Name: 基于荧光的连续核酸内切酶偶联DNA甲基化测定，用于筛选DNA甲基转移酶抑制剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 学习基于荧光的连续核酸内切酶偶联DNA甲基化测定法，用于实时筛选DNA甲基转移酶抑制剂。该方法通过荧光信号监测酶活性，为癌症治疗药物研发提供高效工具。

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作者感谢布克内尔大学及化学系对本工作的支持。

1. 准备筛选实验的试剂溶液
注意：本实验中所用底物的浓度可进行调整。对于缺乏 RFTS 的 DNMT1，发夹 DNA 底物和 SAM 的实验测定 Km 值分别为 1–2 nM 和 2 µM26,40。
<ol>
	<li>在冰上准备微量离心管，每管含600 µL待测的每种实验条件。 
	注意：所需反应体系总体积取决于进行的重复次数。本方案中每种实验条件均设置三个重复。
	<ol>
		<li>向每个离心管中加入ddH2O和5x甲基化缓冲液（250 mM Tris pH 7.5，5 mM MgCl2，500 mM谷氨酸钾，5 mM二硫苏糖醇（DTT），25%甘油），使缓冲液终浓度为1x。对于含20 µM化合物的反应体系，加入472 µL ddH2O和120 µL 5x缓冲液；对于含50 µM化合物的反应体系，加入470 µL ddH2O和120 µL 5x缓冲液。</li>
		<li>向每个样品中加入3.15 µL浓度为20 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）。</li>
		<li>向每个样品中加入2 µL浓度为3.15 µM的发夹DNA底物和1.33 µL浓度为4.75 mM的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。 
		注意：底物在反应体系混合液中的浓度为所需终浓度的1.05倍。</li>
		<li>向相应样品中加入抑制剂，使其终浓度分别为21 µM（加入1.26 µL的10 mM母液）或52.5 µM（加入3.15 µL的10 mM母液）。对照样品中加入等体积的二甲基亚砜（DMSO）。 
		注意：筛选实验中使用的抑制剂浓度可根据需要调整。DMSO的最高终浓度应≤5%（v/v）。研究表明，DMSO浓度不超过5%（v/v）时对本实验检测的酶活性无影响26。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将溶液在涡旋振荡器上以3,000 rpm振荡混匀3秒，随后在台式小型离心机中以1,200 × g离心数秒，确保液体完全沉降至管底。</li>
	<li>将每种反应溶液各取95 µL，分别加入黑色半面积96孔板中的连续6个孔内（图2）。 
	注意：本筛选实验分两批进行。首先检测含20 µM抑制剂的样品（共4种条件），随后检测含50 µM抑制剂的样品（共4种条件）。</li>
</ol>
<img alt="使用彩色圆圈进行视觉数据分析的条件比较示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：检测板设置。 每种检测溶液均分装至黑色 96 孔板的六个孔中：DMSO 对照（蓝色）、化合物 1（绿色）、化合物 2（红色）和化合物 3（黄色）。在其中三个孔中同时加入缺失 RFTS 的 DNMT1 和 Gla I。作为对照，在另外三个孔中仅加入 Gla I。缩写：RFTS = 复制焦点靶向序列；DNMT1 = DNA 甲基转移酶 1；DMSO = 二甲基亚砜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 准备用于筛选的酶溶液
注意：缺失RFTS的DNMT1可在大肠杆菌（E. coli）中表达并纯化至均一。缺失RFTS的DNMT1的表达与纯化步骤此前已有描述41。所需酶的体积取决于进行检测的数量。此处每组进行四种不同的检测；每种检测均设三个重复。
<ol>
	<li>在冰上准备每个酶溶液各 75 µL，置于微量离心管中。 
	注意：需要两种酶溶液。一种溶液含有 DNMT1 和 Gla I；另一种仅含有 Gla I。
	<ol>
		<li>向每个管中加入 ddH2O 和 5x 甲基化缓冲液（250 mM Tris pH 7.5，5 mM MgCl2，500 mM 谷氨酸钾，5 mM DTT，25% 甘油），使缓冲液终浓度为 1x。对于 Gla I 酶溶液，加入 15 µL 5x 缓冲液和 58.8 µL ddH2O。对于 DNMT1+Gla I 酶溶液，加入 15 µL 5x 缓冲液和 58.2 µL ddH2O。</li>
		<li>向每种溶液中加入 1.2 µL 的 10 U/µL Gla I，使终浓度为 0.16 U/µL。</li>
