Name: 左旋多巴诱导的帕金森病大鼠模型中运动障碍的诱导与评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 了解如何在帕金森病大鼠模型中诱导并评估左旋多巴诱发的运动障碍。该方法可量化异常不自主运动的强度和频率，为开发减少此类副作用的治疗方案提供可靠工具。

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我们谨向所有帕金森病患者所经历的艰难困苦，以及他们每天展现出的坚强与韧性致以敬意，尤其要献给KSC深爱的父亲Mark Steece。本研究工作得到了美国国家神经疾病与卒中研究所（NS090107，NS110398）以及帕金森病基金会国际研究资助项目（现为帕金森基金会）的支持。&#160;我们还要感谢Molly VanderWerp在编辑工作上的出色协助。

本文所涉及的动物均按照机构规定进行饲养和处理。所有动物实验程序均经密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，符合联邦和州的相关法规要求。
1. 6-OHDA 损伤状态的无药物确认
<ol>
	<li>姿势性尾部悬挂测试11,12,13 
	注意：在实验动物（例如雄性或雌性成年Sprague Dawley或Fisher 344大鼠）中，于6-OHDA损毁诱导后至少1周进行损伤状态评估（有关损毁的详细信息参见9,10,35）。
	<ol>
		<li>将大鼠尾根部牢固握住，使其悬空于笼子上方约6 cm处，持续约5秒。</li>
		<li>记录身体扭曲的方向：成功损毁的动物向损毁侧对侧扭转记为+，无扭转或双向扭转记为-。</li>
		<li>注意：这些测试为可选项目，但推荐使用。有关其他无需药物的测试方法或变体，参见14,15,16,17。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>步态调节拖拽测试（改编自16） 
	注意：在实验动物（例如雄性或雌性成年Sprague Dawley或Fisher 344大鼠）中，于单侧6-OHDA损毁诱导后至少1周进行损伤状态评估。
	<ol>
		<li>握住大鼠尾根部，使其后肢离地约6 cm，在平坦、光滑但不打滑的表面上向后拖行约75 cm，耗时5–10秒。</li>
		<li>观察并记录每只前爪在三次重复测试中的踏步/步态调节动作次数。</li>
		<li>当观察到损毁侧对侧前爪踏步次数为0–2次，同时损毁侧同侧前爪出现快速踏步（约10次）时，判定为单侧损毁成功，记为+（例如，左侧损毁的动物表现为对侧右前爪踏步缺陷（0–2次））。</li>
		<li>相反，若双侧前爪均出现中等至快速踏步（5–10次），则记为-，提示损毁不完全或损毁状态未知。 
		注意：即使大鼠已成功损毁，焦虑状态也可能导致快速踏步/步态调节。若怀疑存在此情况，应将大鼠放回其饲养笼中，30分钟或更长时间后重新测试。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 试剂与耗材的准备
<ol>
	<li>确定适用于研究问题的左旋-3,4-二羟基苯丙氨酸甲酯盐酸盐（左旋多巴或 L-DOPA）和盐酸苯丝肼（一种外周脱羧酶抑制剂）（参见材料表）的剂量、评分频率和实验时间线12,18,19,20（图1）。 
	注意：可提出多种研究问题，例如特定疗法是否可能减轻已存在的左旋多巴诱导的运动障碍（LID），或预防 LID 的发生；也可探讨治疗效果是否依赖于左旋多巴的剂量，或 LID 的表现和/或治疗效果是否因受试对象的性别、物种和年龄而异。</li>
</ol>
<img alt="LID 预防时间线示意图、LID 评分的给药时间表、实验治疗设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62970/62970fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：治疗时间线示例。 一个总时长为 12 周的左旋多巴（L-DOPA）剂量递增时间线示例，其中在 6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁术后 3 周开始左旋多巴注射，持续 8 周，实验性治疗则在其后持续 4 周。在此示例中，左旋多巴每周皮下注射 5 次（周一至周五），每日注射时间大致相同，每个规定剂量（3、6、9 和 12 mg/kg）维持 2 周。在每个左旋多巴剂量水平的第 1、6 和 10 天进行行为学 LID 评分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62970/62970fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>每周称量大鼠体重，根据研究期间持续的体重变化计算相应的药物剂量。 
