从新生小鼠中磁分离小胶质细胞用于原代细胞培养

本方案使我们能够在接近体内特性的条件下培养小胶质细胞。利用磁性细胞分选技术，本方案可在无血清培养基条件下，仅在体外培养两天即对小胶质细胞进行刺激。首先，使用小剪刀沿矢状缝从颈部至鼻部剪开皮肤，长度约为15至20毫米。

将尖端插入，使枕骨大孔与颅骨平行。从两侧向眼睛处剪开。用小剪刀在两眼之间剪开，以分离颅骨和脑组织与头部。

用两把镊子夹住靠近嗅球的颅骨，小心撕开颅骨。用刀片切除小脑和嗅球，并将脑组织切成两半。将脑组织放入含有 40 毫升不含钙和镁的 HBSS 的培养皿中。

根据此表格配制解离混合液。将12个脑组织样本转移至C管中，每管解离组织总重量为1.2克。随后将C管置于带有加热功能的组织解离仪上进行解离。

在解离仪中启动优化的NTDK程序。离心20秒。通过移液吹打三次完成机械解离。

将细胞转移至四个带有滤网的15毫升离心管中。用10毫升含钙和镁的HBSS冲洗滤网。以10,000 × g离心10分钟，然后用10毫升移液器吸除上清液。

小心加入 10 毫升含钙和镁的 HBSS，重悬沉淀。再次离心并移除上清液。用 6 毫升分选缓冲液重悬沉淀。

重复离心并弃去上清液。然后加入200微升CD11b磁珠溶液，在4摄氏度下孵育15至20分钟。孵育结束后，用6毫升分选缓冲液重悬沉淀。

重复离心操作，并用八毫升分选缓冲液重悬沉淀。接下来，按照分离仪上的Possel程序准备八根柱子。每次加入一毫升细胞悬液，使细胞通过柱子。

用1毫升分选缓冲液，将CD11b阳性细胞洗脱至无菌洗脱板中。将细胞收集至50毫升离心管中。离心后，用10毫升冷的小胶质细胞培养基重悬沉淀。

计数 CD11b 阳性细胞。用预冷的小胶质细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度至每毫升 650,000 至 700,000 个细胞。将细胞悬液分装至细胞培养板中。

将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。次日，更换为预热的小胶质细胞培养基，并再次进行过夜孵育。在此步骤前对细胞进行刺激，并在刺激的最后三小时内进行吞噬功能检测。

根据下表，按每细胞50个珠子的比例计算珠子数量。制备珠子混合液。将试管置于37摄氏度水浴中孵育1小时。

每10分钟涡旋一次。向每个孔中加入计算体积的磁珠溶液，孵育3小时。采用该方法，在给予白细胞介素-1β联合干扰素-γ或脂多糖等促炎因子刺激后，评估小胶质细胞的吞噬活性。

刺激6至24小时后，通过共聚焦显微镜分析荧光Cy3小胶质细胞珠。刺激6小时后，仅在白细胞介素-1β联合干扰素γ条件下，小胶质细胞开始吞噬Cy3珠。刺激24小时后，两种刺激条件下Cy3荧光均增强，表明吞噬活性增加。

通过流式细胞术提高了小胶质细胞培养的纯度，流式分选后细胞活力显著增强。采用流式细胞术和实时定量PCR（RT-qPCR）分析了出生后第8天小鼠脑组织中CD11b阳性细胞分选前后不同细胞群体的标志物。这些分析可区分多种脑细胞群体，例如小胶质细胞标志物CX3CR135、少突胶质细胞标志物O4或OLIG2、神经元标志物NeuN或突触素（synaptophysin）、星形胶质细胞标志物ACSA-2或GFAP。

使用CD11b抗体进行细胞分选后，仅获得小胶质细胞。将悬液加入层析柱时必须极其轻柔地进行移液操作，以防止堵塞并避免机械性细胞死亡。采用该方法后，可进行转录组学、蛋白质组学分析（如Western blot或Luminex检测），甚至免疫组化，以观察小胶质细胞刺激后的效应。