Name: 时间分辨Förster共振能量转移测定法，用于测量人细胞中的内源性磷酸化STAT蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学习时间分辨Förster共振能量转移测定法，用于定量检测人细胞中内源性磷酸化STAT蛋白。该方法采用384孔板格式，无需洗涤步骤，操作简便快速，适用于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选。

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1. 细胞培养
<ol>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养，使用添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（HeLa和A431细胞）或添加15% FBS的RPMI培养基（U266B1细胞）。培养细胞至融合度达到70-80%，然后用胰蛋白酶消化，传代或用于后续检测。 
	​注意：培养基中含有酚红。在进行检测前，所有细胞系均未进行无血清饥饿处理。</li>
</ol>
2. 使用贴壁细胞双板检测方案进行刺激剂或抑制剂滴定
注意：本实验通过测试化合物的系列稀释浓度生成浓度-反应曲线，以确定刺激剂或抑制剂的效价。
<ol>
	<li>细胞接种
	<ol>
		<li>将细胞以预优化的密度（STAT3 和 STAT6 实验：每孔 40,000 个 HeLa 细胞；STAT5 实验：每孔 75,000 个 A431 细胞）加入适量培养基中，每孔接种 50 µL 至 96 孔组织培养处理板中。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜。 
		​注意：最佳细胞密度和培养孵育时间需自行确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测试化合物的稀释
	<ol>
		<li>在聚丙烯 96 孔板中，用无血清培养基对测试化合物进行连续稀释（半对数间隔稀释），制备成中间浓度为 2 倍的系列稀释液，覆盖 12 个孔。 
		注意：建议至少进行两次重复，采用 12 个浓度点、半对数间隔的浓度-反应曲线，以准确估算 EC50 或 IC50 值。</li>
		<li>或者，对于疏水性、可溶于二甲基亚砜（DMSO）的测试化合物，可先在 100% DMSO 中进行初始稀释，再将该系列稀释液加入无血清培养基中。 
		​注意：在使用 DMSO 作为溶剂进行测试化合物滴定前，必须明确该检测体系对 DMSO 的耐受浓度。需确保处理组与未处理组细胞之间的溶剂浓度相等。此外，在测试化合物系列稀释时，整个稀释系列中的溶剂浓度应始终保持一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞处理
	<ol>
		<li>进行细胞刺激时，向每孔加入 50 µL 仅含无血清培养基的溶液（未处理细胞）或含刺激剂（2 倍浓度）的溶液。</li>
		<li>在预优化的时间内，于室温（RT）或 37 °C 下孵育（STAT3 实验：干扰素（IFN）α2b，室温刺激 20 分钟；STAT5 实验：表皮生长因子（EGF），室温刺激 10 分钟；STAT6 实验：白细胞介素（IL）-4，室温刺激 20 分钟）。随后进入第 2.4 节操作。 
		注意：最佳孵育温度需自行确定。</li>
		<li>进行细胞抑制时，向每孔加入 25 µL 仅含无血清培养基的溶液（未处理细胞）或含抑制剂（4 倍浓度）的溶液。</li>
		<li>在预优化的时间内，于室温或 37 °C 下孵育（STAT3 和 STAT6 实验：JAK 抑制剂 1，室温孵育 30 分钟；STAT5 实验：厄洛替尼，室温孵育 15 分钟）。</li>
		<li>向每孔加入 25 µL 仅含无血清培养基的溶液（未处理细胞）或含刺激剂（4 倍浓度）的溶液，刺激剂浓度为其 EC80 值。</li>
		<li>在预优化的时间内，于室温或 37 °C 下孵育（孵育条件与步骤 2.3.2 相同）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解
	<ol>
		<li>按照制造商说明，配制试剂盒专用的 1 倍补充裂解缓冲液。 
		​注意：必须将 100 倍磷酸酶抑制剂混合液稀释至终浓度为 1 倍，加入 1 倍裂解缓冲液中。1 倍补充裂解缓冲液含有 1 mM 氟化钠、2 mM 原钒酸钠和 2 mM β-甘油磷酸钠。无需添加其他磷酸酶抑制剂，应避免使用。不建议使用试剂盒以外的裂解缓冲液或磷酸酶抑制剂，因其可能含有干扰检测的成分。</li>
		<li>小心吸除并弃去细胞培养基，移除上清液。</li>
		<li>立即向每孔加入 50 µL 1 倍补充裂解缓冲液。 
		注意：裂解缓冲液体积（25–50 µL）可进行优化。</li>
		<li>在室温下振荡孵育 30 分钟（使用轨道振荡器，设定为 400 rpm，中等振荡强度）。 
		​注意：裂解孵育时间（30–60 分钟）可进行优化。裂解产物可立即用于目标蛋白检测，或于 -80 °C 冻存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测
	<ol>
		<li>按照制造商说明，在 1 倍检测缓冲液中配制 4 倍抗体检测混合液。</li>
		<li>在此转移步骤中，小心地将 96 孔培养板中的 15 µL 细胞裂解液移取至白色低体积 384 孔微孔板的对应孔中。</li>
		<li>分别向不同的检测孔中加入 15 µL 阳性对照裂解液和 15 µL 1 倍裂解缓冲液（阴性对照）。</li>
		<li>向每个检测孔中加入 5 μL 4 倍抗体检测混合液（检测磷酸化蛋白时使用 Eu-Ab1/FR-Ab2，检测总蛋白时使用 Eu-Ab3/FR-Ab4）。</li>
		<li>用封板膜覆盖微孔板，并根据具体检测要求在室温下孵育 1 小时至过夜（参见相应的技术数据表）。 
		注意：每种检测和细胞系的最佳读板时间需进行优化。该微孔板可多次读数，不会对检测性能产生负面影响。</li>
		<li>移除粘性封板膜，使用支持 TR-FRET 检测的微孔板读数仪进行读数。 
		​注意：推荐使用滤光片型荧光计，尽管部分单色仪型仪器也可使用。请确认仪器已安装适用于 TR-FRET 检测的光学模块（滤光片和反射镜）。使用 320 nm 或 340 nm 的激发波长激发铕螯合物。分别在 615 nm（或 620 nm）和 665 nm 处读取信号，以同时检测供体铕和受体荧光团的发射光。仪器设置取决于具体的读数仪型号。本文所示数据采用灯源激发，延迟 90 µs，积分时间 300 µs，每孔闪光 100 次。然而，磷酰化 STAT4 检测采用激光激发，以获得更高的信噪比（S/B）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用悬浮细胞的双板测定法进行刺激剂或抑制剂滴定
<ol>
	<li>测试化合物的稀释
	<ol>
