Name: 携带人多能干细胞球体的核壳微胶囊的微流体制造 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学习利用同轴流聚焦微流控装置封装人多能干细胞以形成球状体的方法。该技术可提高细胞存活率并保护其免受机械剪切力损伤，适用于多孔板或搅拌生物反应器培养，为规模化细胞治疗产品的开发提供高效解决方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究部分得到了梅奥诊所再生医学中心、J. W. Kieckhefer基金会、Al Nahyan基金会、明尼苏达再生医学（RMM 101617 TR 004）和美国国立卫生研究院（NIH，DK107255）资助项目的支持。

1. 器件制备
<ol>
	<li>使用 CAD 软件设计微封装装置和解离装置的结构10,11。</li>
	<li>在硅片上依次旋涂三层 SU-8 光刻胶（图 2A），以获得所需高度的结构：60、100 和 150 µm。 
	注意：顶部和底部模具的制备过程相同。
	<ol>
		<li>将洁净的 10 cm 硅片以 1,100 rpm 的转速旋涂 SU-8 2025 负性光刻胶，形成第一层 60 µm 厚的结构。在热板上于 65 °C 预烘 3 分钟，再于 95 °C 预烘 10 分钟后，通过无掩模对准器进行曝光：将核心通道图案的设计文件上传至 µPG 101 PC 完成曝光。随后进行曝光后烘烤，条件为 65 °C 3 分钟和 95 °C 10 分钟。</li>
		<li>以 1,500 rpm 的转速旋涂第二层 SU-8 2025 光刻胶（40 µm），并通过上传相应的壳层通道 CAD 文件进行曝光。 
		注意：软烘和曝光后烘烤的条件与前一步相同。</li>
		<li>以 1,400 rpm 的转速旋涂第三层 SU-8 2025 光刻胶，使其厚度达到 50 µm，并重复上述步骤，但对油相结构进行曝光。</li>
		<li>将包含三层结构的模具一次性浸入 SU-8 显影液中进行显影，直至所有未曝光的光刻胶完全去除。</li>
		<li>将模具置于热板上于 160 °C 坚膜烘烤 10 分钟，以增强附着力并密封显影后可能出现的微小裂纹。</li>
		<li>将模具暴露于三甲基氯硅烷中，以防止下一步中弹性体发生粘连，并将其放置于 15 cm 培养皿中备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照 图 1D 和 图 2B 所示方法，以相同方式制备解离装置模具。如步骤 1.2.3 所述，在硅片上旋涂一层 SU-8 光刻胶，获得所需高度为 50 µm 的结构。软烘、曝光后烘烤、显影和坚膜烘烤过程均与前述步骤类似。 
	注意：腔室内布满三角形柱状结构阵列，随着腔室向出口方向宽度减小，柱间间距也随之减小。三角柱边长为 200 µm，间距从入口处的 400 µm 逐渐减小至出口处的 30 µm。</li>
	<li>采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）通过软光刻技术制备模具。
	<ol>
		<li>在行星式离心机中，按 10:1 的质量比混合 PDMS 弹性体基质与固化剂。将混合物倾倒至微封装主模具和解离主模具上，形成 3–4 mm 厚的层。 
		注意：50 g 弹性体基质与 5 g 固化剂的混合物足以覆盖一个厚度为 3 mm 的主模具。</li>
		<li>将装有模具的培养皿置于真空干燥器中脱气 15 分钟，以去除未固化 PDMS 中的气泡。</li>
		<li>将培养皿转移至烘箱中，在 80 °C 下至少固化 60 分钟。</li>
		<li>将主模具从烘箱中取出并冷却。使用精密刀具沿硅片轮廓小心切割 PDMS，并从主模具上剥离出 PDMS 部件。</li>
		<li>用手术刀修整每个装置边缘以切下 PDMS 块，然后使用不锈钢针头在解离装置以及仅上层微流控装置上打孔，形成进样/出样流体接口。用魔术胶带覆盖装置以避免污染。 
		注意：进样口和出样口所用针头规格分别为 14 G 和 15 G。</li>
		<li>将上下两片 PDMS 的图案面在等离子刻蚀仪中进行 O2 等离子体处理 2 分钟，以实现键合。</li>
