Name: 使用噬菌体显示开发用于E3连接酶的泛素变体调节剂 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 了解如何使用噬菌体显示技术分离新型泛素变体以调节E3连接酶活性。该方法有助于研究蛋白质降解调控机制并探索疾病治疗潜力。

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泛素变体技术由多伦多大学Sachdev Sidhu博士的实验室研发。WZ目前是人类领域CIFAR Azrieli全球学者 &amp;#38; 微生物组计划。本研究由授予 WZ 的加拿大自然科学与工程研究委员会发现基金（NSERC Discovery Grants，项目编号：RGPIN-2019-05721）资助。

1. 试剂制备
<ol>
	<li>PBS（磷酸盐缓冲液）：将50 mL的10倍浓缩PBS溶液与450 mL超纯H2O混合。过滤除菌后，于4 °C或室温（~20–25 °C）保存。</li>
	<li>10% BSA（牛血清白蛋白）：缓慢将1 g BSA加入7 mL超纯H2O中，搅拌至完全溶解（无结块）。用超纯H2O定容至终体积10 mL。过滤除菌后，于4 °C保存。</li>
	<li>PB缓冲液（含1% BSA的PBS）：缓慢将5 g BSA加入400 mL超纯H2O和50 mL PBS中，搅拌至完全溶解（无结块）。用超纯H2O定容至终体积500 mL。过滤除菌后，于4 °C保存。</li>
	<li>PBT缓冲液（含1% BSA和0.05% Tween 20的PBS）：缓慢将5 g BSA加入400 mL超纯H2O和50 mL PBS中，搅拌至完全溶解（无结块）。加入250 µL Tween 20。用超纯H2O定容至终体积500 mL。过滤除菌后，于4 °C保存。</li>
	<li>PT缓冲液（含0.05% Tween 20的PBS）：将1 mL Tween 20加入400 mL PBS中，混合均匀。用超纯H2O定容至终体积2 L。过滤除菌后，于4 °C或室温（~20–25 °C）保存。</li>
	<li>2YT培养基：将16 g胰蛋白胨、10 g酵母提取物和5 g NaCl加入800 mL超纯H2O中，搅拌至完全溶解（无结块）。用超纯H2O定容至终体积1 L。高压灭菌后，于室温（~20–25 °C）保存。</li>
	<li>LB/氨苄青霉素平板：将12.5 g预混LB培养基和7.5 g琼脂加入400 mL H2O中。用超纯H2O定容至终体积500 mL，高压灭菌。确保琼脂完全溶解，待冷却至60 °C以下后，加入500 µL浓度为100 mg/mL的羧苄青霉素，充分混匀后倒入培养皿。于4 °C保存。</li>
	<li>LB/四环素平板：将12.5 g预混LB培养基和7.5 g琼脂加入400 mL超纯H2O中。用超纯H2O定容至终体积500 mL，高压灭菌。确保琼脂完全溶解，待冷却至60 °C以下后，加入500 µL浓度为10 mg/mL的四环素，充分混匀后倒入培养皿。于4 °C保存。</li>
	<li>20% PEG（聚乙二醇）/2.5 M NaCl：将50 g PEG-8000和36.5 g NaCl加入200 mL超纯H2O中，搅拌至完全溶解。 
	注意：此过程可能耗时较长，可适当加热以助溶解。用超纯H2O定容至终体积250 mL。可通过过滤或高压灭菌进行灭菌。</li>
	<li>0.1 M HCl：将20 mL 1 M HCl与180 mL超纯H2O混合。过滤除菌后，于室温（~20–25 °C）保存。</li>
	<li>1 M Tris（pH 11.0）：将6.1 g Tris碱加入40 mL超纯H2O中，用HCl调节pH至11.0，并搅拌至Tris完全溶解。用超纯H2O定容至终体积50 mL。过滤除菌后，于室温（~20–25 °C）保存。</li>
	<li>100 mg/mL（1000倍浓缩）羧苄青霉素：将2 g羧苄青霉素二钠盐加入20 mL超纯H2O中，搅拌至完全溶解。过滤除菌后，于-20 °C保存。</li>
	<li>50 mg/mL（1000倍浓缩）卡那霉素：将1 g硫酸卡那霉素加入20 mL超纯H2O中，搅拌至完全溶解。过滤除菌后，于-20 °C保存。</li>
	<li>10 mg/mL（1000倍浓缩）四环素：将0.2 g盐酸四环素加入20 mL 70%乙醇中，搅拌至完全溶解。过滤除菌后，于-20 °C保存。</li>
</ol>
2. 蛋白质制备
<ol>
	<li>测定目标蛋白储备液的浓度（单位：µM）。最便捷的蛋白浓度测定方法是测量蛋白储备液在280 nm处的吸光度。若浓度已知单位为mg/mL，可利用目标蛋白的分子量将其换算为µM。具体方法可根据目标蛋白的特性选择；详见讨论部分。 
	注意：若蛋白为截短形式（特定蛋白结构域/基序）或带有标签，需在将mg/mL换算为µM时考虑分子量的相应变化。</li>
	<li>准备三个已标记为“第1轮”、“第2/3轮”和“第4/5轮”的微量离心管。
	<ol>
		<li>计算将蛋白稀释至800 µL PBS中浓度为1 µM所需的蛋白体积，并将该体积的蛋白分装至各管中，暂不加入PBS。 
		​注意：若目标蛋白的可用量较少，浓度可降低至最低0.25 µM。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 第一轮筛选的准备工作
<ol>
	<li>准备用于第二轮筛选的噬菌体输入培养的种子培养物。
	<ol>
		<li>用单个分离良好的 Escherichia coli 菌落接种 5 mL 的 2YT/tet 培养基，在 37 °C、200 rpm 振荡条件下过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包被用于第一轮筛选的平板。
	<ol>
		<li>用适量 PBS 稀释“第1轮”管中的靶蛋白，并将 100 µL 分装至 96 孔结合板的八个孔中（即靶标板）。 