		<li>向 DNMT1+Gla I 溶液中加入 0.6 µL 的 5 µM 缺乏 RFTS 结构域的 DNMT1，使终浓度为 40 nM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻轻敲击以混匀溶液。将样品在台式小型离心机中短暂离心（1,200 × g，数秒），确保溶液完全沉降至管底。</li>
	<li>将每种酶溶液各 12 µL 分装至圆底 96 孔板的 6 个孔中（图 3）。</li>
</ol>
<img alt="交替的蓝色和灰色圆圈序列模式图，用于说明周期性概念。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：酶反应板设置。 将 Gla I（灰色）和 DNMT1+Gla I（蓝色）溶液分别分装至 96 孔板中的六个孔。使用多通道移液器，可将酶同时加入一整行的检测溶液中。对于每种检测条件（六个孔），其中三个孔加入 DNMT1+Gla I，另外三个孔仅加入 Gla I。缩写：DNMT1 = DNA 甲基转移酶 1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 运行检测并分析数据。
<ol>
	<li>将酶标仪预热至 37 °C。插入含有检测溶液的黑色酶标板，振荡（双轨道，425 cpm，5 秒），然后使用激发波长 485 nm 和发射波长 528 nm 读取荧光值。在 37 °C 下孵育 5 分钟。 
	注意：也可使用具有合适截止波长的滤光片进行荧光检测。</li>
	<li>取出检测板。向每孔中加入 5 µL 酶溶液，并通过上下吹打混匀。 
	注意：建议使用多通道移液器，以便同时启动一整行样品的反应。</li>
	<li>将酶标板放回酶标仪中。每 53 秒记录一次荧光值，持续 30 分钟。每次读数前振荡酶标板（双轨道，425 cpm，4 秒）。</li>
	<li>对每种条件下的三个重复 Gla I 对照检测进行平均。从含有 RFTS 缺失型 DNMT1 的三个重复检测曲线中减去平均 Gla I 对照反应曲线。计算校正后重复样本的平均值及平均值的标准误差。</li>
	<li>绘制平均校正反应曲线，并对初始线性部分进行直线拟合，以确定初始反应速率。</li>
	<li>通过将化合物存在下的反应速率除以含 DMSO 对照反应的速率，再乘以 100，计算相对活性百分比。</li>
</ol>
4. 其他检测对照——酶的顺序添加
<ol>
	<li>在冰上准备一个微量离心管，加入550 µL的检测溶液。依次加入110 µL的5x甲基化缓冲液、3.88 µL的3.15 µM发夹DNA底物、6.43 µL的47.5 mM SAM、3.06 µL的20 mg/mL BSA以及426.6 µL的ddH2O。</li>
	<li>使用涡旋振荡器（3,000 rpm）混匀溶液，持续3秒。将样品在台式小型离心机中短暂离心（1,200 × g）数秒，确保溶液完全沉降至管底。</li>
	<li>将90 µL检测溶液分装至黑色半面积96孔板中的连续6个孔中。</li>
	<li>在冰上配制DNMT1酶溶液。在一个微量离心管中加入4 µL的5x甲基化缓冲液、0.76 µL的5 µM缺乏RFTS结构域的DNMT1以及15.24 µL的ddH2O；在另一个管中加入4 µL的5x甲基化缓冲液和16 µL的ddH2O。</li>
	<li>轻轻敲击以混匀溶液。将样品在台式小型离心机中短暂离心（1,200 × g）数秒，确保溶液完全沉降至管底。</li>
	<li>向黑色半面积96孔板中的三个孔加入5 µL含DNMT1的溶液，向其余三个孔中加入5 µL缓冲液对照溶液。</li>
	<li>将微孔板放入预热至37 °C的酶标仪中。以双轨道模式振荡（425 cpm，持续3秒），然后在激发波长485 nm、发射波长528 nm条件下读取荧光值。每60秒重复一次振荡和读数，持续30分钟。</li>
	<li>在检测板进行读数的同时，在冰上配制Gla I酶溶液。向一个微量离心管中加入8 µL的5x甲基化缓冲液、0.64 µL的10 U/µL Gla I酶以及31.4 µL的ddH2O。轻轻敲击混匀溶液，并在台式小型离心机中短暂离心（1,200 × g）数秒，确保溶液完全沉降至管底。</li>
	<li>将6 µL Gla I酶溶液分装至锥底96孔板中的6个孔中。</li>
	<li>完成初始30分钟读数后，从酶标仪中取出黑色孔板。向全部6个孔中各加入5 µL Gla I酶溶液，并通过移液器反复吹打混匀。 
	注意：建议使用多通道移液器，以确保所有孔同时开始反应。</li>
	<li>将黑色孔板重新放回酶标仪中。每35秒记录一次荧光值，持续35分钟。每次读数前均需振荡孔板（双轨道模式，425 cpm，持续3秒）。</li>
</ol>