		<li>按照步骤 2.2.1 和 2.2.2 中所述方法，制备测试化合物的中间 2 倍稀释系列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞铺板与处理
	<ol>
		<li>将细胞以预优化的密度（STAT1 实验为每孔 200,000 个 U266B1 细胞；STAT4 实验为每孔 400,000 个 U266B1 细胞）悬浮于适当培养基中，每孔加入 20 µL 至 96 孔组织培养处理板中。可直接进行细胞处理，或在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2–4 小时。 
		注意：此步骤需根据不同细胞类型进行优化。</li>
		<li>进行细胞刺激时，单独加入 20 µL 无血清培养基（未处理细胞），或加入含有刺激剂（2x）的无血清培养基。</li>
		<li>在室温或 37 °C 下孵育预优化的时间（STAT1 实验：IFNα2b / 15 分钟，室温；STAT4 实验：IFNα2b / 25 分钟，37 °C）。随后进入第 3.3 节操作。 
		注意：最佳孵育温度需自行确定。</li>
		<li>进行细胞抑制时，单独加入 10 µL 无血清培养基（未处理细胞），或加入含有抑制剂（4x）的无血清培养基。</li>
		<li>在室温或 37 °C 下孵育预优化的时间（JAK Inhibitor 1 / 30 分钟，室温，适用于 STAT1 和 STAT4）。</li>
		<li>单独加入 10 µL 无血清培养基（未处理细胞），或加入含有刺激剂（4x）且浓度为其 EC80 的无血清培养基。</li>
		<li>在室温或 37 °C 下孵育预优化的时间（条件同步骤 3.2.3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解
	<ol>
		<li>根据生产商说明，配制试剂盒专用的 5x 补充裂解缓冲液。 
		注意：必须将 100x 磷酸酶抑制剂混合液稀释至终浓度 5x 后加入 5x 裂解缓冲液中。5x 补充裂解缓冲液含有 5 mM 氟化钠、10 mM 正钒酸钠和 10 mM β-甘油磷酸钠。无需添加其他磷酸酶抑制剂，应避免使用。</li>
		<li>每孔加入 10 µL 5x 补充裂解缓冲液。</li>
		<li>在室温下振荡孵育 30 分钟（使用轨道板式振荡器，设定为 400 rpm，中等强度振荡）。 
		​注意：裂解孵育时间（30–60 分钟）可进行优化。裂解产物可立即用于靶蛋白检测，或于 -80 °C 冻存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测
	<ol>
		<li>细胞裂解后，按照第 2.5 节所述方法，对贴壁细胞的两板法检测方案进行 TR-FRET 检测步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用单板法检测方案对贴壁细胞或悬浮细胞进行刺激剂滴定
<ol>
	<li>待测化合物的稀释
	<ol>
		<li>将待测化合物在聚丙烯96孔板中用无血清培养基进行连续稀释（半对数间隔稀释），配制为3倍浓度的中间稀释系列，覆盖12个孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞铺板与处理
	<ol>
		<li>将8 µL细胞悬液（以预先优化的密度：STAT4检测使用160,000个U266B1细胞/孔；STAT6检测使用80,000个HeLa细胞/孔）加入白色低体积384孔检测板中，所用培养基为相应的无血清培养基。可直接进行细胞处理，或在37 °C、5% CO2条件下孵育2–4小时。 
		注意：不同细胞类型在处理前是否需要孵育需另行确定。</li>
		<li>进行细胞刺激时，向孔中加入4 µL仅含无血清培养基（未处理细胞）或含刺激剂（3倍浓度）的培养基。</li>
		<li>在室温或37 °C下孵育预先优化的时间（STAT4检测：IFNα2b刺激，37 °C孵育25分钟；STAT6检测：IL-4刺激，37 °C孵育20分钟）。随后进入第4.3节操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解
	<ol>
		<li>按照生产商说明配制试剂盒专用的5倍浓缩补充裂解缓冲液。 
		注意：必须将100倍浓缩的磷酸酶抑制剂混合液稀释至终浓度5倍后加入5倍裂解缓冲液中。</li>
		<li>每孔加入3 µL 5倍浓缩补充裂解缓冲液。</li>
		<li>在室温下振荡孵育30分钟（使用轨道振荡器，转速400 rpm）。 
		注意：裂解孵育时间（30–60分钟）可进一步优化。裂解产物可立即使用，或于–80 °C保存冷冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测
	<ol>
		<li>分别向不同的检测孔中加入15 µL阳性对照裂解液（未稀释）和15 µL 1倍浓缩补充裂解缓冲液（阴性对照）。</li>
		<li>向每个检测孔中加入5 µL以1倍检测缓冲液配制的4倍抗体检测混合液（检测磷酸化蛋白时使用Eu-Ab1/FR-Ab2，检测总蛋白时使用Eu-Ab3/FR-Ab4）。</li>
		<li>用封板膜密封微孔板，根据具体检测要求在室温下孵育1小时至过夜。 
		注意：每种检测和细胞系的最佳读板时间需单独优化。该微孔板可多次读数，不会影响检测性能。</li>
		<li>移除粘性封板膜，在支持TR-FRET检测的微孔板读数仪上读取数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>使用以下公式（1）计算每个孔的TR-FRET比值： 
	<img alt="比值公式：(665 nm处的信号)/(615 nm处的信号) × 1,000；光学数据分析。" src="/files/ftp_upload/62915/62915eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> （1） 
	注意：由于TR-FRET信号是以时间分辨模式读取的，通常无需进行背景扣除。如果进行背景扣除，请使用含有1x补充裂解缓冲液的无细胞孔（阴性对照）作为背景。计算无细胞孔的平均TR-FRET比值，然后从每个孔的TR-FRET比值中减去该数值。</li>
	<li>对于浓度-反应曲线，采用四参数逻辑方程（具有可变斜率的S型剂量-反应曲线）并结合1/Y2数据加权法进行非线性回归分析，以获得EC50或IC50值。</li>
	<li>对于Z'因子实验，根据以下公式（2）10分析数据： 
	<img alt="用于评估检测质量的Z'因子公式；高通量筛选的统计评价方法。" src="/files/ftp_upload/62915/62915eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"> （2） 
	其中µ和σ分别为阳性对照（p；刺激细胞）和阴性对照（n；未处理细胞）的均值和标准差。</li>
</ol>

