Name: 评价L-DOPA诱导的运动障碍在帕金森病单侧6-OHDA病变大鼠模型中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 了解在帕金森病6-OHDA大鼠模型中评估L-DOPA诱导运动障碍的方法。该方案通过视频分析轴向、肢体和口舌异常不自主运动，为开发抗运动障碍治疗策略提供可靠的临床前研究工具。

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本工作由圣保罗研究基金会（FAPESP，资助号 2017/00003-0）提供支持。感谢高等教育人员提升协调办公室（CAPES）的支持。感谢 Anthony R. West 博士、Heinz Steiner 博士和 Kuei Y. Tseng 博士提供的支持与指导。

所有实验均遵循里贝朗普雷图哲学、科学与文学系伦理委员会（CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5）的规定进行。
1. 6-羟基多巴胺损毁
<ol>
	<li>使用6周龄、实验开始时体重为200–250 g的雄性Sprague-Dawley大鼠。将动物饲养在标准实验室条件下（每笼2–3只，12:12小时明暗循环，光照开启时间为06:00，温度控制在22–24 °C），提供食物和水 随意摄取. 
	注意：有关如何制备重度6-OHDA损毁大鼠的完整描述见其他文献42.</li>
	<li>在开始任何实验操作之前，应适当使动物适应环境。</li>
	<li>手术前30分钟，腹腔注射去甲肾上腺素转运体抑制剂丙米嗪（20 mg/kg，溶于0.9%生理盐水中）。 
	注意：丙米嗪的给药将增强6-羟基多巴胺对多巴胺能神经元的选择性。</li>
	<li>腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（70/10 mg/kg）。</li>
	<li>确保动物因对脚趾夹捏无反应而处于深度麻醉状态，并将其俯卧位固定于立体定位仪中，置于加热垫上方。</li>
	<li>去除头部毛发，并使用碘伏和酒精交替消毒手术区域3次。</li>
	<li>使用手术刀在显微注射部位做一切口（约1 cm）。</li>
	<li>用棉签清洁颅骨区域，确保前囟（Bregma）和后囟（Lambda）暴露清晰。</li>
	<li>确保MFB立体定位坐标以bregma为参考点43,44,45：前囟后-4.3 mm，外侧1.6 mm（右侧），腹侧8.3 mm（自硬脑膜起）。</li>
	<li>以每分钟给药 6-OHDA 0.4 µL/min (10 µg 在 4 µL 含0.1%抗坏血酸的生理盐水溶液，单侧注射至右侧内侧前脑束（MFB） 50 µL Hamilton 玻璃注射器</li>
	<li>手术结束时，缝合头皮切口，并用温热（约37 °C0.9% 无菌生理盐水溶液（约 10 mL/kg，皮下注射）。</li>
	<li>将动物从立体定位仪上取下，放入预热的恢复笼中。监测直至意识恢复。</li>
	<li>在损伤后4周，使用步态测试评估多巴胺能损伤的有效性46,47. 
	注意：在本实验中，通过记录损伤对侧前肢的调整步数来评估对侧前肢的运动不能。在对侧前肢出现三个或更少调整步的个体被纳入研究，作为疑似重度6-OHDA损伤大鼠。48.</li>
</ol>
2. L-DOPA 慢性治疗
<ol>
	<li>在6-OHDA损毁术后4周的周一，开始慢性治疗。 
	注意：由于异常不自主运动（AIMs）需每周连续3天（周三、周四和周五）进行录像，持续3周，因此建议在周一启动治疗。</li>
	<li>每天一次，从周一至周五，连续3周，给予大鼠新鲜配制的左旋多巴（L-DOPA，皮下注射，1 mL/kg）联合盐酸苯丝肼（剂量分别为5 mg/kg和12.5 mg/kg）45。 
	注意：一旦异常不自主运动（AIMs）建立，每次给予左旋多巴（L-DOPA）时均会表现出来。因此，在3周诱导期后，每周给予2至4次左旋多巴（L-DOPA）即可维持AIMs的稳定表达48。</li>
</ol>
3. AIMs 记录与评分
<ol>
	<li>在09:00至17:00之间进行实验。确保实验操作者完全不了解大鼠的身份及其药物处理情况。</li>
	<li>将大鼠小心放入一个透明圆柱体（直径20 cm，高40 cm）中，并使其适应环境至少15分钟。确保底部铺有垫料。在圆柱体后方放置镜子，以便实验者可以从所有可能的角度观察动物。 
	注意：若每次实验涉及多只大鼠，应为每只大鼠单独使用一个圆柱体。在测试间隔期间对动物进行操作可能干扰行为学分析。</li>
	<li>放置一台高分辨率摄像机，以便于观察轴向、肢体和口面运动障碍（AIMs）。由于在这些实验条件下存在旋转行为，圆柱体后方的镜子可实现对AIMs的360°追踪。使用三脚架或将摄像机直接固定在实验台上。 
	注意：口面型AIMs可能较难评分，尤其是在旋转行为发生频率较高时。将摄像机置于略低于动物所在平面、呈15°角的位置拍摄，有助于观察此类运动亚型。</li>
	<li>轻柔地将动物从圆柱体中取出，并皮下注射L-DOPA（5 mg/kg，联合12.5 mg/kg的苄丝肼）。</li>
	<li>将动物放回圆柱体中，并在注射L-DOPA后立即启动计时器以记录AIMs。使用摄像机持续记录注射后180分钟内的AIMs表现。尽管可通过直接观察动物进行分析，但更推荐采用离线评分方式。 
	注意：确保计时器也被同步录制，以便在L-DOPA给药后的准确时间点对AIMs进行评分。</li>
	<li>在L-DOPA注射后每30分钟评分一次AIMs，直至180分钟（评分定义见表1），评分方法最初由文献描述20,23。每次评分应持续1-2分钟，并将AIMs归类为轴向、肢体或口面型（图1）。</li>