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<li>Bashtrykov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+results+in+an+activation+of+DNA+methyltransferase+1+and+confirms+an+autoinhibitory+role+of+its+RFTS+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain.</a> Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).</li>
<li>Berkyurek, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+methyltransferase+Dnmt1+directly+interacts+with+the+SET+and+RING+finger-associated+%28SRA%29+domain+of+the+multifunctional+protein+Uhrf1+to+facilitate+accession+of+the+catalytic+center+to+hemi-methylated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

为了鉴定和表征DNA甲基转移酶抑制剂，必须测定该酶的活性。目前已有多种检测DNA甲基转移酶活性的方法。通常使用放射性标记来监测酶活性；可通过定量S-腺苷甲硫氨酸（SAM）中标记的甲基基团的转移来实现29,30,31,32,33,34。也有研究描述了基于凝胶、利用甲基敏感性内切核酸酶的检测方法35,36。这些方法通常是间断性的，需要多个步骤才能检测酶活性。本文介绍一种以内切酶偶联的DNA甲基化检测法，用于筛选潜在的DNA甲基转移酶抑制剂。该技术具有多项优势：实验操作相对简单，无需分离技术（例如，电泳、滤膜结合）即可...

DNA甲基化是一种重要的表观遗传标记，可调控基因表达和染色质结构。甲基化主要发生在CpG二核苷酸上——即胞嘧啶后接鸟苷；甲基基团被添加到胞嘧啶的5号位碳原子上。正确的DNA甲基化模式以及由此产生的正常基因表达，对于细胞的正常发育和功能至关重要。许多疾病状态均与正常的甲基化模式发生改变有关1,2,3。例如，癌症的发生和发展与DNA甲基化模式的改变密切相关。通常，癌细胞整体的甲基胞嘧啶水平较低，这会导致基因组不稳定。与此同时，基因组中残存的甲基胞嘧啶则集中在抑癌基因的启动子区域，从而导致这些重要蛋白的基因表达被沉默。值得注意的是，与肿瘤发生相关的DNA突变不同，表观遗传改变具有动态性和可逆性。这一特性使得参与表观遗传基因调控的蛋白质成为颇具吸引力的药物靶点2,4。
DNA甲基转移酶（DNMTs）是负责建立和维持DNA甲基化模式的蛋白质。人类中存在三种具有催化活性的同工酶：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。在发育和分化过程中，从头甲基转移酶DNMT3a和DNMT3b负责建立甲基化模式。这两种酶均可结合无催化活性的DNMT3L蛋白，形成具有增强活性的复合物1,5。细胞分裂后，子代细胞含有半甲基化的DNA——即双链中仅有一条链含有甲基胞嘧啶的DNA，因为新合成的DNA链不含甲基化标记。DNMT1的主要功能是对这种半甲基化DNA进行甲基化，从而重建完整的甲基化模式1,5。
DNMT 活性与癌症之间的关联已有充分证据支持。DNMT1 的过表达，无论是通过转录水平还是转录后机制，均为多种常见致癌通路的结果6,7,8,9。利用功能减弱等位基因通过遗传学手段降低 DNMT1 活性，可减少 Apc(Min) 小鼠中的肿瘤形成10。敲低 DNMT1 的反义寡核苷酸可在细胞培养和小鼠肿瘤模型中抑制肿瘤发生11,12。因此，抑制 DNMT1 活性似乎是一种有前景的癌症治疗策略。然而，DNMT3 同工酶所起的作用则较为复杂。DNMT3a 基因突变见于急性髓系白血病13 和骨髓增生异常综合征14，其中至少一种已鉴定的突变已被证实会降低该酶的 DNA 甲基化活性15。然而，DNMT3b 在乳腺癌16 和结直肠癌17 中呈过表达状态。鉴于不同 DNMT 同工酶在致癌过程中发挥着不同作用，鉴定同工酶特异性抑制剂将至关重要。这些化合物不仅有助于开发治疗药物，而且同工酶特异性抑制剂本身也将成为解析每种 DNMT 同工酶在癌症病因学中作用的宝贵工具。