		​注意：通过在平板角落的孔中包被，可在同一块平板上同时进行四种不同蛋白的噬菌体展示筛选。</li>
		<li>可选对照：如果靶蛋白带有标签（如 GST 或 MBP（麦芽糖结合蛋白）），则在另一块 96 孔结合板中，将 100 µL 浓度为 1 µM 的相应表位标签溶液包被至八个孔中。该对照用于去除非特异性结合标签的不期望噬菌体。</li>
		<li>在 4 °C、200 rpm 振荡条件下过夜孵育平板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 第一轮筛选
<ol>
	<li>准备第二轮输入。
	<ol>
		<li>取步骤 3.1 中的种子培养物 200 µL 接种至 30 mL 的 2YT/tet 培养基中。</li>
		<li>在 37 °C、200 rpm 振荡条件下培养，直至细菌进入对数中期（OD600 <img alt="静力平衡符号 ΣF=0，图示力平衡概念及计算方法。" src="/files/ftp_upload/62950/62950eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"> 0.6 - 0.8），约需 3 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭目标板。
	<ol>
		<li>将包被板（若已制备对照板，则包括两块板）倒置并在水槽上方轻摇，去除包被液，然后用纸巾拍干。</li>
		<li>向每个包被孔中加入 300 µL PB 缓冲液。</li>
		<li>参照步骤 4.2.1 去除 PB 缓冲液，再向每孔加入 200 µL PB 缓冲液。</li>
		<li>在室温（约 20–25 °C）下以 300 rpm 振荡孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备噬菌体文库。
	<ol>
		<li>将噬菌体文库置于冰上解冻，并用 PBS 稀释至文库多样性（diversity）的 100 倍。例如，若文库多样性为 1 × 1010，文库浓度为 1 × 1013，则应将文库稀释至浓度为 1 × 1012。对于本实验所用文库，可将 1 mL 文库与 9 mL PBS 混合，实现 10 倍稀释。 
		注：文库多样性应在文库构建过程中确定，通常无法轻易重新评估。文库浓度可通过将处于对数中期（OD600 <img alt="静力平衡符号 ΣF=0，图示力平衡概念及计算方法。" src="/files/ftp_upload/62950/62950eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"> 0.6 - 0.8）的 E. coli 细胞接种并在 LB/carb 培养基上涂布来测定。</li>
		<li>加入 PEG/NaCl 至终体积的 1/5。例如，对于 10 mL 已稀释的文库，加入 2 mL PEG/NaCl。</li>
		<li>在冰上孵育 30 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 下以 11,000 × g 离心 30 分钟，弃上清液，再以相同转速离心 2 分钟以去除残留上清液。 
		注：第二次离心时，应将离心管以与第一次相同的朝向放入转子中，以确保沉淀位于同一位置，便于观察。</li>
		<li>每种蛋白使用 1 mL PBT 轻柔重悬噬菌体沉淀。对于四种蛋白，使用 4 mL PBT 重悬沉淀。 
		注：操作时尽量避免触碰沉淀，且不要引入气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使噬菌体与目标蛋白结合。
	<ol>
		<li>可选对照步骤：向对照板的每个包被孔中加入 100 µL 噬菌体文库，在室温（约 20–25 °C）下以 300 rpm 振荡孵育 1 小时，然后将文库从对照板转移至目标板。跳过步骤 4.4.2。</li>
		<li>参照步骤 4.2.1 去除目标板中的 PB 缓冲液，向每个包被孔中加入 100 µL 噬菌体文库。</li>
		<li>在室温（约 20–25 °C）下以 300 rpm 振荡孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗脱第一轮噬菌体。
	<ol>
		<li>去除噬菌体文库，并用 PT 缓冲液清洗包被孔 4 次。将板倒置并在纸巾上轻拍，去除最后的液滴。 
		注：若一块板上包被了多种目标蛋白，应尽量减少后续溶液在各孔之间的流动。</li>
		<li>向每个包被孔中加入 100 µL 0.1 M HCl，在室温下以 300 rpm 振荡孵育 5 分钟。</li>
		<li>通过向每个包被孔中加入 12.5 µL 1 M Tris-HCl（pH 11）中和 pH。</li>
		<li>将全部 8 个孔中洗脱的噬菌体合并至一个 1.5 mL 微量离心管中。转移过程中反复吹打以混匀溶液，并吸净所有孔中的液体。</li>
		<li>向合并的洗脱噬菌体中加入 10% BSA，使其终浓度为 1%。对于典型的首轮洗脱体积 950 µL，加入 95 µL 10% BSA。4 °C 保存。此即为第一轮输出产物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 后续筛选轮次的准备工作
<ol>
	<li>按照步骤 3.1 的方法制备用于培养下一轮筛选噬菌体输入的种子培养物。</li>
	<li>按照步骤 3.2 的方法对第三轮筛选的平板进行包被，但需进行如下修改：
	<ol>
		<li>在 96 孔结合板中，每种蛋白质仅包被四个孔。使用“第 2/3 轮”或“第 4/5 轮”管中一半的内容物用于相应的轮次。根据需要稀释这些管中的内容物，以避免蛋白质从溶液中沉淀析出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备下一轮筛选所需的噬菌体输入物。
