开发移动式线粒体生理学实验室，用于在野外测量线粒体能量学

移动线粒体实验室的发展使生理学家能够将他们的工作带入该领域，因此，他们可以评估动物所表现出的令人着迷的能量挑战的多样性。圈养对许多动物来说都是有压力的，所以有了移动实验室，我们现在可以将实验室带到动物身上，而不是把动物带回实验室。由于能够在该领域分离和测量线粒体呼吸，主要用于生物医学的技术现在可以用于生态和进化背景。

首先将移动实验室停放在平坦的地面上，然后打开发电机，将车辆调平。在设置设备之前，请延长滑块。按照制造商的说明，继续设置线粒体呼吸室并将其校准到所需的实验温度和当前气压。

使用切开的5毫升移液器吸头将切碎的组织转移到50毫升离心管中，并用刀片以50%功率匀浆组织5秒钟。为了消化组织，每克湿肌肉添加5毫克蛋白酶7分钟，每30秒混合一次溶液。通过加入等体积的含有BSA的分离缓冲液终止反应。

接下来，将匀浆以 500 G 离心 10 分钟，然后使用切开的 5 毫升移液器吸头将上清液通过双层粗棉布转移到干净的 50 毫升离心管中，然后将过滤的上清液以 3， 500 G 离心 10 分钟以沉淀棕色线粒体沉淀。弃去上清液后，向离心管中加入相同体积的含有BSA的分离缓冲液，并通过轻轻地将线粒体沉淀从离心管壁上移开，用柔性刮刀重悬线粒体沉淀，然后以3,500G离心管10分钟。将沉淀重悬于不含BSA的分离缓冲液中，以重复如前所述的离心步骤。

第二次离心后，用干净，灵活的刮刀将线粒体沉淀重悬于重悬缓冲液中，并将重悬的线粒体转移到带有切开的一毫升移液器吸头的Dounce匀浆器中。使用均质器，小心地匀浆线粒体悬浮液四到五次。使用新鲜切割的一毫升移液器吸头将均质化的线粒体悬浮液转移到标记的两毫升微量离心管中。

对于复杂物的线粒体呼吸测量，将945微升的呼吸缓冲液加入线粒体呼吸室。确保当缓冲温度保持在 37 摄氏度时搅拌器旋转。用顶部密封腔室，然后开始记录数据收集。

氧气浓度稳定后，向腔室中加入20微升线粒体悬浮液，并盖上盖子。在软件中，表示线粒体已添加到腔室中。用单独的注射器向腔室中加入1摩尔谷氨酸，200毫摩尔苹果酸盐和200毫摩尔丙酮酸各10微升，并等待信号稳定后再在软件中指示添加的底物。

使用单独的注射器向腔室中加入 5 微升二磷酸腺苷 （ADP）。表示软件中添加的ADP，观察状态三的快速耗氧量。状态三呼吸和线粒体耗氧量减慢四分钟后指示状态四呼吸，终止记录并保存数据文件。

对于复杂的两种底物，通过向腔室中加入963微升呼吸缓冲液来重复该过程。加入20微升线粒体悬浮液后，使用单独的注射器依次向腔室中加入2微升每微升4微克鱼藤酮和10微升500毫摩尔琥珀酸酯。当信号稳定时，表示软件中添加的基板。

加入5微升ADP后，观察状态三的快速耗氧量，并在软件中指示添加ADP。状态三呼吸和线粒体耗氧量减慢四分钟后指示状态四呼吸，终止记录并保存数据文件。代表性结果显示了原始线粒体呼吸数据。

复合物中第三步的陡峭斜率代表高最大呼吸速率。线粒体与后肢骨骼肌的成功分离是通过急剧转弯和状态四的新斜率的稳定观察到的。对于复杂的双驱动线粒体呼吸，可以观察到类似的模式。

线粒体功能不良导致线粒体偶联，形成复杂的线粒体驱动的线粒体呼吸。然而，线粒体功能不良的另一个典型例子是，加入ADP后，线粒体呼吸的不偶联复合物与一条平线，并且没有轮流产生状态四数据。根据呼吸测量数据确定复合物 1 和复合物 2 的状态 3、状态 4 和呼吸控制比 （RCR） 的数值 在收集过程中，可以快速冷冻其他组织，以便将来使用它们来测量线粒体密度或氧化损伤。

此外，手术后，还可以冷冻分离的线粒体以测量电子传递和链复合物的活性。在野外分离和测量线粒体呼吸的能力将为提高我们对线粒体在复杂生命进化中的作用的理解铺平道路。