离体视网膜组织样品中线粒体呼吸和糖酵解的测定

该协议提供两种主要生物能量途径的实时分析:线粒体呼吸和新鲜解剖的离体小鼠视网膜组织中的糖酵解。传统的海马分析集中在培养的单层细胞上，而该协议允许研究人员研究新鲜解剖的组织（特别是视网膜）中的线粒体活性。该技术用于研究遗传性视网膜变性小鼠模型的视网膜中的线粒体活性和糖酵解标志。

它是视网膜研究的有用工具，也有潜力应用于其他类型的组织，以开发潜在的治疗方法。该协议最困难的部分是从新鲜解剖的小鼠视网膜中获得高质量的打孔盘，因此建议将执行此技术的个人具有良好的视网膜解剖技能。在实验前一天，打开传感器盒，向公用板的每个孔中加入一毫升校准培养基。

在37摄氏度的无二氧化碳培养箱中孵育过夜以激活荧光团。在实验当天，从库存中制备稀释复合药物中的测定培养基。在37摄氏度的水浴中加热测定培养基。

按照文本手稿中所述在机器上设置检测程序。打开包含网状嵌件的盒式磁带的盖子。将八微升的涂层混合物移液到每个网状插入物上，然后使用移液器吸头轻轻地将液滴散布在周围，以使包衣混合物均匀地分布在整个网状插入物中。

关闭盒，让网状嵌件在室温下孵育至少25分钟以进行吸收。孵育后，通过将四毫升测定培养基直接移液到插入物上来洗涤网状插入物。轻轻摇动凝胶盒，确保所有网状插入物都用测定介质洗涤。

为了准备视网膜打孔，从成年安乐死小鼠身上摘除眼睛，并将它们放入培养皿中的冰冷PBS中，然后将培养皿置于解剖显微镜下。使用微剪刀切掉视神经，然后小心地去除附着在眼球外的直肠外肌肉。使用30号针，在角膜边缘打一个洞。

然后使用精细解剖微剪刀沿着角膜边缘进行圆形切口。使用锋利的解剖钳，从眼罩中取出角膜，晶状体和玻璃体。使用精细解剖微剪刀在眼罩边缘的巩膜层上做几个小切口。

使用两个锋利的解剖钳抓住每侧的巩膜组织，并非常小心地拉动巩膜层以将其从神经视网膜中取出。在眼罩周围重复此操作，直到切除所有巩膜并得到完整的视网膜罩杯。在视网膜杯上进行径向切口以使其变平，并使用解剖微剪刀产生几个不同的部分。

接下来，使用一毫米直径的活检打孔器，从扁平的视网膜杯的每个部分切下一个视网膜盘。在距视神经头相等的距离处打孔。使用镊子将预涂覆的网状嵌件转移到解剖培养皿中。

在两个超细睫毛刷的帮助下，将视网膜打孔盘放在网状嵌件的中心，神经节细胞层侧面向下接触网状物，感光器层朝上。要加载传感器盒，请将水合的传感器盒板盒从 37 摄氏度培养箱中取出。卸下液压增压器盖后，将传感器盒放回公用设施板上。

通过将移液器吸头以 45 度角固定，将所需体积的注射化合物溶液加载到适当的端口中，将移液器吸头插入注射口的一半，其尖端的斜面靠在注射口的另一壁上。轻轻地将化合物装入每个端口。通过单击开始运行按钮打开机器托盘，将传感器盒装入机器以进行校准。

将传感器盒放入设备中，然后单击"我已准备就绪"按钮开始校准。将所需体积的测定培养基加载到胰岛捕获板的每个孔中。使用镊子，抓住包含视网膜打孔盘的网状嵌件的边缘，并将其从培养皿中取出。

在吸收性擦拭纸上轻轻敲击网状嵌件的底部，以除去多余的液体并将其放入胰岛捕获板的孔中。重复此步骤，直到所有带有视网膜冲头的网格插入物都放入胰岛捕获板中，用空的网格插入物填充背景校正孔和空白孔。使用两个Graefe镊子，小心而轻柔地按压每个网状嵌件的边缘，确保它们牢固地插入胰岛捕获板的底部。

将装载的胰岛捕获板放入37摄氏度的培养箱中五分钟以预热，然后在校准完成后弹出实用程序板。将其替换为含有视网膜冲头的胰岛捕获板，并通过单击称重传感器板按钮恢复测定运行。运行完成后，通过单击弹出按钮弹出包含视网膜打孔的传感器盒和胰岛捕获板，然后单击完成按钮，以便数据自动保存为ASYR文件，并自动更改屏幕以显示结果。

使用新鲜解剖的一毫米视网膜打孔盘进行显示OCR痕量的线粒体应激测定和显示OCR和ECAR痕量的糖酵解速率测定。在线粒体应激测定中，注射Bam15以解耦质子梯度从线粒体ATP产生，导致OCR增加到最大水平。注射鱼藤酮和抗霉素A分别抑制复合物1和复合物3的线粒体呼吸，导致OCR降至最低水平。

OCR的最大水平与基础OCR水平的最后测量之间的差异反映了线粒体储备能力。在糖酵解速率测定中，注射鱼藤酮和抗霉素A可关闭线粒体呼吸并推动糖酵解更高。糖酵解通过注射2-脱氧-d-葡萄糖来抓住，其与葡萄糖竞争己糖激酶结合，导致ECAR降至最低水平。

糖ECAR基础水平最后测量中糖ECAR最大水平之间的差异反映了糖酵解储备能力。为了产生可靠的数据，获得高质量的视网膜打孔盘并将总解剖时间限制在1.5小时内至关重要。在实验之后，人们可以量化孔中视网膜盘蛋白质含量的DNA，并使用它来规范海马数据。

因此，该协议用于研究视网膜的发育，衰老和疾病。还分析了组织对不同燃料底物（如葡萄糖或脂肪酸）的偏好或依赖性。