	<ol>
		<li>取步骤 4.5.5 中第一轮输出物的一半，接种于步骤 4.1 中的 3 mL 对数中期细胞中。对于典型的第 1 轮输出物，使用 500 µL 输出物进行接种。</li>
		<li>在 37 °C 下以 200 rpm 振荡培养 30 分钟。</li>
		<li>加入 M13K07 辅助噬菌体，使其终浓度达到 1 x 1010 PFU/mL。</li>
		<li>在 37 °C 下以 200 rpm 振荡培养 1 小时。</li>
		<li>将全部 3 mL 培养物转移至 30 mL 的 2YT/carb/kan 培养基中，在 37 °C 下以 200 rpm 振荡过夜培养。</li>
		<li>次日，将培养物转移至 50 mL 离心管中，在 4 °C 下以 11,000 x g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>将上清液倾入新的 50 mL 离心管中，加入 8 mL PEG/NaCl，冰上孵育 10 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 下以 11,000 x g 离心 10 分钟，弃去上清液后再次离心 2 分钟。 
		注意：第二次离心时应将离心管在转子中保持与第一次相同的朝向，以确保沉淀位于同一位置，便于观察。</li>
		<li>用 800 µL PBT 重悬噬菌体沉淀，使其完全均匀，无可见团块。</li>
		<li>将噬菌体溶液转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 4 °C 下以 16,200 x g 离心 4 分钟，以沉淀杂质。</li>
		<li>将上清液转移至新的微量离心管中。此即为下一轮筛选的输入物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：对输入和输出溶液进行滴度测定。
	<ol>
		<li>使用 500 µL 的 E. coli 种子培养物接种 5 mL 的 2YT/tet 培养基，在 37 °C 下以 200 rpm 振荡培养，直至细菌进入对数中期（OD600 <img alt="静力平衡符号 ΣF=0，图示力平衡概念与计算方法。" src="/files/ftp_upload/62950/62950eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"> 0.6 - 0.8）。此过程约需 1 小时。</li>
		<li>将噬菌体输入/输出溶液用 PBS 稀释至 10-3  - 10-5，取每种稀释液 10 µL 加入 90 µL 培养细胞中。 
		注意：稀释后的噬菌体溶液应立即使用，因为噬菌体会随时间吸附到管壁上，可能导致转化出现假阴性结果。</li>
		<li>在 37 °C 下以 200 rpm 振荡培养 20 分钟。</li>
		<li>取 5 µL 分别涂布于不同的 LB/carb 平板上。 
		​注意：涂布量可根据先前结果或个人偏好进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 后续多轮筛选
<ol>
	<li>按照步骤3和4的相应方法进行后续每一轮操作及准备，但需注意以下差异。
	<ol>
		<li>使用上一轮产生的产物作为噬菌体来源，而非文库。每种靶蛋白包被4个孔，每孔加入100 µL上一轮获得的噬菌体输入液。将剩余的噬菌体输入液储存于4 °C。</li>
		<li>在每一轮筛选中逐步增加步骤4.5.1中洗涤步骤的严格程度。第一轮需洗涤4次，第二轮6次，第三轮8次，第四轮和第五轮均需洗涤10次。</li>
		<li>由于后续轮次仅包被4个孔而非8个孔，因此需减少部分试剂体积。例如，在步骤4.5.5中仅向噬菌体输出液中加入45 µL的10% BSA，而在步骤5.3.1中仅用250 µL的噬菌体输出液接种细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 筛选后处理与噬菌体分离
<ol>
	<li>对第四轮和第五轮的输入液与输出液进行滴定。
	<ol>
		<li>如果尚未在步骤 5.4 中完成，请按照相同步骤对第四轮和第五轮的噬菌体输出液进行滴定，理想情况下应在几块平板上获得 30–300 个菌落的范围。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养并分离噬菌体。
	<ol>
		<li>向 96 孔微型管培养盒的每个管中分装 450 µL 的 2YT/羧苄青霉素/M13K07 液体培养基。</li>
		<li>从步骤 7.1 的任意平板中挑选分离良好的单菌落，接种至各管中。 
		注意：使用盒子的上半部分存放第四轮输出样品，下半部分存放第五轮输出样品。</li>
		<li>在 37 °C、200 rpm 振荡条件下过夜培养。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 1,200 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>尽可能多地将上清液转移至新的 96 孔微型管培养盒中，避免扰动细胞沉淀，并丢弃旧的培养盒。将新培养盒置于 4 °C 保存。</li>
		<li>从新培养盒中，将每管 100 µL 上清液转移至一个 96 孔非结合板中，该板各孔已预先加入 100 µL 50% 甘油。充分混匀后，于 -80 °C 保存作为备份菌种库。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