<ol><li>Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+consequences+of+Jak-STAT+signaling+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system.</a> Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).</li>
<li>Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+JAKs+in+cytokine+signaling+and+its+breakdown+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease.</a> Cytokine. 118, 48-63 (2019).</li>
<li>O'Shea, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK-STAT+pathway%3A+impact+on+human+disease+and+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention.</a> Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).</li>
<li>Verhoeven, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+potential+and+controversy+of+targeting+STAT+family+members+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).</li>
<li>Gilda, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+blotting+inaccuracies+with+unverified+antibodies%3A+need+for+a+Western+blotting+minimal+reporting+standard+%28WBMRS%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS).</a> PLoS One. 10 (8), 0135392(2015).</li>
<li>Binder, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+and+utilization+of+the+SureFire+phospho-STAT5+assay+for+a+cell-based+screening+campaign%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).</li>
<li>Ayoub, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+time-resolved+fluorescence-based+assay+to+monitor+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+a+high-throughput+format%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format.</a> Frontiers in Endocrinology. 5, 94(2014).</li>
<li>Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+LanthaScreen+and+beta-lactamase+reporter+assays+for+high-throughput+screening+of+JAK2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).</li>
<li>Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+bioluminescent+immunoassay+to+probe+cellular+signaling+pathway+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation.</a> Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high-throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cell-based+assays+for+cytokine+receptor+signaling%2C+using+an+AlphaScreen+SureFire+assay+format%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format.</a> Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).</li>
<li>Haan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jak1+has+a+dominant+role+over+Jak3+in+signal+transduction+through+%CE%B3c-containing+cytokine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through γc-containing cytokine receptors.</a> Chemistry & Biology. 18 (3), 314-323 (2011).</li>
<li>Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+tyrosine+kinase+inhibitors+on+normal+and+oncogenic+EGFR+signaling+and+downstream+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors.</a> Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+homogeneous+cell-based+kinase+assays+for+JAK2+V617F%3A+SureFire+pSTAT5+and+GeneBLAzer+fluorescence+resonance+energy+transfer+assays%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).</li>
<li>Iversen, P. W., et al. HTS assay validation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIversen%2C+PW+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2012).</li>
<li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8, 3029(2018).</li>
</ol>

