使用微电极阵列记录脊髓伤害性感觉回路中的网络活动

向您介绍的MEA 4-AP脊髓切片制备方法为研究背角环路的连接性以及这些网络在脊髓感觉信息处理过程中的相互作用提供了一个平台。所展示的方法能够以宏观区域分辨率来研究背角环路的活动。该制备方法可作为快速筛选工具，用于评估化合物干扰脊髓感觉环路信号传导的能力。

该方法有助于弥补我们对特定细胞类型和微小神经环路的活动如何影响大量神经元群体，进而调控脊髓背角行为反应以及最终痛觉体验的理解空白。首先，用马血清填充MEA孔，孵育30分钟。移除血清后，用蒸馏水彻底冲洗MEA五次，每次均需更换蒸馏水，直至蒸馏水不再产生泡沫为止。

然后，用人工脑脊液填充小室。将麻醉的小鼠断头后，在髋部水平的腹部皮肤上做一小切口，去除腹部区域的皮肤。然后，将切口两侧的皮肤向头侧方向牵拉，直至从胸廓顶部到骨盆顶部的腹侧和背侧皮肤全部去除。

将尸体置于冰上后，采用腹侧入路，通过去除内脏并沿胸骨侧方剪断肋骨来暴露脊柱。去除腹侧肋骨笼、双侧肩胛骨以及下肢和骨盆。将脊柱及肋骨标本转移至含有冰冷蔗糖人工脑脊液的解剖浴槽中。

用大头针穿过下背部肌肉及附着的上部肋骨，将标本的四个角固定。使用咬骨钳去除覆盖在椎体腹侧表面的所有肌肉和结缔组织，并确定位于腰骶膨大区域对应的椎体部位，该部位大约在 T12-L2 椎体下方。在腰骶膨大区域尾侧去除一个椎体，以暴露位于椎管内的脊髓。

使用弯头弹簧剪，在抬起并向前牵拉椎体的同时，双侧剪断椎弓根，以分离椎骨的腹侧与背侧结构，暴露脊髓。当去除椎体以显露腰骶膨大后，用弹簧剪仔细清除固定脊髓的残余神经根，直至脊髓游离。在腰骶膨大上方和下方分别进行头端和尾端切断，将目标节段的脊髓游离出来。

对于横切面切片，将附有神经根的腰骶段提起并放置在预先切割好的聚苯乙烯块上，该聚苯乙烯块中央设有浅槽。然后使用氰基丙烯酸酯粘合剂将该块体与脊髓固定在切片平台上，并将其置于含有冰冷蔗糖人工脑脊液悬液的切片浴中。获得厚度为300 µm的切片后，将切片转移至含有氧合人工脑脊液的气液界面培养室中，在室温下孵育1小时，使其达到平衡状态。

开始记录背角活动时，使用装有人工脑脊液的大口径巴斯德移液管将脑片从孵育箱转移至MEA小室，并添加额外的人工脑脊液。用精细的短毛画笔将脑片调整至60通道电极记录阵列上方的位置。然后，将一个带重物的网格固定在组织上，以保持其位置并促进脑片与MEA电极的良好接触。

将MEA放置在记录头阶段。使用倒置显微镜检查组织在电极上的位置，以确认尽可能多的电极位于浅层背角下方。确保至少有2至6个电极不与脑片接触。连接相机至设备后，拍摄脑片相对于MEA的参考图像，供分析时使用。

然后，在记录软件中点击启动 DAQ，并确认所有电极均接收到清晰的信号。接着，将灌流系统的进液管和出液管连接至已加入人工脑脊液的 MEA 记录孔中，并开启灌流系统。检查流速，确保出液流量充足，以防止灌流液溢出。

组织平衡5分钟后，记录5分钟的原始基线数据。将灌注进液管从人工脑脊液切换至4-氨基吡啶溶液，并等待12分钟，使4-氨基吡啶诱导的节律性活动达到稳态。随后，记录5分钟的4-氨基吡啶诱导活动，并准备进行后续记录，以测试药物作用或检测4-氨基吡啶诱导活动的稳定性。

每次记录结束后，用人工脑脊液冲洗管路。将MEA从记录头阶段取出，并从MEA孔中移出网片和脑片后，用人工脑脊液冲洗MEA和网片，并用新的脑片重复整个过程。打开分析软件，加载预先制作好的分析布局。

打开目标文件，取消选择参考电极以及任何被认为噪声过大的电极。设置分析的时间窗口，然后切换到跨通道滤波选项卡。

根据实验过程中拍摄的图像和记录的笔记，选择复合参考电极和参考电极，然后点击“Explore”继续。切换到EAP滤波标签页，应用二阶高通Butterworth滤波器以去除LFP活动。切换到LFP滤波标签页，应用二阶带通Butterworth滤波器以去除EAP活动。

在EAP检测器选项卡中，确保选择自动阈值，勾选上升沿和下降沿选项，并将死区时间设置为三毫秒。为设置正负阈值，请返回原始数据分​​析界面，移动时间标记，再返回EAP检测器选项卡，然后按“探索”按钮。重复此过程，直至设定的检测阈值能够捕获EAP信号，同时避免捕获噪声或非生理活动信号。

在 LFP 检测器选项卡中，确保选择手动阈值，勾选上升沿和下降沿选项，并将死区时间设置为三毫秒。设置一个电极的阈值，待满意后，选择“应用到所有”，然后点击开始分析。通过浴槽施加电压门控钠通道拮抗剂河豚毒素后，EAP 和 LFP 活性均被消除，证实了这些信号对尖峰放电的依赖性。

通过比较4-氨基吡啶给药后12分钟和15分钟时4-氨基吡啶诱导的活动参数，表征了EAP或LFP活动参数的稳定性。所有活动特征以及LFP活动的一致性均保持稳定。该特征表现为在多个电极上检测到的同步事件数量增加。

连接的相邻电极数量，以及在4-氨基吡啶刺激后相邻电极与局部场电位（LFP）之间连接强度的变化及其随后的相对稳定性。脑片方向是体外制备中需要重点考虑的因素。无论脑片方向如何，4-氨基吡啶刺激均在脊髓背角（SDH）诱导出相似的节律性活动。

最后，为了进一步阐明4-氨基吡啶激活背角（DH）网络的相关性，采用高钾人工脑脊液进行灌流，结果显示其引发的背角反应与4-氨基吡啶刺激相似。该实验方案中的关键步骤包括组织制备和切片放置：通过细致且及时的解剖确保组织活性，以及将组织精准地置于微电极阵列（MEA）上的最佳位置，这些都有助于获得高质量的实验结果。