		<li>在体视显微镜下，向微通道内加入少量蒸馏水（2 µL）作为隔离薄层后，对齐上下两片 PDMS 部件。</li>
		<li>将对齐后的 PDMS 装置置于 80 °C 烘箱中过夜，以完成键合并恢复 PDMS 的原始疏水状态。随后将装置储存备用。 
		注意：最终得到的同轴流动聚焦装置中，核心通道、壳层通道和油相通道的高度分别为 120 µm、200 µm 和 300 µm。</li>
		<li>若需在等离子体键合后立即使用装置，应小心而牢固地向流体通道中注入 30 µL 疏水涂层溶液，以实现疏水修饰。随后立即向通道中通入空气，直至装置内无疏水涂层溶液残留。</li>
		<li>对解离装置进行键合时，先将装置的图案面和洁净的载玻片分别进行 O2 等离子体处理 2 分钟，然后组装并在 80 °C 烘箱中过夜进一步固化。 
		&#8203;注意：装置可储存备用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 溶液的配制
<ol>
	<li>储备液的配制。首先配制储备液（即浓缩液），使用时再稀释至所需的工作浓度。 
	注意：使用储备液可节省配制时间，节约试剂材料，减少储存空间，并在配制低浓度工作液时提高准确性。
	<ol>
		<li>配制30 mL 2倍浓缩核心溶液（16% PEG和34%密度梯度介质）：将4.8 g 35 kDa PEG、10.2 mL密度梯度介质与19.8 mL DMEM/F12培养基混合。使用0.22 μm注射器滤器过滤该核心溶液。</li>
		<li>配制含3%表面活性剂的50 mL矿物油：将48.5 mL矿物油与1.5 mL表面活性剂混合，经0.22 µm注射器滤器过滤后，保持无菌状态。</li>
		<li>准备50 mL含0.5%表面活性剂的矿物油：将49.75 mL矿物油与0.25 mL表面活性剂混合。保持无菌条件。</li>
		<li>配制1 M 二硫苏糖醇（DTT）：将1.5425 g DTT溶于10 mL蒸馏水中。保持无菌条件。</li>
		<li>配制1 M三乙醇胺（TEA）：将66.4 µL TEA加入433.6 µL蒸馏水中。保持无菌条件。</li>
		<li>配制1% Pluronic F127（PF127）：将100 mg PF127溶解于10 mL蒸馏水中，保持无菌条件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>工作溶液
	<ol>
		<li>将4.5 mL矿物油与3%表面活性剂及300 µL 1 M DTT（1:15比例）混合，制备交联剂乳液。涡旋振荡溶液2分钟，随后在20 °C超声水浴中超声处理45–60分钟。将该溶液装入配有27 G针头的5 mL注射器中。 
		注意：乳剂通过超声处理油/水混合物制备。</li>
		<li>使用27 G针头将含0.5%表面活性剂的矿物油装入5 mL注射器中，制备屏蔽油溶液。</li>
		<li>将32 mg PEG-4-Mal加入400 µL 1×DPBS中，配制成8%（w/v）的PEG-4-Mal溶液，涡旋振荡2 min。随后加入6 µL 1 M TEA（终浓度为15 mM TEA）。最后，在13,000 × g条件下离心 g 通过离心滤器离心5分钟，然后在摇床上避光孵育30分钟。随后，将该溶液转移至带有27 G针头的1 mL注射器中。 
		注意：打开 PEG-4-Mal 容器盖子前，需将其置于室温环境中静置 10 分钟，并用 N2 气体以替换 O2 与 N2 盖上盖子前，先将TEA涡旋混匀，再加入溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在核心溶液中制备细胞悬液
	<ol>
		<li>将hPSCs在37 °C下用胰蛋白酶处理5至10分钟，然后从培养板上收集细胞。细胞解离后，用培养基终止胰蛋白酶反应，随后将细胞转移至15 mL锥形管中。</li>
		<li>离心大量细胞悬液（400 × g） g，5 分钟）。小心吸除上清液，然后用少量培养基重悬细胞沉淀。使用自动细胞计数器对细胞进行计数。 
		注意：典型的细胞分装量为 12-20 x 106 细胞，足以配制400 µL的核心溶液。</li>
		<li>取12-20 × 106 从大量细胞悬液中取出细胞，离心细胞/培养基悬液（400 × g） g，5 分钟。</li>
