基于人原代皮肤成纤维细胞的亨廷顿病模型中微管正端动态可视化

亨廷顿病（Huntington's disease, HD）是一种由编码亨廷顿蛋白（huntingtin）的基因发生突变所导致的不可治愈的神经退行性疾病。亨廷顿蛋白主要与囊泡和微管相关，可能参与微管依赖性运输过程。为了研究突变型亨廷顿蛋白对微管动态性的影响，我们采用活体成像技术观察EB3蛋白，该蛋白通过弯曲并稳定生长中的微管正端来调控微管的动态特性。

为了将荧光标记的EB3导入人皮肤成纤维细胞，我们采用了质粒转染方法。本研究中所用的原代成纤维细胞培养物来源于EB3患者皮肤活检样本。将活检样本在数小时内运送至实验室，置于添加了15 µg/mL青霉素和50 U/mL链霉素的DMEM培养基中。

将活检组织置于一个6厘米的培养皿中，加入少量培养基。使用无菌手术刀将活检样本切成约0.5至1毫米大小的组织块。取一到两个获得的组织碎片放入3.5厘米的培养皿中，并在组织块上覆盖一片无菌盖玻片。

缓慢加入 1.5 毫升培养基。将成纤维细胞在含 5% CO2、温度为 37 摄氏度、湿度为 80% 的 CO2 培养箱中，于培养基中进行培养。培养 4 至 7 天后，首先角质形成细胞，随后成纤维细胞开始从组织迁移至培养皿底部。

细胞培养。为了观察转染效果，应使用玻璃共聚焦培养皿。用蒸馏水配制的经高压灭菌的0.1%明胶溶液覆盖培养皿底部。

孵育15分钟。准备培养基。充分混匀，4 °C避光保存。

在加入细胞前，将培养基预热至37摄氏度。在显微镜下观察培养情况。移除培养基，并用无菌DPBS洗涤细胞。

向细胞中加入一毫升预热的 0.25% 胰蛋白酶溶液。在显微镜下观察细胞是否完全从基质上脱离。用一毫升培养基终止胰蛋白酶的消化作用。

将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。在200 G条件下离心5分钟。弃去上清液，用1毫升培养基重悬细胞沉淀。

计数细胞数量。计算所需的细胞数目。以每平方厘米8至15乘以10的3次方的密度进行去籽处理。

将此液转移至数毫升培养基中。移除用于接种的培养皿中的明胶溶液，并立即加入2毫升细胞悬液。在CO2培养箱中，于37°C条件下培养成纤维细胞。

每两到四天更换一次培养基。实验时使用第4至11代的细胞。转染时细胞融合度不应超过70%至80%。转染前24小时将培养基更换为新鲜培养基。

根据细胞接种面积和密度配制DNA-脂质复合物。使用脂质体转染试剂，以及每平方厘米接种密度为10的4次方个细胞的细胞密度。将3微升商用试剂加入125微升不含抗生素的Opti-MEM培养基中。

避免接触管壁，轻轻重悬。用125微升OptiMEM稀释质粒DNA GFP-EB3，加入一微克质粒DNA。轻轻重悬。

按1:1比例将稀释的质粒DNA加入每管稀释的转染试剂中。孵育30分钟。将DNA-脂质复合物加入含有细胞的6厘米培养皿中。

以十字形摇动混合30秒。用转染试剂孵育细胞24小时，然后更换为新鲜培养基。在24小时和48小时后观察，分析转染效率。

准备成像。在对细胞进行活体成像前，将培养基更换为不含pH指示染料的培养基，以减少自发荧光。小心地在培养基的细胞层上覆盖一层矿物油，完全覆盖液体表面，将其与外界环境隔离，以减少氧气渗透和培养基蒸发。

使用宏灯，并利用高数值孔径的60倍和100倍物镜以60倍和100倍放大倍数进行成像。对于活体观察，显微镜必须配备孵育装置，以维持细胞所需的培养条件，包括加热光学平台和物镜至37摄氏度、提供CO2的密闭腔室以及湿度支持。成像前，将含有细胞的共聚焦培养皿置于显微镜的载物台支架上。

确保培养皿和相机牢固地固定在支架上，以避免在拍摄图像时发生漂移。设置成像参数：选择较低的曝光值，因为光照会损伤细胞，并与氧气环境发生反应。

为了研究人皮肤成纤维细胞中微管的动态变化，我们选择了300毫秒的曝光时间。应聚焦于目标观察对象。对于长时间的时间序列成像，必须使用自动对焦稳定系统（如完美对焦系统），因为沿设定轴方向可能会发生位移，导致目标观察对象失焦。

根据细胞的光敏感性以及荧光染料的褪色速率，选择最佳成像条件。由于微管是高度动态的结构，因此应选择相对较短的时间间隔，并且帧率必须足够高。为研究皮肤成纤维细胞中的微管动态，我们采用每秒一帧的频率，持续三到五分钟。

在选择下一个成像目标时，应远离已成像区域，因为光照会导致可随时间推移而加剧的光漂白现象。由于我们采用了相对较高的成像频率，相机快门在连续图像之间未关闭，光源在整个成像期间持续照射，从而加剧了荧光衰减。在视觉分析微管动态时，应根据转染质量、微管图像质量、最佳信噪比以及待分析细胞无漂移等情况，选择最合适的视频片段。

使用所选视频，在 Fiji 程序中通过追踪微管正端动态进行研究。本实验方案中最关键的步骤是转染，以确保蛋白表达充足。成像过程中需保证良好的信噪比、避免微管发生光漂白，以及无细胞漂移现象。

在活体中可视化微管动态可为突变型亨廷顿蛋白的特性提供重要信息。我们的方案也可应用于其他疾病的研究，这些疾病的病理机制涉及细胞骨架的动态特性。