	<li>仔细观察每一种AIM，并对其严重程度和幅度进行评分。请参照表1中的说明进行操作。评分时不包括正常行为，如直立、嗅探、理毛和啃咬。总共将有六个观察时间段（30、60、90、120、150和180分钟）。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>亚型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>躯干型：头部、颈部和躯干的扭转</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肢体型：前肢远端和近端的不自主运动</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>口面舌型：口面部肌肉的不自主运动</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>严重程度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0：无</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1：偶发（有间断，观察时间内出现少于一半时间）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2：频繁（有间断，但在观察时间内出现超过一半时间）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3：持续存在，但可被外界感觉刺激中断</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4：持续存在，且不被外界感觉刺激中断</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>幅度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>躯干型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1：头部和颈部约30°角的扭转</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2：头部和颈部约30° < 角度 ≤ 60°的扭转</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3：头部、颈部和上部躯干约60° < 角度 ≤ 90°的扭转</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4：头部、颈部和躯干 > 90°角的扭转，常导致大鼠失去平衡</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>肢体型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1：前肢远端的小幅度不自主运动</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2：低幅度运动，引起前肢远端和近端的移位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3：整个肢体（包括肩部肌肉）的不自主运动</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4：强烈的肢体和肩部运动，常类似投掷样运动（ballism）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>口面舌型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1：口面部肌肉的小幅度不自主运动</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2：大幅度的口面部运动，伴有舌头伸出</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：AIMS定义及评分标准。
<img alt="啮齿类动物行为研究；显示轴向、肢体和口面运动的序列图像；分析设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62924/62924fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：显示每种AIM亚型的图像序列。（A至A'"）轴向AIM，显示不同角度下的类肌张力障碍样运动（A：30°角，A'：30° &lt; 角度 ≤ 60°，A"：60° &lt; 角度 ≤ 90°，A'"：&gt; 90°角）。（B至B"）肢体AIM（黑色箭头），显示远端（B和B'）以及整个前肢（包括肩部，B"）的不自主运动。（C）口面AIM（红色箭头），表现为大幅度的舌头外伸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62924/62924fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 数据分析
<ol>
	<li>根据先前所述方法20，通过将每次 L-DOPA 给药后各观察时段（即共六个观察时段）的严重程度评分与幅度评分相乘，计算轴向、肢体或口面 AIMs 亚型得分。单只动物在一次测试阶段理论上可获得的最高总分为 240 分（每个观察时段最高得分为 40 分，详见 表 1）。</li>
	<li>绘制在连续 3 周慢性 L-DOPA 给药期间，每周三、周四和周五记录的全部六个观察时段的 AIMs 评分（图 2）。AIMs 评分可累加，以表示每只动物在每次评分日（图 3）或每周（图 4）的最高得分。</li>
	<li>在选择统计分析方法前，需确认数据是否接近正态分布。 
	注意：AIMs 评分量表属于有序分类数据，可采用非参数统计方法进行分析。但在多次测试阶段后比较不同实验组之间的 AIMs 评分时，参数检验方法也被广泛使用40。</li>
</ol>