如步骤2.1（蛋白质制备）中所述，可采用多种方法测定蛋白质浓度，而每种方法的优缺点均取决于用于噬菌体展示的具体靶蛋白。有关常用方法的详细描述和实验方案，先前已有文献提供11。
将前一轮噬菌体展示中保留下来的噬菌体作为下一轮的输入，可通过逐步去除弱结合、瞬时结合或非特异性结合的噬菌体，从而富集出高亲和力的结合子。理想情况下，在第四轮和第五轮后，将明显富集到少数特定的肽序列，从而揭示目标蛋白的结合偏好性。
本方案已针对UbV文库的使用进行了优化。尽管这些步骤通常可能适用于其他类型的文库（例如肽段、抗体等），但很可能需要进行相应调整以适应非UbV文库。如步骤4.3.1中所述，在进行噬菌体展示之前，应事先了解文库的多样性及浓度。有关如何确定这些文库特性的更多信息，请参见本实验所用UbV文库构建所依据的方案12。
噬菌体展示实验结果可能非常明确，能够呈现出明显值得进一步表征的候选结合物。...

了解蛋白质-蛋白质相互作用的分子细节对于阐明生物过程中的信号转导机制至关重要，特别是那些与临床重要疾病相关的机制。近年来，噬菌体展示技术已被用作一种实用且易于操作的方法，用于分离对特定靶标蛋白质具有显著增强结合能力的蛋白质或多肽1,2,3,4，这些蛋白质或多肽随后可作为细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的探针。
泛素化是一系列酶促反应（E1 激活酶 → E2 结合酶 → E3 连接酶），通过该过程将泛素（Ub）共价连接到蛋白质底物上，从而靶向其降解或介导细胞信号转导的改变。此外，去泛素化酶可催化从蛋白质上切除泛素。因此，在细胞中存在数千种依赖泛素的蛋白质-蛋白质相互作用，其中绝大多数通过低亲和力但高特异性的共同表面识别，使得能够在大而多样的表面上形成较弱的相互作用。
Ernst 等人对泛素（Ub）中已知的结合区域引入突变，以探究是否能在保持高选择性的同时增强其对目标蛋白的结合亲和力5。研究人员构建了一个包含超过 100 亿（7.5 × 1010）种泛素变体（UbVs）的组合文库，这些变体在介导已知泛素-蛋白相互作用的泛素表面位点上存在突变。该文库由噬菌粒组成，可表达 M13 噬菌体 pIII 衣壳蛋白与多样化 UbVs 的融合蛋白。因此，在表达时，单个 UbVs 可通过衣壳蛋白展示在噬菌体表面。在筛选过程中，展示出与目标蛋白具有较强结合能力的 UbVs 的噬菌体会被保留并在后续的噬菌体展示轮次中富集，而展示出与目标蛋白结合能力较弱的 UbVs 的噬菌体则会被洗脱并从噬菌体库中去除。被保留的噬菌体颗粒含有与其展示的 UbV 对应的噬菌粒，从而可在分离后对其进行测序和进一步表征。
利用这种蛋白质工程策略，已针对人类去泛素化酶5和病毒蛋白酶6开发出UbV抑制剂。重要的是，我们通过劫持E2结合位点以及激活占据HECT结构域上泛素结合外位点的UbV，成功生成了针对人类HECT家族E3连接酶的抑制性UbV7。我们还可以通过靶向E2结合位点来抑制单体形式的RING家族E3，并通过诱导UbV二聚化来激活同源二聚体RING E3连接酶8。对于多亚基RING E3连接酶，UbV可通过靶向RING亚基（例如APC/C复合物9）或破坏复合物的形成（例如SCF E3连接酶10）实现抑制作用。综上所述，UbV可用于系统性地探究泛素-蛋白酶体系统（UPS）中的蛋白质-蛋白质相互作用，从而更深入地解析UPS酶的生化机制，并识别和验证可用于治疗干预的功能位点。
以下方案描述了如何利用先前构建的噬菌体展示UbV文库来靶向目标蛋白，以及如何通过多轮噬菌体展示技术富集与目标蛋白相互作用的UbV结合物。

