Name: 使用微电极阵列记录脊髓伤害感受回路中的网络活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学习使用微电极阵列记录小鼠脊髓背角网络活动的方法，通过4-氨基吡啶化学刺激诱导节律性神经活动。该技术为研究脊髓感觉处理和筛选镇痛化合物提供了高分辨率平台。

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本工作由澳大利亚国家卫生与医学研究理事会（NHMRC）（资助号 631000、1043933、1144638 和 1184974，授予 B.A.G. 和 R.J.C.）以及亨特医学研究所（资助号授予 B.A.G. 和 R.J.C.）提供资金支持。

<ol><li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+positive+neurons+form+an+excitatory+amplifier+network+in+the+spinal+cord+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn.</a> eLife. 8, 49190(2019).</li>
<li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+calretinin-expressing+neurons+in+the+mouse+superficial+dorsal+horn%3A+implications+for+spinal+pain+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing.</a> The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).</li>
<li>Boyle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+spinal+microcircuit+that+gates+myelinated+afferent+input%3A+Implications+for+tactile+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia.</a> Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).</li>
<li>Browne, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+cross-referencing+of+inhibitory+and+excitatory+interneuron+populations+to+dissect+neuronal+heterogeneity+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32(2020).</li>
<li>Graham, B. A., Hughes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewards%2C+perils+and+pitfalls+of+untangling+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits.</a> Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Hughes, D. I., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+targets%3A+inhibitory+interneurons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord.</a> Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itch+and+neuropathis+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Itch and neuropathis itch.</a> Pain. 159 (3), 603(2018).</li>
<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+involved+in+touch-evoked+dynamic+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain.</a> Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).</li>
<li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+allodynia+circuitry+in+the+dorsal+horn+is+defined+by+the+nature+of+the+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury.</a> Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+dissection+of+the+role+of+somatostatin+in+itch+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain.</a> Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).</li>
<li>Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+neuronal+function+through+microelectrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Revealing neuronal function through microelectrode array recordings.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2015).</li>
<li>Nam, Y., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microelectrode+array+technology+and+neural+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro microelectrode array technology and neural recordings.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).</li>
<li>Johnstone, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+arrays%3A+a+physiologically+based+neurotoxicity+testing+platform+for+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century.</a> Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).</li>
<li>Stett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+application+of+microelectrode+arrays+in+drug+discovery+and+basic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+and+recent+development+of+the+microelectrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs).</a> Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854(2020).</li>
<li>Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+activity+induced+by+4-aminopyridine+in+rat+dorsal+horn+in+vitro+is+mediated+by+both+chemical+and+electrical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses.</a> The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).</li>
<li>Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+in+rat+spinal+dorsal+horn+in+vitro+has+common+features+with+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain.</a> Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).</li>
<li>Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Cx36+and+Cx43+in+4-aminopyridine-induced+rhythmic+activity+in+the+spinal+nociceptive+dorsal+horn%3A+an+electrophysiological+study+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro.</a> Physiological Reports. 4 (14), 12852(2016).</li>
<li>Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+4-aminopyridine+on+synaptic+transmission+in+the+cat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord.</a> Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).</li>
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<li>Satuvuori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measures+of+spike+train+synchrony+for+data+with+multiple+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales.</a> Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).</li>
<li>Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+local+field+potentials+of+dissociated+cultures+grown+on+multi-electrode+arrays+for+pharmacological+assays%5BTitle%5D)+AND+%2238th+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays.</a> 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).</li>
<li>Hughes, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+neurochemical+and+electrophysiological+features+of+parvalbumin-expressing+cells%3A+a+likely+source+of+axo-axonic+inputs+in+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).</li>
<li>Peirs, C., Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+for+pain%3A+recent+advances+and+current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural circuits for pain: recent advances and current views.</a> Science. 354 (6312), 578-584 (2016).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+membrane+excitability+in+rat+spinal+lamina+I+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+neurons+within+newborn+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).</li>
<li>Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+rhythmic+nociceptive+and+non-nociceptive+spinal+dorsal+horn+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat.</a> Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).</li>
<li>Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+classification+of+spontaneous+discharges+in+mouse+superficial+dorsal+horn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).</li>
<li>Antonio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.+al.+In+vitro+seizure+like+events+and+changes+in+ionic+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).</li>
<li>Avoli, M., Jefferys, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+drug-induced+epileptiform+synchronization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).</li>
<li>Taccola, G., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+micromolar+concentrations+of+4-aminopyridine+facilitate+fictive+locomotion+expressed+by+the+rat+spinal+cord+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro.</a> Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+monitoring+of+spiking+networks+in+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices.</a> Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

