成像线粒体 Ca²⁺ 星形胶质细胞和神经元中利用基因编码Ca探针检测摄取²⁺ 指示剂（GECIs）

示范该实验操作的人员为研究生 Zhe Zhang、研究专家 Nannan Zhang，以及 Ozden Illker 教授和 Ding Shinghua 教授。本实验的总体目标是建立细胞类型特异性的星形胶质细胞与神经元配对方法，以及用于体外和体内线粒体成像计数的线粒体靶向技术，该技术基于基因编码的钙离子指示剂 GCaMP5G 和 6s。对于体外或体内成像，我们将构建包含星形胶质细胞或神经元特异性启动子 gfaABC1D 或 CaMKII 的 DNA 质粒，以及带有线粒体靶向序列的基因编码钙离子指示剂 GCaMP5G/6s。

对于体外线粒体钙成像，我们采用脂质体转染法（Lipofectamine method），将前述DNA质粒转染至培养在玻璃盖玻片上的星形胶质细胞和神经元中。转染后一至两天，可将玻璃盖玻片转移至落射荧光显微镜或双光子显微镜的灌流腔室中，开始成像。左侧示例显示表达GCaMP6s的星形胶质细胞及其线粒体的荧光信号，右侧示例显示表达GCaMP5G的神经元中线粒体的荧光信号。

为了进行活体成像，我们制备了血清型5腺相关病毒以在星形胶质细胞中表达mito-GCaMP5G，并制备了血清型9腺相关病毒以在神经元中表达mito-GCaMP6s。进行立体定位病毒注射手术时，我们首先使用3%异氟烷对小鼠进行麻醉。在后续手术过程中，异氟烷浓度降低至2%。当达到适当的麻醉深度后，剃除头皮区域的毛发，并将小鼠固定于立体定位仪上。

手术期间使用眼膏保护眼睛。注射手术需采用无菌操作技术，包括使用无菌器械和无菌操作方法。手术器械可通过高压灭菌器或干热灭菌器进行灭菌。

将小鼠固定在立体定位仪上后，使用碘伏和70%乙醇对头皮进行三次清洁。然后沿前囟-后囟轴切开皮肤，并使用高速钻头在目标位置钻出垂直孔道。在本研究中，我们的靶区为运动皮层或旁皮层。

将携带相关腺病毒载体的33号Hamilton注射器通过孔洞插入脑内，并在目标区域注射载体。对于皮层递送，我们在多个步骤中于两个深度注射病毒溶液。首先，将针头插入皮层深度一毫米处。

在给予大脑五分钟恢复时间后，我们将针头上移至深度700微米处，注入500纳升病毒溶液。注射完成后，等待五分钟，使病毒在大脑中充分扩散。随后，将针头上移至第二个注射位置，深度为300微米。

在此，我们再注入 500 纳升病毒溶液。注射完成后，等待 10 分钟以使病毒充分扩散，随后将针头从脑组织中撤出，并用骨蜡或 Kwik-Sil 封闭颅骨钻孔。最后，使用 Vetbond 缝合皮肤，将小鼠置于加热垫上恢复，之后送回动物饲养设施。

小鼠至少需要三周时间方可用于活体成像，此时间为 GCaMP 表达成熟的所需时长。颅窗植入手术也需在无菌条件下进行，无菌操作步骤与注射手术所述相同。颅窗手术的操作流程与注射手术完全一致，直至暴露颅骨步骤为止。

暴露颅骨后，使用连接在操纵器上的高速钻头在病毒注射区域的颅骨上打出四个浅孔，标记出直径为2-3 mm开颅窗的四个象限。然后，通过小心而缓慢地沿圆形轨迹钻削骨质，将开颅窗沟槽之间的颅骨部分逐渐磨薄，直至连接这四个浅孔。当边缘处的颅骨足够薄时，用尖头镊子轻轻提起并移除骨片。

暴露的硬脑膜可根据需要在颅窗植入时去除或保持完整。我们的颅窗由直径为3-5毫米的玻璃盖玻片组成，在中心处形成一个约300微米厚的硅胶圆盘。颅窗的安装通过将其覆盖在颅骨开孔处完成。

使用连接在操纵器上的一根牙签轻轻将颅窗推压至脑表面。然后，用少量硅胶粘合剂Kwik-Sil密封颅窗边缘。最后，用牙科丙烯酸树脂将颅窗固定于颅骨边缘。

在将牙科丙烯酸树脂涂抹于颅窗边缘时应格外小心，以确保牢固粘合。与其他许多研究团队过去采用的方法类似，可在盖玻片与脑组织之间使用1.2%琼脂糖凝胶作为硅胶圆盘的替代方案。颅窗稳固安装后，将一块金属板固定于颅骨上。

该头板将用于在成像过程中，将小鼠头部固定在双光子显微镜的载物台上。在人工脑脊液中，通过灌流系统施加ATD可诱导星形胶质细胞线粒体摄取钙离子，而施加谷氨酸和甘氨酸可诱导神经元线粒体摄取钙离子。随后可观察星形胶质细胞和神经元中单个线粒体的钙离子摄取情况。

以下视频显示了左侧由ATP诱导的星形胶质细胞中的线粒体钙离子摄取，以及右侧由谷氨酸和甘氨酸诱导的神经元中的线粒体钙离子摄取。成像是通过使用Prairie Technologies公司的Ultima双光子显微系统，结合Coherent公司的百万级Ti:蓝宝石Ultra one激光器，采集星形胶质细胞和神经元中线粒体荧光信号的活体时间序列双光子图像实现的。我们采用880至910纳米的激发波长，该波长范围最适合使用GCaMP5G和6s进行活体成像。

通过星形胶质细胞和神经元特异性表达 mito-GCaMP5G 以及 6s，并结合星形胶质细胞特异性标记物 SR101 或神经元特异性标志物 NeuN 的共定位结果进行验证。利用双光子显微镜进行时间推移成像，可观察到活体中星形胶质细胞和神经元内线粒体钙离子的自发性摄取。图像显示左侧星形胶质细胞和右侧神经元中单个线粒体内的自发性钙离子水平升高。

我们的方法可用于体外和体内细胞类型特异性的线粒体钙成像。观看本视频后，您应能够充分理解如何对星形胶质细胞和神经元中的线粒体钙摄取进行成像。