<table><tbody><tr><td>Axygen Mini Tube System（0.65 mL，无菌，96/架，每包10架）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-198</td><td>噬菌体展示后培养噬菌体产物。</td></tr><tr><td>BD Difco 脱水培养基：LB Broth, Miller（Luria-Bertani）</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-17-3</td><td>制备滴定用平板。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），第五组分</td><td>BioShop Canada</td><td>ALB001</td><td>缓冲液组分。</td></tr><tr><td>羧苄青霉素二钠盐，89.0–100.5% 无水物</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1389-5G</td><td>培养噬粒感染的细胞。</td></tr><tr><td>Compact Digital 微孔板振荡仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-337</td><td>与噬菌体文库共孵育期间振荡微孔板。</td></tr><tr><td>Corning 微孔板铝封膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-684</td><td>密封噬菌体甘油保存液。</td></tr><tr><td>脱水琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-01-0</td><td>制备滴定用平板。</td></tr><tr><td>DS-11 分光光度计/荧光计</td><td>DeNovix</td><td>DS-11 FX+</td><td>蛋白质浓度测定。</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One CellStar 96孔未处理U型底微孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>7000133</td><td>储存噬菌体甘油保存液。</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>噬菌体洗脱。</td></tr><tr><td>Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R 化学感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>C854003</td><td>用于噬菌体感染的细菌菌株。</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ1792406</td><td>培养M13K07辅助噬菌体感染的细胞。</td></tr><tr><td>M13KO7 辅助噬菌体</td><td>New England Biolabs</td><td>&amp;nbsp;N0315S</td><td>介导噬粒的包装与分泌。</td></tr><tr><td>MaxQ 4000 台式轨道摇床</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-076</td><td>细菌培养。</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 96孔微孔板，平底</td><td>Life Technologies</td><td>44-2404-21</td><td>固定蛋白质。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）10X 溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>缓冲液组分/噬菌体重悬介质。</td></tr><tr><td>ELISA及孵育用聚酯薄膜</td><td>VWR</td><td>60941-120</td><td>孵育期间覆盖微孔板。</td></tr><tr><td>聚乙二醇8000（PEG）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td>噬菌体沉淀。</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S3014</td><td>噬菌体沉淀。</td></tr><tr><td>无菌塑料培养管：半透明聚丙烯</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td>培养噬菌体输入样本。</td></tr><tr><td>盐酸四环素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td>培养 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; OmniMax 细胞。</td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1525</td><td>中和洗脱后的噬菌体溶液。</td></tr><tr><td>胰蛋白胨粉末</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td>细胞生长培养基组分。</td></tr><tr><td>吐温20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td>缓冲液组分。</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>细胞生长培养基组分。</td></tr></tbody></table>