竞争利益：Jaime Padros、Mireille Caron 和 Geneviève Chatel 是 BioAuxilium Research 的员工，该公司生产本研究中使用的 THUNDER TR-FRET 检测试剂盒。此外，Jaime Padros 和 Mireille Caron 是 BioAuxilium Research 的股东。这并不影响作者遵守 JoVE 关于共享数据和材料的所有政策。

与传统的磷酸化蛋白分析方法（如蛋白质印迹和基于ELISA的方法）相比，THUNDER TR-FRET细胞检测的工作流程更简单、快速，所需样本量少（15 µL），专为384孔板的高通量筛选（HTS）设计，且高度适用于自动化操作。该检测方案具有良好的灵活性，可轻松适用于中高通量应用。检测可采用双板转移法或单384孔板法进行。在双板转移法中，细胞在一块细胞培养板中接种、处理并裂解，随后将裂解液转移至另一块白色检测板（半面积96孔或384孔板）进行分析。而在单384孔板法中，整个操作流程均在同一孔内完成，无需液体转移步骤。通过按比例减少反应体积，该检测还可轻松适配1536孔板格式。无论采用何种检测方案，仅需配制三种试剂溶液，无需洗涤步骤，且均可按照“仅添加”&#34;addition-only&#34;的流程进行操作，所需人工操作时间极短。
进行任何基于细胞的检测时，一个关键步骤是优化细胞培养和处理条件16。在开展检测前，必须对细胞数量和处理条件进行仔细优化，因为这些关键参数通常因细胞系和磷酸化蛋白的不同而有所差异。优化这些参数有助于最大化检...

