选择性清洁野生 卡诺菌线 虫以富集肠道微生物组细菌

该方法的开发是为了促进在野生Caenorhabditis线虫中发现的感兴趣的新型微生物的富集和鉴定，从而可以进一步研究宿主微生物的相互作用。该技术的主要优点是它使研究人员能够直接在野生线虫的肠道中富集不可培养的病原体和微生物组细菌。首先获得具有不可培养的相关微生物的线虫野生Caenorhabditis菌株，并在含有OP51大肠杆菌作为食物来源的标准线虫生长培养基或NGM板上生长蠕虫。

将线虫在20摄氏度下孵育四到五天，直到所有OP51大肠杆菌都被吃掉，并且大多数蠕虫都已达到Dauer阶段。要在Dauer阶段清洗线虫，将5毫升M9微盐培养基加入6厘米的饥饿蠕虫板中，并使用无菌玻璃移液管和灯泡从板中移取M9培养基和蠕虫，并将其转移到无菌的15毫升离心管中。在室温下以1， 000倍G旋转蠕虫30秒，然后使用无菌的15毫升移液管除去并丢弃蠕虫颗粒上方的M9上清液，而不会通过在蠕虫上方留下约50微升M9来干扰活蠕虫。

在同一离心管中，加入10毫升含有0.05%Triton X-100的M9培养基，并充分拧紧管帽，然后将管置于室温下的Nutator上以除去外部微生物。在Nutator上孵育20分钟后，在室温下以1， 000倍G旋转蠕虫30秒，然后按照所示取出并丢弃M9上清液，并使用含有0.05%Triton X-100的M9培养基重复洗涤程序三次。接下来，通过加入新鲜制备的抗生素和SDS溶液，在室温下将含有线虫的管子在Nutator上孵育过夜。

用抗生素治疗后，在室温下以1， 000倍G旋转管中的蠕虫一分钟。在加入含有0.05%Triton X-100的10毫升M9之前，先取出上清液，并充分拧紧盖子，在室温下将管子在Nutator上孵育20分钟。完成后，以1， 000倍G的速度旋转蠕虫一分钟，然后重复此过程三次。

用含有0.05%Triton X-100的M9进行第四次洗涤后，将蠕虫颗粒在100微升的溶液中不受干扰并丢弃其余部分。将100微升的上清液和沉淀转移到用OP51大肠杆菌接种的10厘米NGM板的中心。让盘子不受干扰地干燥，同时Dauers爬出中心并通过OP51草坪5至10分钟。

小心地拿起一个Dauer，并将其装在带有OP51种子的六厘米NGM板上。以同样的方式，在单独的6厘米NGM板中加入至少10个Dauers，并用OP51播种。将板在20摄氏度下孵育四到五天，直到Dauers长大并且下一代F1达到成虫阶段，然后目视检查所有板上的污染。

对于每个干净的板，根据感兴趣的表型，通过Nomarski或荧光显微镜验证目标微生物的传播。为了使蠕虫挨饿并减少OP51细菌的数量，将线虫在20摄氏度下孵育三到四天。将五毫升M9培养基加入最近饥饿的蠕虫的板中，然后将M9培养基和蠕虫转移到无菌的15毫米离心管中，在室温下以1， 000倍G旋转30秒。

在用含有0.05%Triton X-100的10毫升M9在Nutator上洗涤蠕虫五次之前，除去上清液20分钟。在最后一次洗涤后，除去上清液而不干扰100微升溶液中的沉淀，并将M9和蠕虫转移到未接种的6厘米NGM板中。让盘子干燥，而蠕虫爬来爬去20分钟，以帮助从角质层和肠道中取出OP51。

当板干燥时，通过添加250微升M9并将蠕虫转移到新的未播种的6厘米NGM板上来重复该过程，以使蠕虫在板干燥时爬行。20分钟后，将250微升M9加入板中，将100微升M9和蠕虫转移到干净的手表玻璃上，然后使用26号注射器针头斩首线虫，同时用另一根26号注射器针头按住蠕虫。一旦被斩首，肠道，颗粒状肿块和透明性腺将自然地从线虫体内避开，然后切掉暴露的肠子的一块，并将单个解剖的肠转移到含有10微升无菌水的0.5毫升PCR管中。

重复该过程以在PCR管中收集至少五种不同动物的肠道。将PCR管在零下80摄氏度下冷冻至少五分钟。在进行PCR和测序进行鉴定之前解冻肠道样本。

一种野生的热带Caenorhabditis菌株JU1848被发现具有薄微生物，以定向方式定植于肠腔。野生菌株JU1848在接种了大肠杆菌OP51细菌的标准6厘米NGM板上繁殖了明显的微生物生长。清洁后，来自单个Dauer的F1后代的一板在孵育四天后没有显示出可见的微生物污染。

在Nomarski斩首的JU1848动物的图像中，定植细菌在线虫体外的一块肠的腔内可见。一些Caenorhabditis物种可能需要较低的SDS浓度以防止Dauer死亡。为了传播干净的线虫菌株，请选择从中心爬得最远的Dauers，因为爬行有助于去除幸存的污染物。