使用噬菌体显示开发用于E3连接酶的泛素变体调节剂

噬菌体展示不仅有助于我们研究临床上重要酶的结合特性，而且还开发出这些酶和相应疾病的调节剂。噬菌体显示可用于开发各种靶蛋白的新型粘合剂，并且比其他常规显示方法更容易执行。这个过程涉及很多重复的动作，所以关键是不要自动驾驶，并始终保持专注。

首先接种30毫升2YT四环素肉汤和200微升种子培养物。在37摄氏度下孵育约三个小时，200 RPM的轨道振荡，直到细菌处于对数中期。将涂层溶液从板中丢弃到水槽中。

用纸巾轻轻擦干。然后向每个包被孔中加入200微升PB缓冲液。从盘子中丢弃PB缓冲液，并在纸巾上干燥。

向板的每个包被孔中再加入200微升PB缓冲液。在室温下孵育一小时，300 RPM的轨道振荡。在冰上解冻噬菌体库，然后将其稀释至PBS中文库多样性的100倍。

以稀释的文库体积的五分之一加入聚乙二醇氯化钠溶液，并将溶液在冰上孵育30分钟。接下来，将溶液以11， 000倍G在4摄氏度下离心30分钟。弃去上清液并再离心两分钟以拉下剩余的上清液并浓缩噬菌体沉淀。

将噬菌体沉淀轻轻重悬于一毫升PBT缓冲液中，每个要分析的目标蛋白质，通常总共四个。向对照板中的每个包衣孔中加入100微升噬菌体文库。在室温下孵育一小时，300 RPM的轨道振荡。

将目标板中的PB缓冲液丢弃到水槽中，并在纸巾上干燥板。将对照板中噬菌体文库的所有100微升转移到目标板的每个包衣孔中。在室温下孵育一小时，300 RPM的轨道振荡。

接下来，从板中取出噬菌体文库，并用PT缓冲液洗涤包被的孔四次。倒置盘子并点击纸巾以除去最后一滴缓冲液。向每个包被孔中加入100微升0.1摩尔盐酸以洗脱噬菌体。

将板在室温下孵育五分钟，300 RPM轨道振荡。之后，通过向每个包被的孔中加入12.5微升pH 11摩尔三盐酸盐来中和pH值。将所有八个孔中洗脱的噬菌体转移到单个1.5毫升微量离心管中。

在转移过程中上下移液，使溶液均匀，并从孔中吸出所有液体。向洗脱的噬菌体中加入10%BSA，使最终浓度为1%，将微量离心管储存在4摄氏度。这是第一轮输出。

准备种子培养物，通过用从琼脂平板中分离的大肠杆菌菌落接种5毫升2YT四环素种子培养物，用于培养下一轮选择的噬菌体投入物。在37摄氏度下孵育过夜，200 RPM轨道振荡。用适量的PBS稀释第二轮和第三管中的目标蛋白。

取第二轮和第三轮试管内容物的一半，并在96孔结合板中为每个目标蛋白质涂覆四孔，以备下一轮使用。接下来，使用第一轮输出的一半接种三毫升的中间对数相细胞。在37摄氏度下孵育30分钟，200 RPM轨道振荡。

将M13KO7辅助噬菌体加入每毫升100亿PFU的终浓度。在37摄氏度下再次孵育一小时，200 RPM轨道振荡。一小时后，将整个三毫升培养物转移到30毫升2YT羧苄青霉素卡那霉素溶液中。

在37摄氏度下生长过夜，200 RPM轨道振荡。这里显示了针对UBE4B的泛素变体选择的代表性结果。UBV按从最高到最低频率排序。

序列代表UBV中具有所有随机残基的多样化泛素区域。结合剂与野生型靶蛋白，突变靶蛋白以及脱靶蛋白的相对结合亲和力通过酶联免疫吸附测定或ELISA测量。所有ELISA吸光度均根据96个平均BSA ELISA评分和96个平均GST ELISA评分进行标准化。

深绿色表示较强的相对结合。GST作为非特异性结合的对照包括在内，因为目标蛋白被GST标记。ELISA结果以图形方式显示在此处。

x 轴表示 UBV，y 轴表示相应的归一化吸光度。在尝试此过程时，重要的是在添加盐酸后不要将溶液丢弃在板中。噬菌体现在悬浮在溶液中，您希望保留这些噬菌体，以便您可以执行后续的富集最终分析或两者兼而有之。

按照此过程，应进行测序以确定UBV频率。ELISA和IC50测定可以分别确定结合功效和抑制功效，也有助于确定进一步表征哪些UBV。