利用噬菌体展示技术开发针对e3泛素连接酶的泛素变体调节剂

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

泛素是一种小分子蛋白质，分子量为8.6 kDa，是泛素-蛋白酶体系统的核心组分。因此，它能够以高特异性但低亲和力的方式与多种多样的蛋白质结合。通过噬菌体展示技术，可以对泛素变体（UbVs）进行改造，使其相较于野生型泛素具有更高的亲和力，同时保持对靶标蛋白的结合特异性。噬菌体展示利用一种噬菌粒文库，将丝状M13噬菌体的pIII外壳蛋白（因其在噬菌体表面外显表达而被选用）与UbVs融合表达。通过对人源野生型泛素的特定残基进行温和随机化（即偏向于保留原始野生型序列）来生成UbVs，从而在避免蛋白质构象发生有害改变的同时，引入促进与靶标蛋白产生新相互作用所需的多样性。在噬菌体展示过程中，这些UbVs被表达并展示在噬菌体外壳蛋白上，并与目标蛋白进行筛选。其中，与目标蛋白具有有利结合相互作用的UbVs被保留下来，而结合能力差的变体则被洗脱并从文库中去除。被保留的UbVs（其与携带对应UbV噬菌粒的噬菌体颗粒相连）被洗脱、扩增并浓缩，以便在下一轮噬菌体展示中再次针对同一靶标蛋白进行筛选。通常进行最多五轮噬菌体展示，在此过程中施加强烈的选择压力，以淘汰结合微弱和/或非特异结合的UbVs，从而使高亲和力的UbVs得以富集。最终，可分离出相较于野生型泛素对靶标蛋白具有更高特异性或亲和力的UbVs，并可通过进一步实验对其进行表征。

通过噬菌体展示技术获得的结合物可通过多种方式进行验证和分析。建议首先对噬菌体进行测序，使用位于噬粒文库中多样化插入片段两侧的引物。理想的噬菌体展示实验将显示出对若干序列的明显富集趋势（图1）。其他序列也可能存在，但数量较少，主要表现为背景噪音。在所提供的示例中，当在泛素变体（UbVs）与野生型UBE4B之间进行噬菌体展示时，序列#1-4表现出明显的富集倾向。已提供一个用于整理和分析测序文件的Python脚本示例（“phageDisplaySeqAnalysis.py”）。为确认结合物的显著性，可采用酶联免疫吸附测定（ELISA）快速评估其对野生型靶蛋白、突变型靶蛋白以及非靶标蛋白的相对结合亲和力（图1）。通过将结合物的ELISA吸光度值相对于野生型蛋白（未显示）或其他与靶蛋白无明显结合的蛋白进行归一化处理，可确定新结合物与其所基于的野生型结合蛋白之间的结合亲和力差异（图1）。此示例展示了富集序列倾向于对靶蛋白具有更高结合亲和力的现象。已提供一个用于整理和分析E...