	注意：由于LID+大鼠活动增加，长期使用左旋多巴（L-DOPA）治疗可能导致体重下降。若出现体重减轻，可在左旋多巴注射后给予营养全面且适口性好的零食（参见材料表）。</li>
	<li>计算每周所需左旋多巴（L-DOPA）和苄丝肼（benserazide）的用量，按每日注射量分别称取冻干粉剂，并将多日剂量合并后置于玻璃棕色小瓶中，在-20 °C保存1–2周，直至给药当日使用。 
	注意：目标剂量为12 mg/kg，即每1000 g体重给予12 mg左旋多巴。在补充文件1中提供了示例，说明如何根据12 mg左旋多巴/kg体重、注射体积为1 cc/kg体重的条件，计算每周每日所需的左旋多巴和生理盐水用量。</li>
</ol>
3. 房间与笼具设置
<ol>
	<li>在6-OHDA损毁手术后3-4周开始L-DOPA治疗的第一天，将大鼠转移至单笼饲养，并提供符合IACUC批准的环境丰富化物品。</li>
	<li>在整个研究期间维持单笼饲养，以避免同伴对行为学评估造成干扰。</li>
	<li>在LID评分日，将大鼠的笼盒放置于金属丝网架上，并倾斜约45°角，以便最佳观察大鼠行为（图2A）。将笼盒上的标识标签翻转至向上位置（图2B），并移除饮水瓶、食槽以及笼内所有类型的丰富化物品（图2C），以避免干扰行为学评估。</li>
</ol>
<img alt="实验室中鼠类饲养设置；动物实验笼具环境的剖面图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62970/62970fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：大规模大鼠实验中用于 LID 评分的笼具设置示例。（A）可使用大型金属架设置多个笼具，以便于对每只动物进行最佳观察。笼具应以 45° 角分开摆放，ID 卡朝上翻转（B），并移除食物、水瓶、筑巢材料及其他环境丰富物，以减少对大鼠的视觉遮挡以及在评估异动行为时的干扰（C）。金属架需距离墙壁数英尺，以便评分人员可根据需要从笼具前方或后方观察大鼠。必须使用个体动物编号标记环境丰富装置（例如，C-红色大鼠藏身处），以便将其放回原来的笼具中。当使用不同性别的动物时，这一点尤为重要，可避免增加实验动物的应激反应。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62970/62970fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 左旋多巴注射与运动障碍评分
<ol>
	<li>L-DOPA的皮下注射21,22
	<ol>
		<li>在每日注射L-DOPA前，立即向已预先称重并装于棕色瓶中的冻干L-DOPA与苄丝肼混合物中加入适量无菌生理盐水，并充分振荡10秒（见步骤2.3）。 
		注：目标注射剂量为每1000克体重1 mL（每毫升含12 mg L-DOPA）。所需生理盐水体积取决于每项研究中动物的数量。</li>
		<li>使用一次性注射器（例如1.0或0.5 mL，配26 G针头）抽取每只动物所需的药液体积（按1 mL/kg大鼠体重计算），并为每支注射器标注对应动物的编号。 
		注：注射器填充后应置于无菌袋中避光保存，直至注射时使用。L-DOPA在水溶液环境中遇氧气和光照会迅速氧化23,24,25,26。</li>
		<li>将第一笼大鼠移至注射操作台旁。</li>
		<li>从笼中取出大鼠，将其放置于注射操作表面。</li>
		<li>用非优势手手掌轻轻固定大鼠头部和肩部，使其紧贴操作表面。</li>
		<li>用非优势手的拇指和食指轻轻提起大鼠肩胛区域背部皮肤，形成皮下注射空间；用优势手持注射器，将L-DOPA溶液注入拇指与食指之间的皮下间隙，进针方向尽可能与大鼠身体平行，以避免刺入肌肉。 
		​注：注射前大鼠无需麻醉。</li>
		<li>每支使用过的注射器应立即丢弃至锐器盒中。</li>
		<li>将大鼠放回其个体笼中，并提供营养全面的零食，但在LID评分日除外，以免干扰行为学评估，直至评分完成后再给予。</li>
		<li>根据评分时间需求及评分日大鼠数量，设定1–2分钟的计时器。当计时器提示时，取下一笼大鼠并进行注射。</li>
		<li>重复上述操作，每隔1–2分钟注射一只大鼠，直至所有大鼠完成注射。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>左旋多巴诱导的运动障碍（LID）注射后评分
	<ol>
		<li>在预定的时间点（应包括LID行为的初始出现、行为高峰及行为衰退阶段）对肌张力障碍性和多动性运动障碍的强度（表1）和频率（表2）进行评分（参见补充文件2中的LID评分记录表示例）。</li>