尽管脊髓背角（DH）在伤害性信号的传递、信息处理以及形成疼痛相关的行为和情绪反应中具有重要作用，但该区域内的神经环路仍远未被充分阐明。研究这一问题的关键挑战在于构成这些环路的神经元群体具有高度异质性6,31,32。近年来，以光遗传学和化学遗传学为代表的转基因技术取得了进展，正逐步揭示这些重要的神经连接，并定义处理感觉信息的微环路1,2,3,4,8,9,10,<sup cl...

脊髓背角中特定类型抑制性和兴奋性中间神经元的作用正在被快速揭示1,2,3,4中间神经元共同构成了背角（DH）中超过95%的神经元，参与包括伤害性感受在内的感觉信息处理。此外，这些中间神经元环路在决定外周信号是否沿神经轴上行传递至大脑并产生痛觉感知方面具有重要作用。5,6,7迄今为止，大多数研究通过结合单细胞或整体生物水平的分析方法，探讨了DH神经元的作用 体外 细胞内电生理学、神经解剖学标记和 体内 行为学分析1,3,8,9,10,11,12,13,14这些方法极大地推进了人们对特定神经元群体在疼痛处理中作用的理解。然而，在理解特定细胞类型和小型大环路如何在微环路水平上影响大量神经元，进而调控背角的输出、行为反应及疼痛体验方面，仍存在研究空白。
一种可用于研究宏观回路或多层次细胞功能的技术是微电极阵列（microelectrode array, MEA）15,16。几十年来，MEA 已被用于研究神经系统功能17,18。在脑组织中，该技术促进了神经元发育、突触可塑性、药理学筛选以及毒性检测等方面的研究17,18。根据 MEA 的类型，其既可用于体外（in vitro）也可用于体内（in vivo）应用。此外，MEA 技术发展迅速，目前已可提供多种不同电极数量和排列方式的阵列19。MEA 的一个关键优势在于，可通过多个电极以高空间和时间精度同时记录大量神经元的电活动15,16。这使得研究人员能够在控制条件以及局部施加化合物的情况下，更全面地观察神经元在回路和网络中的相互作用。 
一个挑战是 体外 DH 制备的一个问题是持续的活动水平通常较低。在此，通过使用电压门控 K 通道，在脊髓 DH 电路中解决了这一挑战。+ 通道阻滞剂4-氨基吡啶（4-AP），用于化学激活背角环路。该药物既往已被用于在急性脊髓切片中诱导背角产生节律性同步电活动，并在急性条件下应用 体内 条件20,21,22,23,24这些实验采用单细胞膜片钳和细胞外记录或钙成像技术来表征4-AP诱导的活动20,21,22,23,24,25综上所述，本研究证实了兴奋性与抑制性突触传递以及电突触在4-AP诱导的节律性活动中的必要性。因此，4-AP反应被视为一种揭示具有生物学意义的固有多突触背角环路的方法，而非单纯的药物诱导假象。此外，4-AP诱导的活动对镇痛药和抗癫痫药物的反应特征与神经病理性疼痛状态相似，已被用于提出新的以脊髓为基础的镇痛药物靶点，如连接蛋白（connexins）。20,21,22.
本文描述了一种结合微电极阵列（MEA）和使用4-AP化学激活脊髓背角（DH）的方法，用于在宏观回路或网络水平上研究伤害性感受环路。该方法为在正常状态及神经病理性“疼痛样”条件下研究伤害性感受环路提供了稳定且可重复的平台。此外，该制备方法还可广泛应用于已知镇痛药物在环路水平作用的检测，以及在脊髓过度兴奋状态下对新型镇痛药物的筛选。