JAK/STAT 信号通路在介导细胞对多种细胞因子、干扰素、生长因子及相关分子的反应中发挥关键作用1,2。这些配体与特定细胞表面受体结合后，可激活JAKs，进而通过磷酸化特定酪氨酸残基激活STAT蛋白。STAT蛋白的磷酸化促使其形成二聚体并转位至细胞核内，在核内调控靶基因的转录。STAT家族包含七个成员：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和 STAT6。这些成员在调控细胞生理过程中发挥复杂而重要的作用，包括增殖、分化、凋亡、血管生成以及免疫系统调节。STAT信号通路的异常激活与多种人类疾病相关，尤其是癌症和免疫相关性疾病3,4。因此，在天然细胞信号环境中评估STAT蛋白磷酸化水平的能力，对于基础研究和药物发现均具有重要意义。
迄今为止，用于检测细胞内磷酸化蛋白（包括STAT蛋白）水平的传统方法均为基于抗体的技术，主要包括蛋白质印迹（western blotting）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和磷酸化流式细胞术。这些异质性方法耗时耗力、通量低、易出错，且结果往往不可靠。例如，特异性问题）在蛋白质印迹实验中的情况5相比之下，均相检测所需的实验步骤更少，样本用量更小，且适用于高通量筛选（HTS）。目前已有五种 commercially available 的基于细胞的均相免疫检测平台可用于定量检测细胞裂解液中JAK依赖性的STAT蛋白磷酸化，分别为SureFire、HTRF、LANCE、LanthaScreen和Lumit。这些平台各有优缺点。
SureFire 技术基于发光氧通道技术，该技术利用包被的供体珠和受体珠特异性捕获一对抗体，其中一种抗体被生物素化。当存在磷酸化蛋白时，这两种抗体将供体珠和受体珠拉近至足够近的距离，从而产生化学发光信号6。尽管该技术具有多功能性和高灵敏度，但其成本较高，受培养基中生物素的干扰，对环境温度和光照极为敏感，且需要专用的检测仪器。HTRF 和 LANCE 均基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）技术，该技术采用长寿命的镧系离子复合物（铕或铽螯合物，或铕隐孔剂）作为供体分子，远红荧光染料作为受体分子7。当分别标记有供体或受体分子的两种特异性抗体因结合同一靶蛋白而靠近时，发生荧光共振能量转移（FRET），导致受体荧光增强而供体荧光减弱。这些长寿命的荧光信号可通过时间分辨和比率检测方式测量，以减少检测干扰并提高数据质量。TR-FRET 的其他优势包括不受光照影响、可重复读数以及信号稳定性高。尽管 TR-FRET 因其多功能性、高灵敏度和强稳健性而广泛应用于高通量筛选（HTS），但所有商用 TR-FRET 检测平台价格昂贵，限制了其在学术机构和小型工业实验室中的广泛应用。LanthaScreen 检测同样采用基于 TR-FRET 的读出方式，但依赖于一种经基因工程改造的 U2OS 细胞系，该细胞系稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）与 STAT1 融合蛋白，并结合使用铽标记的磷酸化特异性 STAT1 抗体8。除了在可选信号蛋白方面受限外，该方法还需购买价格昂贵的转染细胞系，从而降低了其适用性，并增加了实验产生假象的可能性。Lumit 是一种通用型生物发光免疫检测平台，利用经化学标记了 NanoLuc 荧光素酶的小型和大型 NanoBit 亚基的二抗（抗小鼠和抗兔）作为检测工具9。两种一抗与靶蛋白结合后，使相应的二抗相互靠近，组装成具有活性的酶，进而产生发光信号。虽然发光信号通常具有高灵敏度和强稳健性，但该方法要求两种一抗必须来自不同物种，限制了实验设计的选择。此外，在复杂样本基质中使用二抗可能容易引起检测干扰。
因此，仍然需要一种可靠、快速且经济实惠的基于细胞的检测平台，用于以适合高通量筛选（HTS）的方式测量个体磷酸化及总STAT蛋白。为满足这一需求，开发了一种基于增强型时间分辨荧光共振能量转移技术（THUNDER）的新型高通量细胞免疫分析平台，旨在实现对细胞裂解液中内源性表达的细胞内蛋白（磷酸化或总蛋白）进行简单、灵敏、稳健且成本效益高的检测。该技术的优势源于具有优异光谱兼容性和强TR-FRET信号的供体/受体FRET配对、经过严格验证的抗体以及优化的裂解缓冲液的结合。这些检测采用夹心免疫分析格式，使用一个简明的三步操作流程（图1）。首先对细胞进行处理以调节蛋白磷酸化水平，然后使用试剂盒中提供的特异性裂解缓冲液裂解细胞。细胞裂解液中的目标磷酸化或总STAT蛋白通过一步试剂添加和孵育即可检测，该步骤使用一对可识别目标蛋白上不同表位的荧光标记抗体（图2）。其中一种抗体标记有铕螯合物供体（Eu-Ab1），另一种抗体则标记有远红区受体荧光团（FR-Ab2）。这两种标记抗体在溶液中结合到目标蛋白上，使两个标记物彼此靠近。在320 nm或340 nm激发铕螯合物供体后，可触发向受体的能量转移（FRET），受体在665 nm处发射出寿命较长的TR-FRET信号，其强度与细胞裂解液中目标蛋白（磷酸化或总蛋白）的浓度成正比。
<img alt="细胞检测流程图：细胞处理、细胞裂解、蛋白质检测；TR-FRET分析步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：TR-FRET检测工作流程。 该工作流程包括三个步骤：细胞处理、细胞裂解和基于TR-FRET的蛋白质检测。在双板检测方案中，裂解液被转移至白色384孔检测板中；而在单板检测方案中，所有步骤均在同一块白色384孔检测板中完成（即“单孔一体化”方案）。无论采用何种检测方案，蛋白质检测的总体积均保持一致（每孔20 µL）。缩写：TR-FRET = 时间分辨 Förster 偿能共振能量转移。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示在320-340 nm激发，615 nm和665 nm发射的TR-FRET示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：TR-FRET夹心免疫分析原理。其中一种抗体标记铕螯合物作为供体（Eu-Ab1），另一种抗体标记远红光小分子荧光受体（FR-Ab2）。这两种标记抗体特异性结合细胞裂解液中靶蛋白（磷酸化或总蛋白）上的不同表位，使两个荧光基团彼此靠近。在320 nm或340 nm激发供体铕螯合物后，能量通过FRET从供体传递至受体分子，受体随之在665 nm处发射信号。该信号强度与细胞裂解液中蛋白浓度成正比。若无特异性靶蛋白存在，供体与受体荧光基团相距过远，无法发生FRET。缩写：FRET = Förster共振能量转移；TR-FRET = 时间分辨FRET；Ab = 抗体；FR = 远红光；Eu = 铕螯合物；P = 磷酸化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
本文提供了使用THUNDER TR-FRET平台，在384孔板体系中检测贴壁或悬浮细胞裂解液内磷酸化STAT1（Y701）、STAT3（Y705）、STAT4（Y693）、STAT5（Y694/Y699）和STAT6（Y641）以及总STAT1、STAT3、STAT5和STAT6水平的详细实验方案。这些方案包括细胞处理、裂解以及基于TR-FRET技术的目标蛋白检测步骤，可采用两板转移法或单板全孔一步法进行操作。这些基于细胞的检测方法可用于确定JAK/STAT信号通路已知激活剂和抑制剂的药理学特征。文中还验证了所选检测方法在高通量筛选（HTS）中的稳健性和适用性。最后，讨论了检测优化的关键实验，并提出了检测故障排查的相关建议。