		<li>小心吸除细胞沉淀中的培养基。然后，加入 200 µL 培养基和 200 µL 2x PEG 溶液（终浓度为 30-50 x 106 细胞/毫升）并轻轻混匀。 
		注意：细胞浓度较低（低于 20 x 106 细胞/毫升）导致大量空胶囊。</li>
		<li>加入30 µL的1% PF127溶液。</li>
		<li>将一个微型搅拌子（2 mm × 7 mm）放入1 mL注射器中，然后使用27 G针头将含有核心溶液的细胞加载至注射器内。整个包封过程中需用冰保持溶液低温。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 实验设置
<ol>
	<li>将键合好的PDMS液滴装置、四段20 cm长和一段5 cm长的进样微管（内径0.38 mm × 外径1.1 mm）、一段10 cm长的出样管（内径0.5 mm × 外径1.5 mm）以及六段0.5 cm长的连接管（内径1 mm × 外径1.8 mm）置于杀菌光源（通常集成于生物安全柜中）下，照射30分钟进行灭菌。</li>
	<li>使用镊子将管路连接至流体进样口和解离装置的解离口。</li>
	<li>使用三段20 cm长的进样微管分别连接壳层、油相和交联剂乳液的进样口，另一段用于解离装置的进样口。然后将各管路的另一端插入装有相应溶液的注射器针头中。同时，使用一段5 cm长的微管连接微流控装置的芯层进样口与解离装置的出口（图1C）。 
	注意：进样微管应牢固插入上一步中已安装的连接管内。</li>
	<li>将一段出样管插入流体出口，并将其另一端放入收集容器中。</li>
	<li>将装置放置于显微镜载物台上，并固定管路以防止移动。调整显微镜对准装置喷嘴，聚焦以观察流体流动情况。</li>
	<li>将各注射器分别安装在不同的注射泵上并妥善固定（图1B）。根据制造商的操作说明，将各泵的流速设定如下：芯层（3–5 µL/min）、壳层（3–5 µL/min）、保护油相（20–80 µL/min）和交联油相（40–60 µL/min），然后启动所有泵的流体输送。</li>
	<li>等待各流体进入装置并充满通道，同时排出残留空气。 
	注意：若进样管路中存在大量空气，可暂时提高各流速直至空气完全排出。需注意过高的流速可能导致PDMS与PDMS之间的键合失效。</li>
	<li>当胶囊形成趋于稳定后（图3），将收集管的末端转移至装有5 mL mTeSR培养基的新锥形管中。 
	注意：该培养基含有10 μM ROCK抑制剂、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。</li>
	<li>收集足够数量的胶囊后，在37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟。处于油相中的胶囊将浮于管顶（见图4A）。轻轻敲击管壁可使胶囊沉降至底部。随后，可吸除大部分油相和培养基。</li>
	<li>从锥形管底部收集胶囊，转移至细胞滤网（孔径100 μm）上，并用大量培养基冲洗。然后，将滤网倒置于6孔培养板上方，通过滤网加入2 mL培养基，以收集微胶囊（见图4A）。</li>
</ol>
4. 微胶囊中 hPSC 的培养与分析
<ol>
	<li>基础培养
	<ol>
		<li>将干细胞微囊置于6孔板培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
		<li>每隔一天更换一次培养基：用细胞筛滤器收集微囊，用过量培养基洗涤，然后将其重悬于6孔板的新孔中，每孔加入2 mL培养基，操作同步骤3.10。</li>
		<li>持续培养微囊至少10天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行活/死细胞染色检测，以评估包封干细胞的存活率。
	<ol>
		<li>解冻活/死细胞检测试剂（乙啶同源二聚体-1和钙黄绿素AM）。</li>
		<li>将4 µL的2 μM乙啶同源二聚体-1溶液和1 µL的4 μM钙黄绿素AM溶液加入2 mL无菌DPBS中，涡旋振荡以确保充分混匀。</li>
		<li>用细胞筛滤器收集约100个微囊，并用无菌DPBS冲洗，以促进微囊内培养基的扩散排出。</li>