作者无利益冲突。

本方案展示了如何在通过内侧前脑束（MFB）单侧微量注射6-OHDA诱导的帕金森病（PD）大鼠模型中诱导并分析异常不自主运动（AIMs）。连续每日给予低剂量左旋多巴（L-DOPA，5 mg/kg，联合12.5 mg/kg的苄丝肼）治疗3周后，AIMs逐渐形成。时间进程分析显示AIMs显著增加，且在给予L-DOPA后30至90分钟之间出现峰值剂量的运动障碍。AIMs表现为影响躯干、肢体和口面部肌肉的重复性且无目的的运动。本方案及所展示的数据与既往文献结果一致22,23,49,50,51。
轴向、肢体和口面运动障碍（AIMs）评分量表非常敏感，因为它评估了啮齿类动物出现类似运动障碍样动作的时间长短（即严重程度），并指示这些动作的幅度<sup class="xref"...

多巴胺前体L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）是治疗帕金森病（PD）运动症状最有效的疗法1。L-DOPA治疗可改善与PD相关的运动症状，但其疗效会随着时间推移而下降。诸如&#34;疗效减退波动&#34;或&#34;剂末恶化&#34;等运动波动在临床上表现为单次L-DOPA剂量作用持续时间缩短2。在其他情况下，临床表现包括缓慢的扭动运动和异常姿势（肌张力障碍）3，且常在多巴胺水平较低时出现（关期肌张力障碍）4。另一方面，当血浆和脑内多巴胺水平较高时，则会出现L-DOPA诱导的异动症（LIDs）5。
左旋多巴诱导的运动障碍（LIDs）会产生严重的副作用，包括舞蹈样、肌张力障碍和投掷样6等运动并发症。一旦出现，每次使用左旋多巴（L-DOPA）后均会诱发LIDs。在接受左旋多巴治疗5年的帕金森病（PD）患者中，有40%–50%会出现运动并发症，且其发生率随治疗时间延长而上升7。尽管帕金森病患者发生LIDs的病理生理机制尚未完全阐明，但多巴胺能神经支配丧失的程度、左旋多巴的脉冲式给药、纹状体蛋白和基因的下游改变，以及非多巴胺神经递质系统的异常，均是导致这些不良副作用发生的重要因素6,8,9,10。
神经毒素6-羟基多巴胺（6-OHDA）是一种已被充分表征的用于在啮齿类动物中研究帕金森病（PD）的工具11,12,13,14。由于6-OHDA不能穿过血脑屏障，必须将其直接注射到黑质纹状体通路中。6-OHDA诱导的多巴胺能神经元损耗具有浓度和注射位点依赖性15。在内侧前脑束（MFB）单侧给予6-OHDA可在啮齿类动物中造成严重的（&#62;90%）黑质纹状体损伤16,17,18,19。对严重单侧6-OHDA损毁的啮齿类动物长期给予左旋多巴（L-DOPA）会引发类似运动障碍的动作，称为异常不自主运动（AIMs）。啮齿类动物中这类类似运动障碍的表现与帕金森病患者中L-DOPA诱导的运动障碍（LIDs）具有相似的分子、功能及药理学机制5。因此，6-OHDA损毁的大鼠20和小鼠21是研究LIDs的重要临床前模型。当单侧6-OHDA损毁的大鼠和小鼠接受治疗剂量的L-DOPA（5–20 mg/kg）持续给药7–21天后，会逐渐出现影响损毁对侧前肢、躯干和口面部肌肉的AIMs17,18,19,20,22,23,24。这些运动的发生时间进程与帕金森病患者中L-DOPA诱导的峰值剂量运动障碍相似25，其特征为过度运动和肌张力障碍5。AIMs通常根据其严重程度（例如，特定AIM是否出现）和幅度（例如，以每次运动的幅度为特征）进行评分5,23,25。
6-OHDA 损伤的啮齿类动物 LIDs 模型具有表观效度（即该模型具有若干与人类疾病相似的特征）5,11,26,27,28。啮齿类动物的 AIMs 与帕金森病（PD）患者类似，表现为舞蹈样多动（前肢和口面运动）和肌张力障碍（躯干运动）29，并模拟了峰值剂量型异动症。在分子和功能水平上，啮齿类动物模型与 PD 患者共享许多病理特征5，例如 FosB/ΔFosB 的上调19,26,30,31,32,33 以及 5-羟色胺转运体（SERT）的上调34,35。在预测效度方面，能够减轻 PD 患者 LIDs 的药物（例如 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂金刚烷胺）在啮齿类动物模型中也表现出抗异动症的疗效22,36,37,38,39。
啮齿类动物异常不自主运动（AIMs）评分量表基于四种AIMs亚型建立，包括影响头部、颈部和躯干的AIMs（轴性AIMs）、上肢过度运动（肢体AIMs）以及类似肌张力障碍的口面运动（口面AIMs）。尽管单侧损毁的啮齿类动物也表现出对侧旋转（运动性AIMs）20,22,23,25,40，但该行为未被计分为类似肌张力障碍的运动，因其可能无法特异性地反映左旋多巴诱导的异动症（LIDs）22,37,41。
本文将介绍如何在帕金森病（PD）重度（&#62;90%）单侧6-OHDA损毁大鼠模型中诱导并分析类似运动障碍的动作（包括躯干、肢体和口面运动异常，即AIMs）。本实验方案的制定参考了既往文献及本实验室的研究经验。

