作为感染后葡萄膜炎模型的启动型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）

本方案概述了在小鼠模型中使用灭活分枝杆菌诱导稳定且显著的眼部炎症的步骤。这种致敏性分枝杆菌性葡萄膜炎模型有助于研究分枝杆菌感染后发生的慢性免疫介导性眼部炎症的机制。该慢性葡萄膜炎模型无需使用特定小鼠品系或用眼部抗原进行免疫。

该模型有助于在眼内炎症发病机制的机制性研究中使用转基因和基因敲除小鼠品系。此PMU模型将对人类眼内炎症或葡萄膜炎新疗法的研究具有帮助。例如，新的滴眼液或全身给予的免疫调节剂等治疗方法可通过该模型进行疗效测试。

该模型将有助于研究热灭活的分枝杆菌抗原如何改变眼等免疫豁免器官的微环境。这些结果还可能为其他类型的ocular感染如何影响眼睛，或脑等免疫豁免部位如何响应微生物抗原提供见解。首先，松开超声波破碎仪转换器单元的主体，并用70%酒精棉片清洁探头。

然后打开超声波破碎仪，通过旋转功率调节旋钮将功率设置为4。接着，为了在PBS中形成结核分枝杆菌H37Ra的细小悬浮液，将探头末端浸入含有微细菌粉末的PBS中。在冰上超声处理30秒，随后暂停30秒，重复该过程，总时长为5分钟，以充分分散粉末，形成均匀悬浮液，同时避免液体过热。

接下来，向混合物中加入2.5毫升弗氏不完全佐剂，并在冰上重复超声处理，直至乳剂形成类似牙膏的稠度。进行皮下注射时，用1毫升注射器吸取200至300微升的微细菌乳剂。排出注射器中的空气，并通过间歇性倒置和轻弹继续填充注射器，直至充满。

接下来，将皮下注射部位选择在6至10周龄麻醉的C57黑6J小鼠髋部的背侧表面，或腹股沟淋巴结区域附近的腿部腹侧表面。小心插入针头，注意不要刺入肌肉层，并将50 µL乳剂注入皮下间隙。注射后不要立即拔出针头，以确保黏稠的乳剂完全注入。

为制备玻璃体内注射用抗原储备液，按照先前所述方法在PBS溶液中对H37Ra进行超声处理，然后将溶液分装为每份100微升，并在-20摄氏度下保存。在注射当天，确认全身麻醉深度后，使用一滴0.5%丁卡因麻醉角膜，并使用一滴2.5%去氧肾上腺素散大瞳孔。轻轻吸去多余液体后，在眼球表面及周围毛发处滴加一滴5%聚维酮碘，以降低眼内炎的发生风险。

两到三分钟后，去除聚维酮碘，并用0.3%羟丙基甲基纤维素凝胶覆盖眼睛，以防止麻醉期间眼睛干燥以及白内障形成。接下来，用抗原和荧光素混合物装填一支10微升注射器，然后将小鼠俯卧位放置于平台，使用左右耳杆固定小鼠头部。调整小鼠在显微镜下的位置和方向，使右眼的上方鼻侧区域可见。

然后，使用30号针头移开睫毛，暴露巩膜，并观察角膜缘及放射状血管。接着，用无菌的30号针头在距角膜缘后方1至2毫米处的巩膜上制作一个引导孔。随后，将连接在注射手柄上的34号针头经引导孔插入眼内，进针角度应避开晶状体，同时将针尖置于玻璃体腔内。

使用微量注射泵控制器，将一微升结核分枝杆菌提取物小心注入玻璃体腔内。若出现持续性反流，可将注射体积增加至1.5微升，以确保足够的剂量递送。通过观察眼球内出现的淡绿色反光确认药物已注入玻璃体腔，10秒后将针头从眼内移除。

麻醉小鼠后，滴入一滴2.5%去氧肾上腺素以散大瞳孔，注意避免多余液体流入鼻腔或口腔。2至3分钟后，吸去多余液体，并在眼球表面覆盖0.3%羟丙甲纤维素凝胶。接着，用一层手术纱布包裹小鼠以维持体温，然后将小鼠放置于动物载片上，并使用咬合杆固定头部位置。

为了获取光学相干断层扫描（OCT）图像，打开OCT成像系统并启动成像软件。进行后房成像时，将OCT设备靠近眼球表面，注意避免镜头表面与眼睛接触。当眼睛处于正确位置后，停止快速扫描，选择体积扫描程序，并使用Aim选项启动扫描。

对于后段图像，调整位置直至视神经在水平B扫描对齐图像中居中，且视网膜与垂直对齐轴对齐。对于前段图像，调整位置使角膜顶点在水平B扫描对齐图像和垂直B扫描对齐图像中均位于中心。最后，单击“Snapshot”以捕获容积扫描图像，然后单击“save”。

玻璃体内注射24小时后，可见房水和玻璃体中存在炎性细胞。前房可见角膜水肿、前房积脓以及多个游离漂浮的炎性细胞，后房可见玻璃体炎。眼内炎症程度可通过这些OCT图像进行评分。

综合评分大于0但小于2.5表示轻度炎症；评分大于2.5但小于4.5表示中度炎症；评分大于4.5则表明重度炎症。

炎症评分也可通过苏木精和伊红染色切片中可见的五种特征来确定。严重程度评分通过计数房水和玻璃体中的炎性细胞数量来确定。明场纵向眼底成像也可识别视网膜及血管周围炎症。

严重炎症的眼部在彩色眼底成像上显示视网膜内多个白色浸润灶及血管扭曲，在OCT上第2天可见密集的玻璃体炎和视网膜水肿。轻度炎症的眼部在眼底表现为较少且更局限的线性病灶，玻璃体腔内可见少量浸润细胞。确保皮下注射和玻璃体内注射操作的一致性，并采取适当措施预防感染性眼内炎的发生，是成功复制该模型的关键步骤。

活体生物发光成像可用于表征炎症，而死后检测（如多参数流式细胞分析）可用于鉴定和定量浸润性免疫细胞亚群。通过细胞因子分析、mRNA 测序和免疫荧光成像，可评估基因和蛋白质表达模式，或鉴定葡萄膜炎中的视网膜免疫细胞群体。本方案展示了如何进行可重复、无菌且创伤最小的注射操作，以帮助未来的研究人员顺利进入小鼠玻璃体内腔。

OCT 还将在检测眼部炎症方面发挥重要作用，否则通过小实验动物眼睛的肉眼检查可能会遗漏这些炎症。