		<li>用1 mL步骤4.2.2中配制的溶液将微囊转移至12孔培养板中，在37 °C孵育20分钟。</li>
		<li>在荧光显微镜下观察细胞。 
		注：通过计算活细胞占总细胞数的百分比来定量细胞存活率，活细胞呈绿色荧光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类球体尺寸表征。
	<ol>
		<li>必要时，将含有微囊的培养板置于显微镜下，利用相应软件及适当比例尺测量类球体的直径。</li>
		<li>测量并分析类球体的尺寸。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cells%3A+an+emerging+model+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li>
<li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+pluripotent+stem+cells%3A+history%2C+mechanisms%2C+technologies%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li>
<li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70(2020).</li>
<li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li>
<li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled%2C+stirred+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li>
<li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li>
<li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li>
<li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li>
<li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li>
<li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li>
<li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li>
<li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li>
<li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+hydrogels+for+capture%2C+detection%2C+and+release+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li>
<li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处描述的包封过程可重复地形成人多能干细胞（hPSC）类球体。微胶囊形式便于将类球体分配至微孔板的孔中，用于优化分化方案或测试治疗方法的实验。包封的干细胞类球体也可用于悬浮培养，其中水凝胶外壳可保护细胞免受剪切力引起的损伤7。
该方案中包含若干关键步骤。必须将核相、壳相和油相流体的流速控制在方案部分所述的范围内。如果壳相流速过低，流动将变得不稳定，导致微胶囊形态扭曲且机械稳定性差。成功的细胞包封应呈现出与图4C所示相似的微胶囊形态。微胶囊应具有相近的直径，并在核心中包含数量相当的细胞。单个细胞通常在48小时内聚集成类球体，若在72小时仍无类球体形成，则为异常信号。类球体无法形成的原因之一可能是核相中的黏性分子未能通过水凝胶壳层快速渗出。当使用高分子量聚合物（如羧甲基纤维素，分子量250 kD）调节核相溶液黏度时，我们曾遇到此类情况。可通过包封微珠（见图3B）来检测这些与细胞尺寸相当的物体是否能在核内自由移动，以及核相...