<table><tbody><tr><td>96孔微孔板，透明，平底，聚苯乙烯，组织培养处理，无菌</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>在使用双板检测方案时用于细胞培养。也可使用其他细胞培养用96孔板</td></tr><tr><td>384孔微孔板，白色，低体积</td><td>PerkinElmer</td><td>6007290</td><td>在使用双板或单板检测方案时用于TR-FRET检测。也可使用其他低体积白色384孔板</td></tr><tr><td>A431细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>粘性微孔板封板膜</td><td>PerkinElmer</td><td>6050185</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D159-4</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s改良Eagle培养基（DMEM）</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL&amp;nbsp;</td><td>THUNDER TR-FRET兼容含酚红的培养基</td></tr><tr><td>EnVision Xcite多功能微孔板检测仪</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0020A</td><td>该检测可在配备TR-FRET功能的各种微孔板检测仪上进行</td></tr><tr><td>盐酸厄洛替尼</td><td>Sigma</td><td>CDS022564</td><td></td></tr><tr><td>Falcon组织培养处理细胞培养瓶</td><td>Fisher</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Wisent</td><td>098-150</td><td></td></tr><tr><td>HeLa细胞系</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>JAK抑制剂1</td><td>Cayman Chemical</td><td>15146</td><td></td></tr><tr><td>轨道微孔板振荡器</td><td>多种选择可用</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>重组人EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>重组人IFN&amp;alpha;2b</td><td>ProSpec</td><td>CYT-460</td><td></td></tr><tr><td>重组人IL-4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>204-IL</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（RPMI）</td><td>Wisent</td><td>350-007-CL</td><td>THUNDER TR-FRET兼容含酚红的培养基</td></tr><tr><td>THUNDER 磷酸化STAT1 (Y701) + 总STAT1 TR-FRET细胞信号检测试剂盒</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT1PT-500</td><td></td></tr><tr><td>THUNDER 磷酸化STAT3 (Y705) + 总STAT3 TR-FRET细胞信号检测试剂盒</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT3PT-500</td><td></td></tr><tr><td>THUNDER 磷酸化STAT4 (Y693) TR-FRET细胞信号检测试剂盒</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT4P-500</td><td></td></tr><tr><td>THUNDER 磷酸化STAT5 (Y694/Y699) + 总STAT5 TR-FRET细胞信号检测试剂盒</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT5PT-500</td><td></td></tr><tr><td>THUNDER 磷酸化STAT6 (Y641) + 总STAT6 TR-FRET细胞信号检测试剂盒</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT6PT-500</td><td></td></tr><tr><td>0.05%胰蛋白酶/EDTA</td><td>Wisent</td><td>325-542-CL</td><td></td></tr><tr><td>U266B1细胞系</td><td>ATCC</td><td>TIB-196</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>NA</td><td>NA</td><td>使用Milli-Q级水（18 M&amp;Omega;.cm）稀释裂解缓冲液和检测缓冲液</td></tr></tbody></table>