文献中已报道了多种DNMT抑制剂。已知的DNMT抑制剂可分为两类：核苷类和非核苷类。核苷类抑制剂通常是胞苷类似物，这类化合物可掺入DNA中，并共价捕获DNMT。5-氮杂胞苷（5-azacytidine）和5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine）已被批准用于治疗骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病4,18。然而，这些化合物具有高毒性、低生物利用度和化学不稳定性等问题。目前的研究正在评估下一代核苷类抑制剂的疗效；例如SGI-110即是由5-aza-2'-deoxycytidine衍生而来19,20。核苷类抑制剂不具有同工酶特异性，会失活其所遇到的任何DNMT同工酶。因此，使用核苷类去甲基化试剂会导致所有DNMT同工酶的耗竭4,18。非核苷类抑制剂无需掺入DNA即可发挥抑制作用，而是直接与DNMT结合，从而有可能实现同工酶特异性的抑制。迄今为止已发现多种非核苷类抑制剂，包括SGI-102721、肼屈嗪（hydralazine）22、普鲁卡因胺（procainamide）23、RG108及其衍生物24，以及天然产物（−）-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（(−)-epigallocatechin 3-gallate, EGCG）25和胭脂红酸A（laccaic acid A）26,27。迄今为止发现的大多数非核苷类抑制剂并不具备DNMT同工酶选择性，或仅对某一DNMT同工酶表现出较弱的选择性。此外，这些分子的抑制效力仍需提高，尤其是在细胞中的活性4,18。因此，亟需发现或开发效力更强且具有同工酶选择性的DNMT抑制剂。
发现新的DNMT小分子抑制剂的一个障碍是传统上用于检测DNMT活性的实验方法极为繁琐28。这些实验通常为非连续性操作，包含多个步骤。目前仍常规使用放射性S-腺苷甲硫氨酸（SAM）来测定DNMT的酶活性29,30,31,32,33,34。此外，也已开发出非放射性的DNA甲基化检测方法。例如，已有研究描述利用甲基敏感性限制性内切酶结合电泳分离消化产物的检测方法35,36。这类非连续、多步骤的实验方法难以适用于药物发现。自2000年代中期以来，已开发出若干通量更高的DNA甲基化检测方法28。其中一种闪烁 proximity 实验（scintillation proximity assay）被用于筛选DNMT1抑制剂37。另一种利用甲基敏感性限制性内切酶的实验则被用于筛选DNMT3a抑制剂25,38。尽管这两种实验方法的通量均高于传统的DNA甲基化检测方法，但仍需多个操作步骤，且无法实时观察甲基化活性。最近，有研究报道了一种连续动力学检测方法，该方法将甲基化反应产物之一S-腺苷高半胱氨酸（SAH）的生成与NADPH氧化在340 nm处引起的光谱变化相偶联39。该检测方法利用三种偶联酶来产生可检测的光谱信号。
我们开发了一种基于荧光的内切酶偶联DNA甲基化检测方法，该方法仅需一种 commercially available 的偶联酶，即可实时生成数据（图1）。该检测使用一种包含三个甲基化胞嘧啶的发夹寡核苷酸作为底物。底物DNA的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团。半甲基化CpG位点的甲基化会形成内切酶Gla I的切割位点——完全甲基化的GCGC。Gla I对产物寡核苷酸的切割使荧光基团与淬灭基团分离，从而实时产生荧光信号。该检测可用于检测任意DNMT同工型的活性；然而，由于DNMT1优先甲基化半甲基化DNA，因此在此检测中表现出更高的活性1,5。若去除DNMT1的自抑制性复制灶靶向序列（Replication Foci Targeting Sequence, RFTS）结构域，则可观察到更强的酶活性。