由于三维培养体系能够更好地维持人类多能干细胞（hPSCs）的多能性并提升其分化潜能，目前人们对hPSCs的三维培养产生了广泛兴趣&#160;1,2,3。通常可通过生物反应器、微孔板、水凝胶以及聚合物支架等方法将hPSCs形成球状体或其他三维培养结构4,5,6。包封技术则为将单个hPSC组织成球状体提供了另一种途径。一旦被包封，hPSC球状体便可方便地操作，并可转移至微孔板中用于分化、疾病建模或药物筛选实验。将hPSCs包裹在水凝胶层中还能保护细胞免受剪切力损伤，从而可在生物反应器中以较高的搅拌速率培养球状体7。
我们的干细胞包封方法随着时间不断改进。最初，我们专注于固体水凝胶微粒，并成功实现了小鼠胚胎干细胞（mESCs）的包封与培养。8然而，据观察，人胚胎干细胞（hESCs）在被包封于此类水凝胶微粒中时存活率较低，推测是由于这些细胞在包封后需要更迅速地重建细胞间接触。我们推断，具有水相核心的异质微胶囊可能更适用于需要快速重建细胞间接触的细胞的包封。用于制备水相核心/水凝胶壳层微胶囊的同轴流聚焦微流控装置概念借鉴自 He 等人的研究。9，但与原始方法中使用的海藻酸盐不同，本研究在壳层中引入了一种基于聚乙二醇（PEG）的水凝胶。我们首先证明了原代肝细胞在核-壳微胶囊中能够成功包封并形成球状结构10 以及最近报道的人胚胎干细胞和诱导多能干细胞的包封技术7如所述 图1A在流动聚焦装置中制备微胶囊，其中壳层与核心流体在喷入油相之前，由并列流动转变为同轴流动。核心流体含有细胞及增加溶液黏度的添加剂（非反应性聚乙二醇，分子量35 kD，以及碘克沙醇——商品名OptiPrep），而壳层流体则含有反应性分子（PEG-4-Mal）。连续的同轴流被分割为液滴，保留了核-壳结构。通过暴露于二硫醇交联剂（DTT）使核-壳结构永久化，DTT与PEG-4-Mal发生反应。 通过 点击化学反应形成一层薄的（约10 µm）水凝胶皮肤或壳层。当乳液破裂并将胶囊转移至水相后，聚乙二醇（PEG）分子从核心扩散出来，并被水分子取代，从而形成具有水相核心和水凝胶壳层的微胶囊。
以下是制作微流控装置、准备细胞以及进行人多能干细胞（hPSCs）包封的逐步操作说明。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器鲁尔锁头</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1× DPBS</td><td>康宁</td><td>23220003</td><td></td></tr><tr><td>4臂PEG马来酰亚胺，10 kDa</td><td>莱桑公司</td><td>164-68</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 注射器鲁尔锁扣式针头</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>6孔未处理板</td><td>USA Scientific</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel 涂抹套装</td><td>Aquapel 玻璃处理剂</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>CAD 软件</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD v2020</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网 100 &amp;micro;m 孔径大小</td><td>基数</td><td>335583</td><td></td></tr><tr><td>氯三甲基硅烷</td><td>Aldrich</td><td>386529-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 全自动细胞计数仪</td><td>生命科技</td><td>A27974</td><td></td></tr><tr><td>数字加热板</td><td>数据板</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数字涡旋混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>215370</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma</td><td>D0632-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 微型离心机</td><td>活体</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL VIOS 160i CO2 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>倒置荧光电动显微镜</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX83</td><td></td></tr><tr><td>劳雷尔旋涂机</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>活/死哺乳动物染色试剂盒</td><td>Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>魔术胶带</td><td>订书钉</td><td>483535</td><td></td></tr><tr><td>微型医用导管（0.015&quot; 内径 × 0.043&quot; O.D.)</td><td>科学商品公司</td><td>BB31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>微型搅拌子</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF3288E</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma 滤膜镊</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX6200006P</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td>M8410-1L</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1 基础培养基</td><td>干细胞技术</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>针头-不锈钢&amp;nbsp; 14号规格</td><td>CML 供应</td><td>901-14-025</td><td></td></tr><tr><td>针头-不锈钢&amp;nbsp; 15 号针头</td><td>CML 供应</td><td>901-15-050</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>干细胞技术</td><td>7820</td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>HERA THERM 烤箱</td><td></td></tr><tr><td>青霉素：链霉素（10,000 U/mL 青霉素G，10 mg/mL 链霉素）</td><td>双子座</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>150X20 毫米无菌透气培养皿</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>82.1184.500</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗系统</td><td>Yield Engineering System, Inc.</td><td>YES-G500</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 35kDa</td><td>Sigma</td><td>94646-250G-F</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 针头 27G</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>ROCK抑制剂Y-27632二盐酸盐</td><td>SELLECK CHEM</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆 100 mm</td><td>大学晶圆</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>载玻片（75 mm &amp;acute; 25 mm</td><td>CardinalHealth</td><td>M6146</td><td></td></tr><tr><td>Span 80</td><td>Sigma</td><td>S6760-250ML</td><td></td></tr><tr><td>SpeedMixer</td><td>Thinky</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Spin-X 离心管滤器（0.22 µm） &amp;micro;m)</td><td>Costar</td><td>8160</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>Y111069 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU-8显影液</td><td>Kayaku Advanced Materials</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>Royaltek 外科手术设计不锈钢手术刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-684</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD™ 184 硅弹性体试剂盒（PDMS）</td><td>道康宁</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>New Era泵系统公司</td><td>NE-4000</td><td></td></tr><tr><td>三乙醇胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T58300-25G</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管（0.02&quot; 内径 × 0.06&quot; O.D.)</td><td>Cole-Parmer</td><td>06419-01</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管（0.04&quot; 内径 × 0.07&quot; O.D.)</td><td>Cole-Parmer</td><td>06419-04</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机 FS20D</td><td>Fisher Scientific</td><td>CPN-962-152R</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Bel-Art</td><td>F42025-0000</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 Stemi DV4 体视显微镜 8x-32x</td><td>ZEISS</td><td>435421-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;PG 101 激光刻写仪</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>HI 1128</td><td></td></tr></tbody></table>