泛素化是一种关键的蛋白质翻译后修饰，其失调与多种人类疾病相关。本方案详细介绍了如何利用噬菌体展示技术分离新型泛素变体，这些变体能够结合并调控E3连接酶的活性，从而控制泛素化的特异性、效率和修饰模式。

利用噬菌体展示技术开发针对E3泛素连接酶的泛素变体调节剂

泛素是一种小型蛋白质，分子量为8.6 kDa，是泛素-蛋白酶体系统的核心组分。因此，它能够结合多种多样的蛋白质……

噬菌体展示技术不仅有助于我们研究临床重要酶类的结合特性，还能用于开发针对这些酶及其相关疾病的调节剂。噬菌体展示可用于开发针对多种靶蛋白的新型结合分子，且相较于其他传统展示方法更易于操作。该实验流程包含大量重复性操作，因此关键在于避免机械式操作，始终保持专注。首先，在30毫升的2YT四环素肉汤中接种200微升的种子培养物。在37摄氏度下以200 RPM的转速振荡培养约3小时，直至细菌进入对数生长中期。将平板中的包被溶液弃入水槽中。用纸巾轻轻吸干。然后向每个包被好的孔中加入 200 µL PB 缓冲液。弃去板中的 PB 缓冲液，并将板放在纸巾上吸干。向板中每个包被的孔再加入 200 微升 PB 缓冲液。在室温下以 300 RPM 轨道振荡孵育 1 小时。将噬菌体文库置于冰上解冻，然后用 PBS 稀释至文库多样性的 100 倍。加入聚乙二醇氯化钠溶液，其体积为稀释后文库体积的五分之一，将溶液置于冰上孵育30分钟。接着，在4°C条件下，以11,000 × g离心30分钟。弃去上清液，再离心2分钟，以彻底去除残留的上清液，并浓缩噬菌体沉淀。将噬菌体沉淀物轻轻重悬于每种待分析靶蛋白对应的1毫升PBT缓冲液中，通常共四种。向对照板的每个包被孔中加入100微升噬菌体文库。在室温下以300 RPM转速振荡孵育1小时。将靶板中的 PB 缓冲液弃入水槽，并用纸巾将板干燥。将对照板中噬菌体文库的全部 100 微升转移至靶板的每个包被孔中。在室温下以 300 RPM 轨道振荡孵育 1 小时。接下来，从平板上移除噬菌体文库，并用 PT 缓冲液洗涤包被的孔四次。将平板倒置并在纸巾上轻拍，以去除残留的缓冲液。向每个包被的孔中加入 100 微升 0.1 摩尔的盐酸，以洗脱噬菌体。将培养板在室温下孵育5分钟，同时以300 RPM转速进行轨道振荡。随后，通过向每个包被孔中加入12.5微升pH为11的1摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris hydrochloride）来中和pH值。将来自全部八个孔的洗脱噬菌体转移至一个1.5毫升微量离心管中。转移过程中上下吹打以使溶液均匀，并吸净各孔中的全部液体。向洗脱的噬菌体中加入10% BSA，使其终浓度为1%。将微量离心管置于4摄氏度保存。此为第一轮输出。通过从琼脂平板上挑取单个大肠杆菌菌落接种至5毫升含四环素的2YT种子培养基中，制备用于下一轮筛选噬菌体输入的种子培养物。在37摄氏度、200转/分钟振荡条件下过夜培养。在第二轮和第三轮的试管中，用适量的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释目标蛋白。取第二轮和第三轮试管内容物的一半，为每个靶蛋白在96孔结合板中包被四个孔，用于下一轮实验。接着，取第一轮产物的一半接种于3毫升对数中期细胞中。在37°C下以200 RPM转速振荡培养30分钟。加入M13KO7辅助噬菌体，使其终浓度为每毫升10亿PFU。在37摄氏度下以200 RPM的转速振荡培养1小时。1小时后，将全部3毫升培养物转移至30毫升2YT羧苄青霉素-卡那霉素溶液中。在37摄氏度、200 RPM转速下振荡培养过夜。此处展示的是针对UBE4B的泛素变异体筛选的代表性结果。UBV按频率从高到低排序。序列代表UBV中泛素区域的多样化部分，包含所有随机化的残基。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量结合物对野生型靶蛋白、突变型靶蛋白以及非靶向蛋白的相对结合亲和力。所有ELISA吸光度值均相对于96个平均BSA ELISA值和96个平均GST ELISA值进行归一化处理。颜色较深的绿色表示相对结合能力更强。由于目标蛋白带有 GST 标签，因此将 GST 作为非特异性结合的对照。ELISA 结果在此以图形形式展示。横轴表示UBVs，纵轴表示相应的归一化吸光度。在进行此操作时，重要的是在加入盐酸后不要丢弃微孔板中的溶液。此时噬菌体已悬浮在溶液中，需保留这些噬菌体，以便进行后续富集、最终分析或两者同时进行。完成此操作后，应进行测序以确定UBV的频率。可进行ELISA和IC50实验，分别测定UBV的结合效力和抑制效力，并协助确定需进一步表征的UBV。