该结构域位于N端调控区，可结合催化位点并阻止DNA结合。去除前约600个氨基酸后，可获得截短型酶，其活性显著高于全长酶（kcat/Km提高约640倍）40。这种高活性形式的酶被称为缺失RFTS的DNMT1（氨基酸621–1616），因其催化能力增强，更易于识别抑制剂。本文提供了一项利用缺失RFTS的DNMT1进行检测的实验方案，用于筛选潜在的小分子抑制剂。通过内切酶偶联的连续检测法，在有无若干小分子存在的情况下测定初始反应速率。每种潜在抑制剂均在两个浓度下进行检测，以观察其对DNMT1活性的浓度依赖性抑制作用。在每种情况下均计算小分子存在时所测得的酶活性百分比。
<img alt="DNA甲基化示意图；DNMT1过程中的荧光、激发、发射及酶活性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62949/62949fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：DNA甲基化检测。 使用一种在5'端标记荧光基团、3'端标记淬灭基团的半甲基化发夹DNA作为底物。DNMT1催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移至未甲基化的CpG位点，生成S-腺苷高半胱氨酸和完全甲基化的DNA。该DNA产物含有内切酶Gla I的切割位点，Gla I可切割完全甲基化的GCGC位点。产物DNA被切割后，5'端荧光基团与3'端淬灭基团分离，从而产生荧光信号。缩写：Fl = 荧光基团；Q = 淬灭基团；DNMT1 = DNA甲基转移酶1；SAM = S-腺苷甲硫氨酸；SAH = S-腺苷高半胱氨酸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62949/62949fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>96孔半面积黑色平底聚苯乙烯未处理微孔板</td><td>Corning</td><td>3694</td><td></td></tr><tr><td>96孔聚苯乙烯锥底板</td><td>ThermoFisher</td><td>249570</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>化合物1</td><td>ChemBridge</td><td>5812086</td><td>筛选化合物；用DMSO重悬至10 mM</td></tr><tr><td>化合物2</td><td>ChemBridge</td><td>6722175</td><td>筛选化合物；用DMSO重悬至10 mM</td></tr><tr><td>化合物3</td><td>ChemBridge</td><td>5249376</td><td>筛选化合物；用DMSO重悬至10 mM</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Gla I</td><td>SibEnzyme</td><td>E494</td><td>甲基敏感性内切核酸酶</td></tr><tr><td>甘油</td><td>RPI</td><td>G22025</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸（5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-爱荷华黑淬灭剂）</td><td>IDT</td><td>定制合成</td><td>内部淬灭发夹DNA（底物）</td></tr><tr><td>谷氨酸钾</td><td>Sigma</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>S-腺苷甲硫氨酸</td><td>Sigma</td><td>A4377</td><td>甲基供体辅因子（底物）</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr></tbody></table>