微流控法制备负载人多能干细胞球体的核-壳微胶囊

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

三维（3D）或球形培养的人多能干细胞（hPSCs）在分化效果和可扩展性方面具有显著优势。本文介绍一种稳定且可重复的hPSC球形体形成策略，该方法利用同轴流聚焦装置将hPSCs包裹于核-壳微胶囊内部。核心溶液含有单细胞悬浮状态的hPSCs，并通过添加高分子量聚乙二醇（PEG）和密度梯度介质以增加黏度。壳层流由PEG-4臂-马来酰亚胺（PEG-4-Mal）组成，与核心流并行流动，共同流向两个连续的油相交界处。在第一个油相交界处形成液滴，壳层溶液包裹于核心外围。在第二个油相交界处，通过引入双硫醇交联剂（1,4-二硫苏糖醇，DTT）实现壳层的化学交联。该交联剂与马来酰亚胺功能基团发生反应 通过 点击化学，从而在微胶囊周围形成水凝胶外壳。我们的包封技术以每秒10个胶囊的速率生成直径为400 µm的胶囊。所得胶囊具有水凝胶外壳和水性内核，可使单个细胞快速组装成聚集体并形成球状体。该包封过程未对人多能干细胞（hPSCs）的活力产生不利影响， &gt;包封后3天观察到95%的细胞存活率。作为对比，包封于实心凝胶微粒（无水相核心）中的hPSCs未能形成类球体，且存活率较低。 &lt;包封后3天细胞存活率为50%。人多能干细胞（hPSCs）在包封后48小时内于核-壳微胶囊内形成球形聚集体，其直径大小取决于细胞接种密度。总体而言，本方案中描述的微流控包封技术非常适合hPSCs的包封及球形聚集体的形成。

通过遵循上述方案，读者将能够制备微流控装置并生成携带细胞的微胶囊。 图3A 展示了使用微流控液滴生成技术制备的优质与次优微胶囊的示例。不同配方的PEG-4-Mal导致形成不同形态的微胶囊——表面皱缩的微胶囊与不良的凝胶化、较低的机械完整性相关，且无法耐受在搅拌式生物反应器中的培养。当PEG含量为 &gt;6% 的微胶囊呈现出理想的囊状形态，且结构足够稳定，可用于细胞培养。通过将微珠整合至微胶囊的核层以及将荧光基团整合至壳层，证实了核-壳结构。微珠在胶囊中心聚集的现象如图所示 图3B 被用作表明核心为水相的指示，且微珠可自由移动。观察到的荧光环状结构 图3C 表明存在水凝胶外壳，并用于确定外壳厚度。我们建议用户在建立包封工艺的初期阶段采用微珠掺入和荧光标记方法。
一旦建立了包封工艺，便可进一步对人多能干细胞（hPSCs）进行包封。尽管本方案描述的是H9细胞的包封，但我们已采用类似策略成功包封了另一种人胚胎干...