<table><tbody><tr><td>6-羟基多巴胺氢溴化物</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H6507</td><td>可导致儿茶酚胺能神经末梢退变的神经毒素</td></tr><tr><td>苯丝肼盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>B7283</td><td>外周多巴脱羧酶抑制剂</td></tr><tr><td>Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)&amp;nbsp; 2.8mm B</td><td>HIKVISION</td><td>DS-2CE16C0T-IRP</td><td>用于记录所有行为的摄像机</td></tr><tr><td>丙咪嗪盐酸盐</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63723</td><td>去甲肾上腺素转运体抑制剂（NET），用于保护去甲肾上腺素能神经元免受6-OHDA损伤</td></tr><tr><td>氯胺酮盐酸盐</td><td>Ceva Animal Health</td><td></td><td>用于手术干预的麻醉剂</td></tr><tr><td>L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）甲酯（盐酸盐）</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>16149</td><td>多巴胺前体</td></tr><tr><td>镜子</td><td></td><td></td><td>用于在实验过程中从各个方向观察动物行为</td></tr><tr><td>0.30 x 13 mm 针头</td><td>PrecisionGlide</td><td></td><td>用于注射药物的针头</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Samtec</td><td></td><td>食盐</td></tr><tr><td>1 ml 无菌注射器</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td>用于注射药物的注射器</td></tr><tr><td>透明圆筒</td><td></td><td></td><td>用于在实验期间记录动物行为</td></tr><tr><td>赛拉嗪盐酸盐</td><td>Ceva Animal Health</td><td></td><td>用于手术干预的镇静剂、镇痛剂和肌肉松弛剂</td></tr></tbody></table>

评估帕金森病单侧6-ohda损毁大鼠模型中l-dopa诱导的运动障碍

Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease

左旋多巴诱导的运动障碍（LIDs）是指帕金森病（PD）患者长期使用左旋多巴治疗后出现的运动并发症。临床上最常见的类型是峰剂量运动障碍，其临床表现为舞蹈样动作、肌张力障碍和投掷样运动。6-羟基多巴胺（6-OHDA）大鼠帕金森病模型可模拟LIDs的多种特征。在反复给予左旋多巴后，6-OHDA损毁的大鼠会出现类似运动障碍的动作（例如异常不自主运动，AIMs）。本方案展示了如何在黑质纹状体通路多巴胺能神经元损耗达90%-95%的6-OHDA损毁大鼠中诱导并分析AIMs。通过重复给药（持续3周）左旋多巴（5 mg/kg，联合12.5 mg/kg的苄丝肼），可成功诱导AIMs的产生。时间进程分析显示，AIMs在给药后30-90分钟显著增加（峰剂量运动障碍）。LIDs的啮齿类动物模型是识别有效抗运动障碍干预措施的重要临床前工具。

尽管在大鼠中观察到的异常不自主运动（AIMs）模式相较于人类和非人灵长类动物更为简单且有限，但该模型能够重现由长期左旋多巴（L-DOPA）给药所诱导的运动过多和类肌张力障碍样运动。本文展示了来自一组（n = 10）单侧6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁大鼠的数据，这些大鼠在3周内（周一至周五）长期接受L-DOPA（5 mg/kg，联合12.5 mg/kg苄丝肼）治疗。请注意，本文所展示的数据来自 图2, 图3，以及 图4 来自同一批动物。
图2展示了在连续3周左旋多巴（L-DOPA）慢性给药期间，对轴性、肢体性和口面性异常不自主运动（AIMs）评分的时间过程分析。在此分析中，每个特定观察时段的AIM评分亚型均以严重程度评分与幅度评分的乘积表示。此类分析有助于探讨干预AIMs时间特征的药物效应。需要注意的是，左旋多...