基于连续荧光的核酸内切酶偶联dna甲基化检测法筛选dna甲基转移酶抑制剂

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA甲基化是一种表观遗传基因调控形式，对细胞正常功能至关重要。在细胞中，一类称为DNA甲基转移酶（DNMTs）的蛋白质负责建立并维持DNA甲基化模式。正常DNA甲基化模式的改变与癌症的发生和发展相关，因此DNMTs成为潜在的抗癌药物靶点。因此，发现并表征这些酶的新颖小分子抑制剂具有重要意义。本文介绍了一种可用于筛选DNA甲基转移酶抑制剂的实验方案。该连续偶联动力学检测方法能够在存在或不存在潜在小分子抑制剂的条件下，测定DNA甲基化反应的初始速率。该检测利用甲基敏感性内切酶Gla I，将半甲基化DNA底物的甲基化过程与荧光信号的产生相偶联。
该连续检测法可实时监测酶活性。在微量滴定板中以小体积进行检测，可降低试剂成本。利用此检测方法，我们对DNMT1（人类中最丰富的DNA甲基转移酶同工酶）的抑制剂进行了一个小规模示例筛选。高度取代的蒽醌类天然产物——虫漆酸A，是一种强效的、与DNA竞争性结合的DNMT1抑制剂。本文中，我们选取了三种潜在的小分子抑制剂——含有一至三个取代基的蒽醌或类蒽醌分子——在两个浓度下进行测试，以阐述该检测方案。通过初始反应速率计算各分子存在下的酶活性百分比。所检测的三种化合物中，有一种表现出浓度依赖性的DNMT1活性抑制，表明其可能是DNMT1的潜在抑制剂。

活性DNMT1是进行此分析的前提条件。缺失RFTS结构域的DNMT1在大肠杆菌（E.coli）中表达，并按照先前发表的方法纯化至均一状态41。为确保所纯化的酶具有活性，采用了一种不连续的内切酶偶联检测法来评估其DNA甲基化活性36。该检测使用一条32个碱基对的双链DNA，其中包含一个位于Sau3A1切割位点内的半甲基化CpG位点。Sau3A1能够切割半甲基化的底物DNA；然而，当DNA完全甲基化后，切割作用则被阻断。在含有1 µM DNA和0.5 mM SAM的反应体系中加入缺失RFTS的DNMT1，每隔一定时间取样并迅速冷冻，持续30分钟。随后，样品经Sau3A1消化，并通过凝胶电泳分离产物。如图4所示，随着反应时间延长，DNA逐渐免于被切割，表明缺失RFTS的DNMT1正在对半甲基化DNA进行甲基化修饰。在30分钟的时间过程中，反应体系中最初存在的1 µM底物DNA大部分已被转化为产物。
本文所述的内切酶偶...