本文介绍了利用同轴流动聚焦装置包封人多能干细胞（hPSCs）的方法。我们证明，该微流控包封技术可高效生成hPSC细胞球。

人类多能干细胞（hPSCs）的三维（3D）或球形培养具有改善分化效果等优势，并且……

该区域因能形成具有更高多能性和分化潜能的三维人多能干细胞培养体系而备受关注。我们描述了一种包封策略，可实现人多能干细胞球体的可重复形成。包封后，这些干细胞球体可用于培养，既可在多孔板中进行，也可在搅拌式生物反应器中进行。我们的包封策略旨在优化类球体形成的存活率和高效率。包封后的类球体能够免受搅拌或摇动过程中产生的剪切力或机械能的影响。干细胞来源的细胞治疗的发展，在一定程度上依赖于以可扩展、高效且具有成本效益的方式生成目标细胞产品的能力。此处所述的包封技术代表了朝这一方向迈进的一步。该包封技术可能适用于从其他细胞到其他多能干细胞等多种细胞类型的三维培养。首先通过混合4.8克35千道尔顿的聚乙二醇（PEG）、10.2毫升密度梯度培养基和19.8毫升DMEM/F-12培养基，制备30毫升的两倍核心储备液。然后使用 0.22 微米注射器滤器过滤该核心溶液。接着，通过混合 48.5 毫升矿物油和 1.5 毫升表面活性剂，制备含 3% 表面活性剂的 50 毫升矿物油溶液。然后将溶液经 0.22 微米注射器滤器过滤以实现灭菌。接下来，按照文稿中的描述，配制 1 摩尔的 DTT、1 摩尔的 TEA 和 1% 的 PF127 溶液。然后通过将 4.5 毫升矿物油与 3% 表面活性剂和 300 微升 1 摩尔 DTT 混合，制备交联剂乳液。将该溶液涡旋振荡 2 分钟后，在 20 摄氏度的超声水浴中超声处理 45 至 60 分钟，并将其装入带有 27 号针头的 5 毫升注射器中。接下来，通过将含有0.5%表面活性剂的矿物油加入带有27号针头的5毫升注射器中，制备屏蔽油溶液。为制备壳层溶液，将32毫克PEG4马来酰亚胺加入400微升DPBS中，然后加入6微升1摩尔的三乙胺（TEA）。将溶液涡旋振荡2分钟，然后通过离心过滤装置进行离心。将溶液避光置于摇床上30分钟，随后装入带有27号针头的1毫升注射器中。最后，通过将2000万个hPSCs重悬于200微升培养基中，并加入30微升1% PF127和200微升2X核心溶液，制备最终的核心溶液。将一个小的搅拌子插入1毫升注射器中。然后，使用27号针头将含有核心溶液的细胞加载到注射器中。首先，将键合好的PDMS液滴装置、4段20厘米长的进样微管、1段5厘米长的进样微管、1段10厘米长的出样管以及6段0.5厘米长的连接管置于杀菌光源下照射30分钟进行灭菌。现在使用镊子将4根20厘米长的进样微管分别插入外壳、油相、交联剂乳液和解离装置的进样口。然后，将微管的另一端插入装有相应溶液的注射器针头中。同时，用一根5厘米长的微管连接微流控装置的内相进样口和解离装置的出口。将一根出口管插入流体出口端口，并将另一端放入收集容器中。接着，将装置放置在显微镜载物台上，并固定管路以避免任何移动。调整显微镜并对准装置喷嘴，聚焦以观察流体流动情况。将每支注射器分别放置在不同的注射泵上，并妥善固定。根据制造商的操作规程，将各泵的流速设置为文稿中所述的流速，然后启动所有泵的流动。等待每种流体进入芯片并充满通道，同时排出残留的空气。当类胚体形成稳定后，将收集管的另一端放入含有5毫升mTeSR培养基的新锥形管中。收集到足够数量的类胚体后，将其孵育10分钟。位于油相中的类胚体会处于管子上部，轻轻敲击管壁后，它们会沉降至管底。为回收微胶囊，首先从收集管中去除油相。随后，将微胶囊置于孔径为100微米的细胞筛网上，并用大量培养基冲洗筛网。将滤膜倒置在6孔培养板的一个孔上方，通过滤膜加入2毫升培养基，以收集微胶囊。将干细胞微囊置于6孔培养板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。每隔一天更换培养基：用细胞筛滤器收集微囊，用过量培养基洗涤，然后重悬于6孔板的新孔中，每孔加入2毫升培养基。进行活力检测时，向2毫升无菌DPBS中加入4微升2微摩尔的碘化丙啶同型二聚体-1（Ethidium Homodimer-1）溶液和1微升4微摩尔的钙黄绿素-AM（Calcein-AM）溶液。涡旋以确保充分混匀。用细胞筛收集约100个微胶囊，并用无菌DPBS冲洗，使培养基从胶囊中扩散出来。再次收集至12孔培养板中，加入1毫升含有Ethidium Homodimer-1和钙黄绿素AM的预配溶液，在37摄氏度孵育20分钟。在荧光显微镜下观察细胞。利用微流控液滴生成技术制备的优质和次优微胶囊，其胶囊形态随壳层中 PEG4-Maleimide 含量的不同而存在差异。表面光滑且边缘明亮的胶囊具有理想的机械完整性。微球在胶囊中心聚集表明核心为水相，且微球可自由移动。荧光环状结构表明存在水凝胶外壳，并用于测定外壳厚度。H9细胞包封后6小时的活/死染色显示，在包封过程中细胞活力通常超过95%。通过比较包封与未包封类球体的生长速率和分化潜能，确定包封过程对人多能干细胞（hPSCs）无不良影响。请注意，建立核心壳层与油相流之间的最佳流速比至关重要。如果不这样做，可能导致胶囊机械强度不足，在操作过程中发生破裂。需要指出的是，该包封技术适用于除人类多能干细胞以外的其他细胞类型。我们已采用类似策略，主要针对癌细胞系和间充质干细胞进行了包封，其中部分为假设性研究。目前，我们的团队正在开发新一代微捕获装置。这些微捕获装置具有生物活性，可负载多种因子，用于干细胞的包封分化。

