DUCT：双重树脂铸型结合显微计算机断层扫描用于肝脏三维分析

该方法可实现对肝脏血管和胆道系统结构进行三维分析、可视化和定量。我们现在能够更深入地理解肝脏疾病的时空特征及再生过程。该技术的主要优势在于无需依赖抗体或荧光成像。

该方法还可直接可视化观察哪些网络结构已正确形成管腔。此方法适用于管状系统的分析，因此在血管、胆管和气道的研究中尤为理想。我们采用DUCT技术来解析与胆管再生相关的结构变化。

在将树脂注入小鼠胆道系统之前，使用PBS润湿的棉签将小鼠的肠道和胰腺向左侧移动，以暴露胆总管和门静脉。然后在下腔静脉处做一个小的横向切口。将肝脏腹面翻向心脏方向，以暴露肝脏的脏面和肝门区域，并找到从肝门区延伸、穿过胰腺、最终在欧迪氏括约肌处进入肠道的胆总管。

使用直镊子清除胆总管周围约五毫米范围内的组织。然后，将丝线从胆总管下方穿过，在胆总管上打一个松散的单结。将弹簧剪紧贴胆总管，于胆总管进入胰腺和肠道处、靠近奥迪括约肌的位置，对胆总管做一斜行切口。

接下来，将1毫升黄色树脂与50微升MV固化剂混合，用该树脂-固化剂混合物填充一支1毫升鲁尔注射器。将装满混合物的注射器连接至导管套装一，推动推杆使导管内充满混合物，直至混合物从导管末端滴出。使用镊子拉直胆总管切口周围的区域。

将导管插入胆总管开口时，应使斜面尖端的最长边朝下，朝向胆总管的背侧。然后扎紧丝线结，以固定导管在胆总管内的位置。向胆总管注入树脂后，观察胆囊及各个肝叶。

用PBS润湿的棉签轻轻按摩肝脏，以帮助树脂均匀分布。充满树脂的胆管终末分支将在肝脏表面隐约可见。当肝脏表面出现树脂斑点或感到阻力时，停止注射树脂。

然后通过从胆总管中抽出导管，并用镊子迅速扎紧丝线结，以防止树脂泄漏。剪除丝线缝合的游离端，以免影响门静脉注射。在向门静脉注射树脂前，使用直镊子将门静脉入肝处周围组织剥离约两厘米，以暴露门静脉。

然后将丝线缝合线置于门静脉已清理区域下方，打一个松散的单结。在肝脏远端的门静脉处，于打结前做一纵向切口。接着，按照之前演示的方法，用注射器配制绿色树脂固化剂混合物，并将该混合物注入导管中。

使用镊子将周围组织向尾侧牵拉，以拉直门静脉，然后插入导管，使斜面尖端的长边朝向血管的背侧。用丝线扎紧以固定门静脉中的导管。将树脂注入门静脉后，观察血管逐渐被树脂充填，并用PBS湿润的棉签轻轻按摩肝脏，以促进树脂扩散。

当所有血管充满后，从门静脉中拔出导管，并用镊子迅速扎紧丝线结，以防止树脂泄漏。对于小鼠离体肝脏的显微计算机断层扫描（MicroCT），将右内侧肝叶置于15毫升锥形管中，并向管内加入1%琼脂糖凝胶至总体积约三分之二处，以减少MicroCT扫描过程中样本的非预期移动。将装有样本的15毫升锥形管固定于CT设备的旋转台上。

让试管在测量室中至少热平衡一小时。当样品达到热平衡后，将其置于视场（FOV）中心，然后优化源-样品距离和样品-探测器距离（即SSD和SDD），以获得足够的体素分辨率。参数设定完成后，开始进行CT测量。

使用专用的断层扫描重建软件来重建CT数据。为分析CT数据，通过选择文件、导入和命令来加载文件。使用顶部面板上的表面确定功能，通过全局阈值法对数据中的树脂进行分割。

在对话窗口中，通过设置红色等值线的位置，利用直方图评估确定阈值，仅对填充树脂的导管进行分割。在左侧面板中，选择“从体数据、CAD 或网格创建感兴趣区域”模块，以生成填充树脂导管的感兴趣区域（ROI）。在对话窗口中，使用“从实体创建 ROI”选项，选择并确认已处理体数据的名称。

消除该 ROI 背景区域中噪声簇的错误分割。在右侧面板上通过右键单击并选择模块“分割 ROI”来标记该 ROI。在对话窗口中，设置最小体积体素参数以排除所有噪声颗粒。

该参数值取决于具体实验和数据，需针对每个待分析样本进行优化。在左侧面板中，使用平滑模块创建平滑、连续且完整的胆管掩模，避免出现伪影，例如树脂填充区域中存在气泡或树脂渗漏等情况。如前所述，为使用吸收性更强的树脂（如用于胆总管灌注、在CT数据中呈现较高强度值的黄色树脂）填充的系统单独创建一个ROI。

通过右键单击标记并用树脂掩膜标记新的感兴趣区域（ROI），然后从树脂掩膜的 ROI 中减去该新 ROI，从而为剩余的管状系统创建一个新的 ROI。根据操作人员的参考要求，以多种格式导出两个管状系统的最终 ROI，以便在不同软件中进行后续处理。进一步在体视图形软件中处理所得的 ROI，以图像或视频形式导出最终的可视化结果。

本研究成功实现了双重树脂灌注，肝内胆管和门静脉血管均得到良好充填。代表性分析展示了P15小鼠和成年小鼠肝脏的分割数据结果，其中成年小鼠肝脏的侧支血管中可见树脂。在典型的灌注失败案例中，由于手术过程中对肝脏造成物理损伤，导致树脂泄漏。

此外，在注射前树脂在针头或导管尖端过早硬化，以及灌注压力不足导致的心内灌注不充分，均可引起系统充填不全。轻微的树脂渗漏可在MicroCT数据分割过程中手动校正。过高的注射压力可能导致血管或导管破裂，从而不可逆地破坏血管或导管的结构。

此外，气泡是导致管状网络填充稀疏的另一种非常常见的注射伪影。当使用新打开的树脂时，可观察到黄色树脂灌注的胆管与绿色树脂灌注的门静脉之间存在明显的对比度差异。经过三个月的储存后，对比度已足够区分门静脉与胆管。

然而，沉淀物会影响两种树脂的混合，表现为填充后的门静脉出现不均匀的浑浊。当树脂使用超过六个月后，对比度会下降到仅凭颜色对比无法区分黄色染色的胆管与绿色染色的门静脉的程度。必须对胆总管进行斜切切口。

否则将很难插入导管。DUCT 技术揭示了在具有门周区和外周肝叶区域不同特征的临床相关模型中胆管再生的新结构机制。