L-多巴诱导的运动障碍啮齿类动物模型是识别治疗干预措施以减轻或缓解因反复给予L-多巴而引发的运动障碍发生与表现的宝贵工具。本方案展示了如何在单侧6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的帕金森病大鼠模型中诱导并分析类似运动障碍的动作。

评估帕金森病单侧6-OHDA损毁大鼠模型中L-DOPA诱导的运动障碍

左旋多巴诱导的运动障碍（LIDs）是指帕金森病（PD）患者长期使用左旋多巴治疗后出现的运动并发症。

在帕金森病的6-羟基多巴胺大鼠模型中评估左旋多巴诱导的运动障碍，是鉴定有效抗运动障碍干预措施的重要临床前工具。该模型相对简单，成本较低，并且与临床情况具有相似性。该操作将由实验室的博士生Danilo Leandro Ribeiro进行演示。以体重为200至250克的雄性Sprague-Dawley大鼠开始实验。每笼饲养2至3只动物，在标准实验室条件下进行，自由摄取食物和水。手术前，通过腹腔注射给予大鼠去甲肾上腺素转运体抑制剂丙米嗪。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉成功后，将大鼠俯卧位固定于立体定位仪上的加热垫上。大鼠固定完毕后，使用手术刀在微注射区域做一厘米长的切口。随后用棉签清洁颅骨区域，确保前囟和后囟暴露清晰。从前囟开始，取内侧前脑束（MFB）的立体定位坐标：前向4.3毫米，右侧1.6毫米，腹侧8.3毫米（以硬脑膜为参考）。确定坐标后，使用50微升Hamilton玻璃注射器，以每分钟0.4微升的速度，单侧向右侧MFB注射6-羟基多巴胺（6-OHDA）。手术结束后，缝合头皮切口，并通过皮下注射给予动物温热的无菌0.9%生理盐水溶液，剂量为每千克体重10毫升，以补充水分。将动物从立体定位仪中取出，放入温暖的恢复笼中，并持续监测直至意识恢复。在损伤后四周，通过步态测试评估损伤对侧前肢的运动不能情况，以检测多巴胺能损伤的效果。对侧前肢调整步数等于或少于三步的大鼠应被纳入研究，作为疑似严重6-OHDA损伤大鼠。在6-OHDA损毁后四周，于周一开始慢性治疗，并在周三记录异常不自主运动。操作时，将大鼠放入一个直径20厘米、高40厘米的透明圆柱形容器中，使其适应环境至少15分钟。确保容器底部铺有垫料，并在圆柱后方放置镜子，以便从所有可能的角度观察动物。放置一台高分辨率摄像机，以便观察轴向、肢体和口面不自主运动。圆筒后方的镜子可实现对不自主运动的360度监测。摄像机可置于动物平面稍下方，与动物呈15度角，以观察口面不自主运动。确定位置后，将相机直接固定在实验台上。动物适应环境15分钟后，将其从圆筒中取出，并皮下注射每公斤体重5毫克的新鲜配制的L-多巴胺或L-DOPA，同时联合注射每公斤体重12.5毫克的苄丝肼。将动物放回圆筒中，并启动计时器以记录异常不自主运动。注射后使用摄像机记录180分钟内的异常不自主运动，每30分钟记录一次，以便进行离线评分。在六个观察时段结束后，需对持续一分钟至两分钟的运动片段进行评分，并将其分类为躯干型、肢体型或口面型。注意勿将正常行为纳入评分。L-DOPA 和苯丝肼的治疗应持续三周，每周一至周五每日一次。在代表性的时间过程分析中，显示了在连续三周L-DOPA给药期间对轴性、肢体和口面异常不自主运动的评分结果。值得注意的是，L-DOPA诱导的峰值剂量型运动障碍发生在给药后30至90分钟之间，在给药后120分钟开始逐渐减轻。此外，在长期左旋多巴治疗的三周

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Biology

生物学

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