<table><tbody><tr><td>4-氨基吡啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>275875-5G</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AJA214-2.5LPL</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 1M</td><td>Banksia Scientific</td><td>0430/1L</td><td></td></tr><tr><td>Carbonox（碳酰气——95% O₂ 和 5% CO₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Coregas</td><td>219122</td><td></td></tr><tr><td>弯头长柄弹簧剪</td><td>精细科学工具</td><td>15015-11</td><td></td></tr><tr><td>定制气液界面培养室</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10091130</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AJA783-500G</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AJA383-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Ceva</td><td>KETALAB04</td><td></td></tr><tr><td>大型手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 瞬干胶</td><td>螺栓与工业用品</td><td>L4543G</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>R2018b</td></tr><tr><td>多电极阵列，三维</td><td>多通道系统</td><td>60-3DMEA100/12/40iR-Ti，60-3DMEA200/12/50iR-Ti</td><td>60个氮化钛（TiN）电极，含1个内部参比电极，排列成8×8方阵。电极直径为12 &amp;micro;毫米直径，40 &amp;micro;m (100/12/40) 或 50 &amp;micro;米（200/12/50）高且等距排列的100个 &amp;micro;m (100/12/40) 或 200 &amp;micro;米（200/12/50）间隔</td></tr><tr><td>MEA前置放大器</td><td>多通道系统</td><td>MEA2100-HS60</td><td></td></tr><tr><td>MEA接口板</td><td>多通道系统</td><td>MCS-IFB 3.0 多重启动</td><td></td></tr><tr><td>MEA 网络</td><td>多通道系统</td><td>ALA HSG-MEA-5BD</td><td></td></tr><tr><td>MEA灌流系统</td><td>多通道系统</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>平面MEA</td><td>多通道系统</td><td>60MEA200/30iR-Ti，60MEA500/30iR-Ti</td><td>60个氮化钛（TiN）电极，含1个内部参比电极，排列成8×8方形网格（200/30）或6×10矩形网格（500/30）。电极直径为30 &amp;micro;微米，直径且等距间隔200 &amp;micro;米（200/30）或500 &amp;micro;m（500/30）间隔。</td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AJA296-500G</td><td></td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>Motic</td><td>Moticam X Wi-Fi</td><td></td></tr><tr><td>多通道分析仪软件</td><td>多通道系统</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>多通道实验者软件</td><td>多通道系统</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AJA465-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AJA475-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ACR207805000</td><td></td></tr><tr><td>咬骨钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>小型弹簧剪</td><td>精细科学工具</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>小型手术剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AJA530-500G</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td></td><td></td><td>氰基丙烯酸酯粘合剂</td></tr><tr><td>河豚毒素</td><td>Abcam</td><td>AB120055</td><td></td></tr><tr><td>减振台</td><td>纽波特</td><td>VH3048W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr></tbody></table>

使用微电极阵列记录脊髓伤害性感觉回路中的网络活动

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

脊髓背角（DH）中特定类型神经元的功能及其连接性正在被迅速阐明，这为理解脊髓疼痛信息处理背后的神经环路提供了日益详尽的视角。然而，这些连接对背角更广泛神经网络活动的影响仍知之甚少，因为大多数研究集中于单个神经元和小型微环路的活动。相比之下，微电极阵列（MEAs）能够同时监测多个细胞的电活动，从而以高空间和时间分辨率记录神经活动。本文描述了在小鼠脊髓切片中使用微电极阵列，通过4-氨基吡啶（4-AP）化学激活背角环路以研究其活动的方法。所诱发的节律性活动局限于浅层背角，具有时间稳定性，可被河豚毒素阻断，并可在不同切片方向下进行研究。该实验体系为研究来自正常动物、慢性疼痛动物模型以及伤害感受功能发生遗传改变的小鼠组织中背角环路活动提供了平台。此外，在4-AP刺激的脊髓切片中进行MEA记录，可作为快速筛选工具，用于评估新型镇痛化合物干扰脊髓背角活动的能力。

