提供参考和策略。

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科研

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Developmental Biology

发育生物学

将小鼠成纤维细胞直接重编程为黑素细胞

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本视频介绍了一种从新生小鼠皮肤中快速分离并同时培养黑素细胞和成纤维细胞的方法。这些细胞可被长期维持并进行实验操作 体外...

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成年小鼠成纤维细胞直接谱系重编程为红系祖细胞

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小鼠成纤维细胞直接重编程为黑色素细胞

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