携带人多能干细胞球体的核壳微胶囊的微流体制造
2021年10月13日
本文介绍了使用同轴流聚焦装置封装人多能干细胞（hPSC）。我们证明，这种微流体封装技术能够有效地形成hPSC球体。
由于这种培养物形成的多能性和分化潜力的提高，该地区被认为是对人类多能干细胞的3D培养物感兴趣的。我们描述了我们的封装策略，该策略导致人类多能干细胞球体的可重复形成。一旦封装，这些干细胞球体就可以在多孔板或搅拌生物反应器中培养。
我们的封装策略是优化病虫生存能力和球体形成的高效率。封装的球体可防止与搅拌或摇摆相关的剪切或机械能。干细胞衍生的细胞疗法的开发部分取决于以可扩展，高效和具有成本效益的方式产生所需细胞产品的能力。
这里描述的封装技术代表了朝着这个方向迈出的一步。这里描述的封装技术可能适用于从其他细胞到其他多能干细胞的各种细胞类型的3D培养。首先，通过混合4.8克35千道尔顿PEG，10.2毫升密度梯度培养基和19.8毫升DMEM / F-12培养基，制备30毫升两倍核心储备溶液。
然后使用0.22微米注射器过滤器过滤此核心溶液。接下来，通过将48.5毫升矿物油和1.5毫升表面活性剂混合，制备50毫升矿物油和3%表面活性剂。然后通过0.22微米注射器过滤器对溶液进行灭菌。
接下来，准备1摩尔DTT，1摩尔TEA和1%PF127溶液，如文本手稿中所述。然后将4.5毫升矿物油与3%的表面活性剂和300微升1摩尔DTT混合制备交联剂乳液。将溶液涡旋两分钟后，在20摄氏度的超声波浴中超声处理45至60分钟，并用27号针头将其装入5毫升注射器中。
接下来，通过将含有0.5%表面活性剂的矿物油装入具有27号针头的5毫升注射器中来制备屏蔽油溶液。为了制备壳溶液，在400微升DPBS中加入32毫克PEG4马来酰亚胺。然后，加入6微升1摩尔TEA。
涡旋溶液2分钟，并通过旋转过滤器离心。将溶液在摇臂上的黑暗中保持30分钟，然后用27号针头装入1毫升注射器中。最后，通过将2000万hPSC重新悬浮在200微升培养基中，并与30微升1%PF127和200微升2X核心溶液混合，制备最终的核心溶液。
将一个小搅拌棒插入1毫升注射器中。然后，用27号针头将含有芯溶液的电池加载到注射器中。首先将粘结的PDMS液滴装置，4片20厘米长，1片5厘米长的入口微管，1片10厘米出口管和6片0.5厘米管，放在杀菌光源下30分钟进行灭菌。
现在将4个20厘米长的入口微管装入壳中，使用镊子将油，交联剂乳液和解离装置入口安装。然后，将管子的另一端与相应的溶液一起插入注射器针头中。同时，用5厘米的微管连接微流控器件芯的入口和解离器件出口。
将 1 根出口管插入流体出口，并将另一端放入收集油箱中。接下来，将设备放在显微镜载物台上并连接管子以避免任何移动。将显微镜对准并聚焦在设备喷嘴上，以进行流量检测。
将每个注射器放在不同的注射器泵上并正确固定。根据制造商的协议对文本手稿中提到的流速进行编程，并在所有泵中启动流量。等待每种流体进入设备并填充通道，同时推出剩余的空气。
当胶囊形成稳定时，将收集管的另一端放入含有5毫升mTeSR培养基的新锥形管中。收集足够的胶囊后，将其孵育10分钟。位于油相中的胶囊将位于管的顶部，轻轻敲击管子后沉淀到底部。
要取回胶囊，首先从收集管中除去油。然后，将胶囊放在100微米孔径的细胞过滤器上，并用大量的培养基清洗过滤器。将过滤器倒置在6孔培养板的孔顶部，并通过使2毫升培养基通过过滤器来收集微胶囊。
将干细胞胶囊在37摄氏度的6孔培养皿中孵育5%的二氧化碳。每隔一天更换培养基，方法是将胶囊收集在细胞过滤器过滤器上，用多余的培养基洗涤它们，然后用2毫升培养基将它们重新悬浮到6孔板中的新孔中。通过将4微升的2微摩尔乙锭同源二聚体-1和1微升的4微摩尔钙黄绿素-AM溶液加入2毫升无菌DPBS来进行活力测定。
涡流确保完全混合。在细胞过滤器上收集约100个微胶囊，并用无菌DPBS冲洗它们，以使培养基从胶囊中扩散出来。使用1毫升含有乙锭同源二聚体-1和钙黄绿素AM的制备溶液在12孔培养板中再次收集它们，并在37摄氏度下孵育20分钟。
在荧光显微镜下观察细胞。使用微流体液滴生成制备的最佳和次优微胶囊显示出胶囊形态的差异，作为壳中PEG4-马来酰亚胺含量的函数。具有明亮边缘的光滑胶囊与所需的机械完整性相关。
珠子在胶囊中心的聚集表明核心是水性的，珠子可以自由移动。荧光环空表明存在水凝胶壳，并用于确定壳层厚度。包封H9细胞6小时后的活染色或死染色表明，在包封运行期间，细胞通常达到95%以上的活力。
比较包封球体与未包封球体的生长速率和分化潜力。确定包封过程对hPSC没有不利影响。请记住，在核壳和油流之间建立最佳流速比非常重要。
如果不这样做，可能会导致胶囊在机械上不坚固，并且在处理过程中可能会破裂。我们想指出的是，这种封装技术适用于人类多能干细胞以外的细胞类型。我们已经使用类似的策略封装了（主要是假设的）癌细胞系和间充质干细胞。
目前，我们的团队正在开发下一代微型电容器。这些微捕获具有生物活性，并且可能含有用于包封干细胞分化的交叉因子。
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概述
本文讨论了使用同轴流聚焦装置对人类多能干细胞（hPSCs）进行封装的策略。该方法能够高效形成适合在各种环境中培养的hPSC球体。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 微流体学
- 3D细胞培养
背景
- 人类多能干细胞在3D培养中具有增强的多能性和分化潜力。
- 封装保护干细胞球体免受机械应力。
- 高效的球体形成对细胞治疗的开发至关重要。
- 需要可扩展和经济高效地生成细胞产品。
研究目的
- 开发可重复的hPSC封装策略。
- 增强球体形成的存活率和效率。
- 促进在多孔板或搅拌生物反应器中的培养。
使用的方法
- 同轴流聚焦装置用于封装。
- 微流体技术用于球体形成。
- 评估培养过程中的机械保护。
- 优化封装参数以改善结果。
主要结果
- 通过封装成功形成hPSC球体。
- 封装的球体对剪切力表现出韧性。
- 该方法在球体生成方面表现出高效率。
- 在细胞治疗中具有可扩展应用的潜力。
结论
- 该封装策略对hPSC球体形成有效。
- 微流体封装增强了存活率和效率。
- 该方法支持可扩展细胞治疗的开发。
常见问题
Executive Industry Relevance
