使用噬菌体显示开发用于E3连接酶的泛素变体调节剂
August 27th, 2021
泛素化是翻译后修饰的关键蛋白质，其失调与许多人类疾病有关。该协议详细介绍了如何利用噬菌体显示来分离新的泛素变体，这些变体可以结合和调节控制泛素特异性，效率和模式的E3连接酶的活性。
噬菌体展示不仅有助于我们研究临床上重要酶的结合特性，而且还开发出这些酶和相应疾病的调节剂。噬菌体显示可用于开发各种靶蛋白的新型粘合剂，并且比其他常规显示方法更容易执行。这个过程涉及很多重复的动作，所以关键是不要自动驾驶，并始终保持专注。
首先接种30毫升2YT四环素肉汤和200微升种子培养物。在37摄氏度下孵育约三个小时，200 RPM的轨道振荡，直到细菌处于对数中期。将涂层溶液从板中丢弃到水槽中。
用纸巾轻轻擦干。然后向每个包被孔中加入200微升PB缓冲液。从盘子中丢弃PB缓冲液，并在纸巾上干燥。
向板的每个包被孔中再加入200微升PB缓冲液。在室温下孵育一小时，300 RPM的轨道振荡。在冰上解冻噬菌体库，然后将其稀释至PBS中文库多样性的100倍。
以稀释的文库体积的五分之一加入聚乙二醇氯化钠溶液，并将溶液在冰上孵育30分钟。接下来，将溶液以11， 000倍G在4摄氏度下离心30分钟。弃去上清液并再离心两分钟以拉下剩余的上清液并浓缩噬菌体沉淀。
将噬菌体沉淀轻轻重悬于一毫升PBT缓冲液中，每个要分析的目标蛋白质，通常总共四个。向对照板中的每个包衣孔中加入100微升噬菌体文库。在室温下孵育一小时，300 RPM的轨道振荡。
将目标板中的PB缓冲液丢弃到水槽中，并在纸巾上干燥板。将对照板中噬菌体文库的所有100微升转移到目标板的每个包衣孔中。在室温下孵育一小时，300 RPM的轨道振荡。
接下来，从板中取出噬菌体文库，并用PT缓冲液洗涤包被的孔四次。倒置盘子并点击纸巾以除去最后一滴缓冲液。向每个包被孔中加入100微升0.1摩尔盐酸以洗脱噬菌体。
将板在室温下孵育五分钟，300 RPM轨道振荡。之后，通过向每个包被的孔中加入12.5微升pH 11摩尔三盐酸盐来中和pH值。将所有八个孔中洗脱的噬菌体转移到单个1.5毫升微量离心管中。
在转移过程中上下移液，使溶液均匀，并从孔中吸出所有液体。向洗脱的噬菌体中加入10%BSA，使最终浓度为1%，将微量离心管储存在4摄氏度。这是第一轮输出。
准备种子培养物，通过用从琼脂平板中分离的大肠杆菌菌落接种5毫升2YT四环素种子培养物，用于培养下一轮选择的噬菌体投入物。在37摄氏度下孵育过夜，200 RPM轨道振荡。用适量的PBS稀释第二轮和第三管中的目标蛋白。
取第二轮和第三轮试管内容物的一半，并在96孔结合板中为每个目标蛋白质涂覆四孔，以备下一轮使用。接下来，使用第一轮输出的一半接种三毫升的中间对数相细胞。在37摄氏度下孵育30分钟，200 RPM轨道振荡。
将M13KO7辅助噬菌体加入每毫升100亿PFU的终浓度。在37摄氏度下再次孵育一小时，200 RPM轨道振荡。一小时后，将整个三毫升培养物转移到30毫升2YT羧苄青霉素卡那霉素溶液中。
在37摄氏度下生长过夜，200 RPM轨道振荡。这里显示了针对UBE4B的泛素变体选择的代表性结果。UBV按从最高到最低频率排序。
序列代表UBV中具有所有随机残基的多样化泛素区域。结合剂与野生型靶蛋白，突变靶蛋白以及脱靶蛋白的相对结合亲和力通过酶联免疫吸附测定或ELISA测量。所有ELISA吸光度均根据96个平均BSA ELISA评分和96个平均GST ELISA评分进行标准化。
深绿色表示较强的相对结合。GST作为非特异性结合的对照包括在内，因为目标蛋白被GST标记。ELISA结果以图形方式显示在此处。
x 轴表示 UBV，y 轴表示相应的归一化吸光度。在尝试此过程时，重要的是在添加盐酸后不要将溶液丢弃在板中。噬菌体现在悬浮在溶液中，您希望保留这些噬菌体，以便您可以执行后续的富集最终分析或两者兼而有之。
按照此过程，应进行测序以确定UBV频率。ELISA和IC50测定可以分别确定结合功效和抑制功效，也有助于确定进一步表征哪些UBV。
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概述
本文讨论了使用噬菌体展示法来分离能够调节涉及泛素化的E3连接酶的新型泛素变体。泛素化是一种与多种人类疾病相关的关键翻译后修饰。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 蛋白质工程
背景
- 泛素化对于调节蛋白降解和细胞过程至关重要。
- 泛素化失调与众多疾病相关。
- 噬菌体展示是发现蛋白质相互作用的强大技术。
- 这种方法允许开发酶的特异性调节剂。
研究目的
- 使用噬菌体展示法分离新型泛素变体。
- 了解这些变体如何影响E3连接酶活性。
- 探索泛素调节在疾病背景下的影响。
使用的方法
- 在2YT四环素肉汤中接种细菌培养物。
- 在37摄氏度下进行轨道摇床培养。
- 利用噬菌体展示技术进行结合测定。
- 分离和表征泛素变体。
主要结果
- 成功分离新型泛素变体。
- 展示了与E3连接酶的结合特性。
- 这些变体可能调节泛素化模式。
- 对泛素化在疾病机制中的作用有了新的认识。
结论
- 噬菌体展示是发现泛素变体的有效方法。
- 调节E3连接酶活性可能具有治疗意义。
- 需要进一步研究以探索这些发现的临床应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Phage display-driven engineering of ubiquitin variants (UbVs) enables precise modulation of E3 ligases, a critical inflection point for target validation in ubiquitin-proteasome system research. This approach enhances predictive confidence in early discovery by generating high-affinity, specific binders for mechanistic de-risking and functional interrogation of E3 ligase biology. The resulting UbVs support portfolio triage and prioritization by providing robust tools for downstream assay development and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of E3 ligase function using engineered UbVs with improved affinity and specificity.