using-phage-display-to-develop-ubiquitin-variant-modulators-for-e3

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用噬菌体显示开发用于E3连接酶的泛素变体调节剂

在本视频中，我们演示了噬菌体展示技术，用于分离表达对目标蛋白具有高亲和力蛋白的预先改造噬菌体。...

利用噬菌体展示技术筛选高亲和力靶蛋白的蛋白质

噬菌体展示是一种强大的技术，可用于捕获与固定化目标分子相互作用的蛋白质或蛋白质片段。在确定了要构建和筛选的噬菌体cDNA文库类型后，本文所述方案可实现高效的亲和筛选，从而鉴定出相互作用分子。...

使用重组蛋白诱饵进行噬菌体展示与亲和筛选的实验方案

本文介绍一种筛选大肠杆菌（E.

细菌肽展示技术用于筛选新型生物素化酶

本方案旨在建立泛素（Ub）和泛素样蛋白（Ubls）的特异性蛋白质组，以鉴定与特定条件（如处理方式或表型）相关的这类翻译后修饰（PTMs）的变化。...

泛素及泛素样蛋白依赖性翻译后修饰的分析及显著变化的鉴定

本文旨在为RING型E3泛素连接酶的全面生化与功能研究提供一个框架。这一多步骤流程包含详细的实验方案，可用于验证待测蛋白的酶活性，并阐明如何将酶活性与生物学功能相联系。...

体外及植物体内RING型E3泛素连接酶的功能表征

本研究提供了详细的 体外 泛素化检测方案用于分析E3泛素连接酶催化活性。重组蛋白使用原核表达系统（如）进行表达 大肠杆菌...

体外分析E3泛素连接酶功能

我们提供了一种在哺乳动物细胞中针对特定底物和E3泛素连接酶的泛素化检测的详细实验方案。采用HEK293T细胞系进行蛋白过表达，通过免疫沉淀法从细胞裂解液中纯化多泛素化修饰的底物蛋白，并利用SDS-PAGE进行分离。通过免疫印迹技术检测该翻译后修饰。...

哺乳动物细胞裂解物中E3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估

开发了一种简单且可扩展的方法，用于评估Ube3a基因中错义变异的功能意义，该基因的功能缺失和获得与安格曼综合征及自闭症谱系障碍均有关联。...

一种可扩展的基于细胞的功能性评估 Ube3a 变异体的方法

本实验采用分子对接结合探针技术的方法，预测并验证中药小分子与蛋白质靶标之间的相互作用。...

基于分子对接与去泛素化酶探针技术筛选抑制UCHL3活性的中药化合物

泛素化是细胞内蛋白质功能的关键调控机制。本文介绍了两种用于检测哺乳动物细胞中底物蛋白泛素化水平的细胞裂解方法，并比较了它们在分析泛素化水平方面的有效性。通过瞬时转染在HEK293T细胞中诱导蛋白过表达，并通过蛋白质印迹分析检测泛素化蛋白。...

以SMAD2/SMURF2为模型在哺乳动物细胞裂解液中检测泛素化的比较策略

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体外 重建细菌泛素化及VCP/p97介导的清除过程

了解如何使用噬菌体显示技术分离新型泛素变体以调节E3连接酶活性。该方法有助于研究蛋白质降解调控机制并探索疾病治疗潜力。

利用噬菌体展示技术开发针对E3泛素连接酶的泛素变体调节剂

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