Microfluidic encapsulation of human pluripotent stem cell (hPSC) spheroids addresses critical challenges in scalable, reproducible 3D cell culture for early-stage cell therapy and regenerative medicine R&D. This technology enhances predictive confidence in differentiation outcomes and supports robust pipeline advancement by protecting cell viability and enabling high-throughput spheroid generation. Its integration into discovery and preclinical workflows positions it as a reusable platform for both target validation and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust formation of hPSC spheroids for functional target interrogation in 3D systems.
- Supports biological de-risking by maintaining high cell viability and pluripotency during encapsulation.
- Facilitates predictive confidence in differentiation and lineage commitment studies.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible microcapsules suitable for downstream high-content screening.
- Delivers quantitative viability and morphology outputs for assay optimization.
- Enables scalable preparation of uniform spheroids for compound evaluation and phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant 3D culture models for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by supporting cultivation in both static and dynamic systems.
- Reduces risk of mechanical damage, supporting reliable preclinical model development.
Pipeline & Workflow Integration
This encapsulation method bridges early discovery, screening, and preclinical research by providing a scalable, reproducible platform for 3D hPSC culture and spheroid formation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in physiologically relevant 3D systems.
- Screening: Delivers assay-ready, uniform spheroids with quantitative viability and morphology metrics.
- Analytics: Enables statistical comparison of encapsulation conditions and spheroid outputs.
- Translational Research: Facilitates alignment with preclinical disease models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various cell types and scalable for multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in 3D stem cell studies.
- Operational Value: Standardizes spheroid production with high reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cell therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics and 3D cell culture techniques.
- Needs access to co-axial flow focusing devices and analytical imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of encapsulation parameters and viability assays.
- Adaptable to different cell types but may require optimization for each application.
- Mechanical integrity of capsules depends on precise flow rate and formulation control.