microfluidic-fabrication-core-shell-microcapsules-carrying-human

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

携带人多能干细胞球体的核壳微胶囊的微流体制造

我们介绍了两种用于三维细胞培养的多孔聚合物芯片微加工工艺。第一种是热压印与溶剂蒸气焊接工艺相结合的方法。第二种则采用 recently developed...

芯片级三维细胞培养支架的微加工

介绍了一种用于研究癌症干细胞迁移的分区化微流控装置。该新型平台可构建可存活的细胞微环境，并实现对活细胞运动的显微可视化观察。通过分离出高迁移活性的癌细胞，可用于研究其侵袭性浸润的分子机制，有望为未来开发更有效的治疗策略提供依据。...

利用分区化微流控装置和活细胞成像评估癌干细胞迁移

我们建立了一种利用同轴喷嘴将多能干细胞（PS细胞）包封于海藻酸盐水凝胶微胶囊中的方法。该方法可防止细胞过度聚集，并降低悬浮培养过程中细胞所受的剪切应力。该技术适用于多能干细胞的大规模生产以及干细胞微环境的研究。...

使用同轴喷嘴进行多能干细胞的海藻酸盐封装

本论文介绍了一种无需复杂高成本设备即可制备凹形微孔的可靠方法。利用磁力、钢珠和通孔阵列，在3 cm × 3...

一种用于构建具有可变成凹几何形状微孔的配对微珠与磁铁阵列

我们介绍一种由电机驱动的离心式微流控装置，可用于培养细胞球体。利用该装置，可在高重力条件下轻松共培养单一或多种细胞类型的球体。...

基于CD的实验室平台用于生成多细胞三维球体

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

本方案描述了利用标准荧光显微镜对球状体的氧合状态和细胞死亡进行多参数分析，从而实现用于生物打印的高通量球状体制备。该方法可用于控制球状体的活力并实现标准化，这对于构建三维组织、肿瘤微环境以及成功进行（微）组织生物制造具有重要意义。...

低成本氧气显微镜辅助的多细胞球体生物制造

本文介绍了一种利用自动化移液系统接种细胞悬液，实现脂肪来源基质/干细胞（ASC）球体大规模生产的方法，从而确保球体大小和形状的均一性。这些ASC球体可作为三维生物打印技术的构建单元。...

大规模自动化生产脂肪源性干细胞球用于3D生物打印

本方案描述了一种利用3D打印的印章式装置，以低成本大规模制备组织球体的技术。...

组织类球体的生成 通过 一种3D打印的印章状装置

本文介绍了一组从人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞在高通量、多维度培养条件下生成心脏类球体（CSs）并进行冷冻保存的实验方案。该三维模型可作为疾病建模和高通量筛选的可靠平台，并在冷冻保存后仍能维持其功能特性。...

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

在此，我们介绍一种可实现肿瘤类球体快速、稳定且低成本制备并进行水凝胶包封的实验方案。该方法无需特殊设备，具有广泛的适用性，尤其适用于研究类球体与基质间的相互作用以及构建 体外 组织生理学或病理学模型...

肿瘤类球体的制备及其在聚乙二醇水凝胶中的包封用于研究类球体-基质相互作用

学习利用同轴流聚焦微流控装置封装人多能干细胞以形成球状体的方法。该技术可提高细胞存活率并保护其免受机械剪切力损伤，适用于多孔板或搅拌生物反应器培养，为规模化细胞治疗产品的开发提供高效解决方案。

微流控法制备负载人多能干细胞球体的核-壳微胶囊

探索更多视频