时间分辨förster共振能量转移检测法用于测定人细胞内源性磷酸化stat蛋白

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Janus激酶（JAK）/信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路在介导细胞对细胞因子和生长因子的反应中发挥关键作用。STAT蛋白主要通过JAK介导的酪氨酸磷酸化而被激活。STAT信号通路的异常激活与多种人类疾病相关，尤其是癌症和免疫相关性疾病。因此，在天然细胞信号环境中监测STAT蛋白磷酸化的能力，对于学术研究和药物发现均具有重要意义。目前用于定量磷酸化STAT蛋白的传统检测方法包括蛋白质印迹法（western blotting）和酶联免疫吸附测定（ELISA）。这些非均相方法操作繁琐、通量低，且蛋白质印迹法常常缺乏可靠性（特异性）。虽然已有均相（免洗涤）检测方法，但成本仍然较高。
本文提供了在384孔板中利用新型THUNDER时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）平台，对贴壁细胞或悬浮细胞裂解液中内源性磷酸化STAT1（Y701）、STAT3（Y705）、STAT4（Y693）、STAT5（Y694/Y699）和STAT6（Y641）水平进行高灵敏度、高稳健性且成本效益优良的检测的详细实验方案。该细胞检测流程简单、快速，专为高通量筛选（HTS）设计。实验方案具有灵活性，仅需少量样本（15 µL），仅需一步试剂添加，且可适用于低通量和高通量应用。每种磷酸化STAT蛋白夹心免疫检测均在优化条件下使用已知激动剂和抑制剂进行验证，能够产生预期的药理学结果和Z'因子值。由于TR-FRET检测为比率型检测且无需洗涤步骤，其重复性显著优于传统方法。综上，这一系列检测方法为细胞处理后特异性磷酸化STAT蛋白的更全面分析，以及JAK/STAT信号通路特异性和选择性调节剂的筛选与表征，提供了新的高性价比工具。

每项THUNDER TR-FRET检测均通过使用JAK/STAT通路特异性激活剂或抑制剂处理贴壁细胞（HeLa或A431）或悬浮细胞（U266B1），并在适用情况下检测特定磷酸化及总STAT蛋白水平，进行药理学验证。检测采用384孔板格式，使用双板转移方案及预优化的检测条件进行。图3、图4、图5、图6和图7总结了所有STAT检测获得的代表性浓度-反应曲线。总体而言，各磷酸化STAT检测的激动剂和抑制剂浓度-反应曲线均表现出强烈的TR-FRET信号、宽动态范围、低孔间变异系数（通常≤5%）以及可接受的信号-背景比（S/B）。本文报告的EC50和IC50值均处于预期范围之内。
使用JAK激活剂IFNα2b（磷酸化STAT1、磷酸化STAT3和磷酸化...

本文描述了基于时间分辨荧光共振能量转移（Förster resonance energy transfer）的细胞实验方案，可用于在384孔板体系中对细胞裂解液内源性磷酸化信号转导与转录激活蛋白（STAT）1/3/4/5/6进行简便、特异、灵敏且稳定的定量检测。

时间分辨Förster共振能量转移检测法用于测定人细胞内源性磷酸化STAT蛋白

Janus激酶（JAK）/信号转导与转录激活因子（STAT）信号通路在介导细胞对……的反应中发挥关键作用

基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的检测方法为筛选和药理学表征JAK/STAT信号通路的特异性与选择性调节剂提供了新的高性价比工具。该技术比传统的Western blot和ELISA方法更为简便、快速、可重复且稳健。实验过程中无需洗涤步骤，试剂可一次性加入。只要具备特异性抗体，该免疫测定平台便可轻松应用于其他细胞信号蛋白。为了设计出可重复的实验方案，必须遵循良好的细胞培养规范，并建立标准操作程序。此外，还需仔细优化细胞培养和处理条件。本实验操作将由本实验室的科学家 Genevieve Chatel 演示。首先，在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中，使用添加了10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养HeLa和A431细胞。当细胞融合度达到70%至80%时，用胰蛋白酶消化细胞，随后进行传代或直接用于实验分析。进行检测时，将预优化密度的细胞以50微升体积加入含适当培养基的96孔组织培养处理板中，然后在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育过夜。次日，在聚丙烯96孔板的12个孔中，用无血清培养基对测试化合物进行连续倍比和四倍稀释，制备中间稀释系列。对于细胞刺激，加入50微升含有刺激剂（2倍浓度）的无血清培养基，然后将细胞在室温或37摄氏度下孵育预优化的时间。进行细胞抑制时，加入25微升含有抑制剂的无血清培养基（抑制剂浓度为4倍浓度），在室温或37摄氏度下孵育预优化的时间。随后，加入25微升含有刺激剂的无血清培养基（刺激剂浓度为4倍浓度），并按照预优化的时间进行孵育。接下来，为裂解细胞，配制1X添加型裂解缓冲液，并向其中加入磷酸酶抑制剂混合物。小心移除并弃去细胞培养基后，立即加入50微升已配制的1X添加型裂解缓冲液，在室温下以中等振荡速度摇动孵育30分钟。对于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测，先在1×检测缓冲液中配制4×抗体检测混合液，然后分别在1×检测缓冲液中配制EUAB1与FRAB2抗体溶液，以及EUAB3与FRAB4抗体溶液。最后，将预稀释的EUAB1与预稀释的FRAB2混合用于磷酸化蛋白的检测，将预稀释的EUAB3与预稀释的FRAB4混合用于总蛋白的检测。随后，小心地将96孔培养板中的15微升细胞裂解液转移至白色低体积384孔微孔板的一个孔中。接下来，将15 µL的阳性对照裂解液和15 µL的1×裂解缓冲液分别加入不同的检测孔中，后者作为阴性对照。向含有15 µL裂解液的孔中加入5 µL相应的4×抗体检测混合液，用于检测磷酸化蛋白或总蛋白。用酶标板封板膜封板后，根据检测试剂盒的要求，在室温下孵育1小时至过夜。孵育完成后，移除粘性板封膜，使用支持时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的酶标仪读取微孔板。采用浓度-反应曲线表示在U266B1细胞中检测和定量磷酸化STAT1与总STAT1、磷酸化STAT4，以及在A431细胞中检测