脊髓背角神经网络活动模型 
应用4-AP可稳定诱导脊髓背角（DH）产生同步节律性活动。此类活动表现为兴奋性动作电位（EAPs）和局部场电位（LFPs）的增加。后者是一种低频波形信号，此前已在多电极阵列（MEA）记录中有所描述30。给药后EAP和/或LFP活动的变化反映了神经元活动的改变。EAPs和LFPs的示例见图3B和图4。本文重点关注EAP/LFP数据的以下参数或特征：频率、总事件数、活跃电极数、通过多个电极检测到的同时事件数量所表征的同步性、相连相邻电极的数量，以及相邻电极间连接的强度。代表性结果见表3以及图3、图4、图5、图6、<strong class=...

本文概述了联合使用微电极阵列技术和4-氨基吡啶诱导的化学刺激方法，用于研究脊髓背角网络水平的伤害性感受活动。

脊髓背角（DH）中特定类型神经元的功能及其连接性正在被迅速阐明，以提供一个……

向您介绍的MEA 4-AP脊髓切片制备方法为研究背角环路的连接性以及这些网络在脊髓感觉信息处理过程中的相互作用提供了一个平台。所展示的方法能够以宏观区域分辨率来研究背角环路的活动。该制备方法可作为快速筛选工具，用于评估化合物干扰脊髓感觉环路信号传导的能力。该方法有助于弥补我们对特定细胞类型和微小神经环路的活动如何影响大量神经元群体，进而调控脊髓背角行为反应以及最终痛觉体验的理解空白。首先，用马血清填充MEA孔，孵育30分钟。移除血清后，用蒸馏水彻底冲洗MEA五次，每次均需更换蒸馏水，直至蒸馏水不再产生泡沫为止。然后，用人工脑脊液填充小室。将麻醉的小鼠断头后，在髋部水平的腹部皮肤上做一小切口，去除腹部区域的皮肤。然后，将切口两侧的皮肤向头侧方向牵拉，直至从胸廓顶部到骨盆顶部的腹侧和背侧皮肤全部去除。将尸体置于冰上后，采用腹侧入路，通过去除内脏并沿胸骨侧方剪断肋骨来暴露脊柱。去除腹侧肋骨笼、双侧肩胛骨以及下肢和骨盆。将脊柱及肋骨标本转移至含有冰冷蔗糖人工脑脊液的解剖浴槽中。用大头针穿过下背部肌肉及附着的上部肋骨，将标本的四个角固定。使用咬骨钳去除覆盖在椎体腹侧表面的所有肌肉和结缔组织，并确定位于腰骶膨大区域对应的椎体部位，该部位大约在 T12-L2 椎体下方。在腰骶膨大区域尾侧去除一个椎体，以暴露位于椎管内的脊髓。使用弯头弹簧剪，在抬起并向前牵拉椎体的同时，双侧剪断椎弓根，以分离椎骨的腹侧与背侧结构，暴露脊髓。当去除椎体以显露腰骶膨大后，用弹簧剪仔细清除固定脊髓的残余神经根，直至脊髓游离。在腰骶膨大上方和下方分别进行头端和尾端切断，将目标节段的脊髓游离出来。对于横切面切片，将附有神经根的腰骶段提起并放置在预先切割好的聚苯乙烯块上，该聚苯乙烯块中央设有浅槽。然后使用氰基丙烯酸酯粘合剂将该块体与脊髓固定在切片平台上，并将其置于含有冰冷蔗糖人工脑脊液悬液的切片浴中。获得厚度为300 µm的切片后，将切片转移至含有氧合人工脑脊液的气液界面培养室中，在室温下孵育1小时，使其达到平衡状态。开始记录背角活动时，使用装有人工脑脊液的大口径巴斯德移液管将脑片从孵育箱转移至MEA小室，并添加额外的人工脑脊液。用精细的短毛画笔将脑片调整至60通道电极记录阵列上方的位置。然后，将一个带重物的网格固定在组织上，以保持其位置并促进脑片与MEA电极的良好接触。将MEA放置在记录头阶段。