DNA甲基转移酶是潜在的抗癌药物靶点。本文介绍了一种评估小分子抑制DNA甲基转移酶活性的实验方案。该检测方法利用一种限制性内切酶将DNA甲基化与荧光信号生成偶联，从而实现对酶活性的实时监测。&#160;

基于连续荧光的核酸内切酶偶联DNA甲基化检测法筛选DNA甲基转移酶抑制剂

DNA甲基化是一种表观遗传基因调控形式，对细胞正常功能至关重要。在细胞中，一类称为DNA甲基转移酶（DNMTs）的蛋白质……

像我们所采用的这种稳健的酶标仪检测方法，对于初步筛选潜在的甲基转移酶抑制剂非常有用。这种与内切酶偶联的连续检测方法具有实时收集数据的优势。首先，在冰上的微量离心管中，分别配制含有20微摩尔和50微摩尔化合物的反应体系，每种体系准备600微升。为此，向每个试管中加入重蒸水和5倍浓度的甲基化缓冲液，使甲基化缓冲液的终浓度为1倍浓度。接着，向每个样品中加入3.15 µL浓度为20 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）。然后，向每个样品中加入2 µL浓度为3.15 µmol/L的发夹DNA底物以及1.33 µL浓度为4.75 µmol/L的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。向适当的样品中加入抑制剂，使其终浓度达到21微摩尔或52.5微摩尔，并向对照样品中加入等量的二甲基亚砜（DMSO），然后在3,000转/分钟条件下涡旋混匀3秒。随后，将样品在台式小型离心机中以1,200 × g离心数秒，确保溶液完全沉降至管底。将每种检测溶液各95微升分装至黑色半区96孔板中的连续六个孔中。按照之前所述方法，在微量离心管中配制 75 微升 Gla I 或 DNMT1 加 Gla I 酶溶液，使缓冲液的终浓度为 1 倍。接着，向每种溶液中加入 1.2 微升浓度为每微升 10 单位的 Gla I，使 Gla I 的终浓度达到每微升 0.16 单位。向 DNMT1 加 Gla I 溶液中加入 0.6 微升浓度为 5 微摩尔的缺乏 RFTS 结构域的 DNMT1，使其终浓度为 40 纳摩尔。轻轻混匀后，在台式小型离心机中以1,200 ×g离心数秒，确保溶液完全沉降至管底。随后，将每种酶溶液各12 µL分装至96孔圆底板的六个孔中。进行DNA样品的甲基化检测时，提前将酶标仪预热至37 °C。然后，将含有检测溶液的黑色酶标板放入酶标仪中。以425 CPM的转速振板后，用485纳米的激发波长和528纳米的发射波长测定荧光值。随后，将酶标板在37摄氏度下孵育5分钟。从酶标仪中取出检测板，向每孔加入5 µL酶溶液，然后通过上下吹打混合溶液。将检测板插入酶标仪，在30分钟内每53秒记录一次荧光值，记录前需振荡检测板。获取每种条件下三份重复的Gla I对照检测的平均荧光值，并从含有RFTS缺失型DNMT1的三份重复检测曲线中减去含Gla I的对照反应孔的平均荧光值。然后，计算校正后重复实验数据的平均值及平均值的标准误差。绘制校正后的平均反应曲线，并对初始线性部分进行直线拟合，以确定初始反应速度。通过将化合物存在下的反应速度除以含DMSO的对照反应中的速度，再乘以100，计算出相对活性百分比。非连续性内切酶偶联实验的结果显示，完全甲基化的产物DNA可免于被切割，证实缺失RFTS结构域的DNMT1具有活性，并能够甲基化半甲基化的底物DNA。在基于荧光的实验中，在不添加Gla I的情况下，单独加入DNMT1或缓冲液均未影响背景荧光信号。随后向所有反应体系中加入Gla I后，仅在含有DNMT1的反应中检测到荧光信号的产生。在三个实验中同时加入缺失RFTS的DNMT1和Gla I，均产生了强烈的荧光信号。单独加入Gla I则未产生荧光。为筛选潜在抑制剂，检测了在二甲基亚砜（DMSO）、化合物一、化合物二或化合物三分别处于20和50微摩尔浓度下，缺失RFTS的DNMT1的DNA甲基化活性。在此偶联检测中能够降低荧光生成的化合物必须经过进一步验证。确保这些化合物未抑制偶联酶的活性是接下来的重要步骤。

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