time-resolved-frster-resonance-energy-transfer-assays-for-measurement

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

时间分辨Förster共振能量转移测定法，用于测量人细胞中的内源性磷酸化STAT蛋白

基于FRET的报告分子正越来越多地用于监测活细胞中激酶和磷酸酶的活性。本文介绍了一种利用基于FRET的报告分子评估细胞周期依赖性靶蛋白磷酸化变化的方法。...

通过比率型FRET监测细胞周期中的激酶与磷酸酶活性

本文描述了一种涉及FRET（福斯特共振能量转移）信号定量分析的新方法，用于研究酶动力学。通过该方法获得了SENP1（SUMO/Sentrin特异性蛋白酶1）催化结构域对pre-SUMO1（小泛素样修饰蛋白1）水解反应的KM和kcat值。这种基于定量FRET的蛋白酶动力学研究的一般原理可应用于其他蛋白酶的研究。...

定量FRET（Förster共振能量转移）分析用于SENP1蛋白酶动力学测定

本视频介绍了利用标记有供体和受体荧光基团的特异性抗体，通过时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测法来测定内源性蛋白质磷酸化水平。该技术旨在检测细胞裂解液中目标蛋白的磷酸化状态。...

时间分辨福斯特共振能量转移法用于监测细胞内蛋白质磷酸化

富含亮氨酸重复序列的激酶1和2（LRRK1和LRRK2）是具有多个结构域的蛋白质，包含GTP酶和激酶结构域，并可在细胞内发生磷酸化。本文中，我们介绍一种在细胞中使用32P正磷酸盐标记LRRK1和LRRK2的实验方案，从而提供一种检测其在细胞内总体磷酸化水平的方法。...

富含亮氨酸重复序列激酶1和2的放射性磷酸盐代谢标记

微量热泳（MST）可广泛用于测定结合亲和力，而无需从细胞裂解液中纯化目标蛋白。该方案包括在非变性条件下过表达GFP融合蛋白、裂解细胞，并在不同浓度配体存在下检测MST信号。...

无需蛋白质纯化的微量热泳动结合亲和力测定方法

本文介绍了一种能够对IRF3转录因子的磷酸化依赖性激活进行详细分析的实验方法。该方法结合了高分辨率SDS-PAGE和天然PAGE，并利用多种磷酸化特异性抗体进行免疫印迹分析，从而实现对IRF3活化状态的精确检测。...

一种监测IRF3磷酸化依赖性激活的高分辨率方法

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SorLA 和 CLC:CLF-1 依赖性下调 CNTFRα 的机制研究：通过蛋白质印迹、溶酶体酶抑制及免疫细胞化学方法验证

肽竞争实验在多种分子和免疫学实验中被广泛应用。本文描述了一种详细的肽竞争实验方法 体外...

寡肽竞争法测定磷酸化位点

由于基于 Förster 共振能量转移（FRET）的传感器本身信噪比（SNR）较低，cAMP 信号的测量一直具有挑战性，尤其是在三维空间中。本文介绍了一种高光谱 FRET 成像与分析方法，可实现三维空间内 cAMP...

使用四维（x, y, z 和 &lambda;）高光谱FRET成像与分析技术测量活细胞中三维cAMP分布

本方案描述了利用改进的单分子下拉（SiMPull）实验对蛋白质磷酸化进行定量的样品制备与数据分析方法。...

一种优化的单分子下拉检测法用于蛋白质磷酸化定量

本文介绍了一种用于定量活体HepG2细胞中Akt激活及其磷酸化时空动态的实验方案。荧光共振能量转移（FRET）成像是一种强大的工具，可为癌细胞中胰岛素信号通路及代谢调控提供重要见解。...

活细胞中代谢调控的Akt活化动态的Förster共振能量转移成像研究

学习时间分辨Förster共振能量转移测定法，用于定量检测人细胞中内源性磷酸化STAT蛋白。该方法采用384孔板格式，无需洗涤步骤，操作简便快速，适用于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选。

时间分辨Förster共振能量转移检测法用于测定人细胞内源性磷酸化STAT蛋白

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