使用倒置显微镜检查组织在电极上的位置，以确认尽可能多的电极位于浅层背角下方。确保至少有2至6个电极不与脑片接触。连接相机至设备后，拍摄脑片相对于MEA的参考图像，供分析时使用。然后，在记录软件中点击启动 DAQ，并确认所有电极均接收到清晰的信号。接着，将灌流系统的进液管和出液管连接至已加入人工脑脊液的 MEA 记录孔中，并开启灌流系统。检查流速，确保出液流量充足，以防止灌流液溢出。组织平衡5分钟后，记录5分钟的原始基线数据。将灌注进液管从人工脑脊液切换至4-氨基吡啶溶液，并等待12分钟，使4-氨基吡啶诱导的节律性活动达到稳态。随后，记录5分钟的4-氨基吡啶诱导活动，并准备进行后续记录，以测试药物作用或检测4-氨基吡啶诱导活动的稳定性。每次记录结束后，用人工脑脊液冲洗管路。将MEA从记录头阶段取出，并从MEA孔中移出网片和脑片后，用人工脑脊液冲洗MEA和网片，并用新的脑片重复整个过程。打开分析软件，加载预先制作好的分析布局。打开目标文件，取消选择参考电极以及任何被认为噪声过大的电极。设置分析的时间窗口，然后切换到跨通道滤波选项卡。根据实验过程中拍摄的图像和记录的笔记，选择复合参考电极和参考电极，然后点击“Explore”继续。切换到EAP滤波标签页，应用二阶高通Butterworth滤波器以去除LFP活动。切换到LFP滤波标签页，应用二阶带通Butterworth滤波器以去除EAP活动。在EAP检测器选项卡中，确保选择自动阈值，勾选上升沿和下降沿选项，并将死区时间设置为三毫秒。为设置正负阈值，请返回原始数据分​​析界面，移动时间标记，再返回EAP检测器选项卡，然后按“探索”按钮。重复此过程，直至设定的检测阈值能够捕获EAP信号，同时避免捕获噪声或非生理活动信号。在 LFP 检测器选项卡中，确保选择手动阈值，勾选上升沿和下降沿选项，并将死区时间设置为三毫秒。设置一个电极的阈值，待满意后，选择“应用到所有”，然后点击开始分析。通过浴槽施加电压门控钠通道拮抗剂河豚毒素后，EAP 和 LFP 活性均被消除，证实了这些信号对尖峰放电的依赖性。通过比较4-氨基吡啶给药后12分钟和15分钟时4-氨基吡啶诱导的活动参数，表征了EAP或LFP活动参数的稳定性。所有活动特征以及LFP活动的一致性均保持稳定。该特征表现为在多个电极上检测到的同步事件数量增加。连接的相邻电极数量，以及在4-氨基吡啶刺激后相邻电极与局部场电位（LFP）之间连接强度的变化及其随后的相对稳定性。脑片方向是体外制备中需要重点考虑的因素。无论脑片方向如何，4-氨基吡啶刺激均在脊髓背角（SDH）诱导出相似的节律性活动。最后，为了进一步阐明4-氨基吡啶激活背角（DH）网络的相关性，采用高钾人工脑脊液进行灌流，结果显示其引发的背角反应与4-氨基吡啶刺激相似。该实验方案中的关键步骤包括组织制备和切片放置：通过细致且及时的解剖确保组织活性，以及将组织精准地置于微电极阵列（MEA）上的最佳位置，这些都有助于获得高质量的实验结果。

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利用体内单纤维记录法及附着坐骨神经的完整背根神经节研究传导阻滞的机制

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