- Supports biological de-risking by isolating variants that discriminate between wildtype and mutant or off-target proteins.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and mechanistic studies through iterative selection and enrichment.
Screening & Assay Development
- Provides validated UbVs for use in ELISA and IC50 assays to quantify binding and inhibitory efficacy.
- Enables reproducible, quantitative assessment of UbV-target interactions across multiple rounds of selection.
- Supports assay standardization and scalability for reliable compound evaluation and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered UbVs with disease-relevant E3 ligases for translational biomarker studies when supported by downstream characterization.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling further functional and inhibitory profiling of selected UbVs.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by providing specific molecular tools for pathway interrogation.
Pipeline & Workflow Integration
This phage display platform integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative assay development for E3 ligase modulators.
- Discovery Biology: Iterative selection and enrichment clarify E3 ligase binding pathways and validate target engagement.
- Screening: ELISA and IC50 assays with UbVs deliver reproducible, quantitative outputs for downstream evaluation.
- Analytics: Sequencing and absorbance normalization enable robust comparison of UbV binding profiles and selection frequencies.
- Translational Research: Characterized UbVs can be advanced for further disease-relevant studies as supported by binding and inhibition data.
- Enterprise Reuse: The phage display workflow is adaptable for diverse E3 ligases and other protein targets, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in E3 ligase target validation.
- Operational Value: Standardizes binder selection and assay development for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of E3 ligase modulators across discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, protein engineering, and quantitative binding assays.
- Demands access to bacterial culture, phage handling, and ELISA instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of selection, washing, and analytical protocols.
- Adaptable to various E3 ligases and target proteins with appropriate library design.
- Dependent on rigorous washing and selection to avoid enrichment of weak or promiscuous binders.