		<li>对于成年雄性或雌性Sprague Dawley或Fisher 344大鼠，当样本量为N = 40只时，建议在首次L-DOPA注射后20分钟开始运动障碍评分，之后每隔50分钟评分一次，持续至注射后220或270分钟，具体结束时间取决于90%–100%大鼠的LID行为是否已完全消失。</li>
		<li>若采用1分钟评分间隔，设置1分钟计时器。对第一只大鼠观察并评分1分钟，随后转移至下一只大鼠，同样评分1分钟，依次完成所有大鼠的1分钟间隔评分。</li>
		<li>将计时器置于靠近笼具的显眼位置，以便在评分期间可同时观察LID行为的强度（表1），并估算特定行为发生的频率（表2）。</li>
		<li>完成第一个时间点的评分后，从第一只大鼠开始下一时间点的评分（例如注射后70分钟），并按预定间隔（例如每50分钟）持续进行，直至所有时间点的评分完成。 
		注：由于L-DOPA注射与LID评分任务存在时间重叠，评分日需两人协作，一人负责注射，另一人负责行为学评分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文介绍了在单侧6-OHDA损毁黑质纹状体多巴胺（DA）系统后，于帕金森病大鼠模型中可重复地诱导和评估左旋多巴诱导的异动症（LID）的详细方法。尽管过去曾认为啮齿类动物不会出现LID，而旋转行为不对称可能是大鼠中LID的对应表现31，但在过去二十年中，大鼠和小鼠模型已被充分表征，并已成为LID研究广泛接受的工具15,32,33,34。本文所述方案特别适用于较大规模的实验设计18,19。该方案详细说明了如何评估多种类型异动行为（包括肌张力障碍性和运动过多性）的强度与频率。值得注意的是，附带详细注释和评分说明的图像与视频资料将有助于实验人员在给予L-DOPA后对肌张力障碍性和运动过多性LID行为进行判断。尽管并未提供所有可能...

尽管左旋多巴（L-DOPA）作为帕金森病（PD）患者的治疗药物已有50多年的历史1,2，但它仍然是缓解帕金森病运动症状最有效的疗法。PD相关的临床运动症状源于黑质（SN）致密部多巴胺（DA）神经元的丧失，导致纹状体中可利用的多巴胺水平显著下降。L-DOPA能有效恢复纹状体中的DA水平，从而在疾病早期带来运动功能的改善3,4。然而，长期治疗后，大多数PD患者会出现&#160;左旋多巴诱导的异动症（LID），包括舞蹈样动作、肌张力障碍和手足徐动症，这些症状常常显著影响日常活动能力5,6,7。
尽管已存在多种用于模拟啮齿类动物左旋多巴诱导性运动障碍（LID）的行为学模型，但建模方法和LID行为评估方式的差异，使得不同实验室之间研究结果的可重复性以及这些实验工具在帕金森病（PD）临床前研究中的可靠性受到质疑。本实验方案由一位临床运动障碍疾病专家合作开发8，提供了一种简单直接的LID诱导与评分方法，适用于采用6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导单侧黑质损伤的帕金森病大鼠模型9,10。本文提供的LID评分量表涵盖了对不同身体部位异常运动行为强度和频率的评分。同时，还提供了有关实验流程优化、帕金森病模型动物及运动障碍动物的适当护理与操作的关键信息。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;100分钟数字计时器</td><td>订书钉</td><td>1111764</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Compass CX 紧凑型天平</td><td>Ohaus</td><td>30428202</td><td></td></tr><tr><td>5-(2-氨基乙基)-1,2,4-苯三酚单氢溴化物</td><td>Cayman Chemicals</td><td>25330</td><td>6-OHDA 是一种儿茶酚胺能神经毒素，可用于在啮齿类动物中诱导多巴胺能损伤及帕金森样症状。</td></tr><tr><td>Allentown 笼具</td><td>Allentown, LLC</td><td>Rat900</td><td>Allentown 笼具可从各个侧面观察大鼠。</td></tr><tr><td>BD 过敏原测试托盘，配备永久固定针头</td><td>BD</td><td>BD 305540</td><td>用于皮下注射 L-DOPA</td></tr><tr><td>盐酸苯丝肼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7283</td><td>苯丝肼是一种外周脱羧酶抑制剂，与左旋多巴（L-DOPA）联用，用于在帕金森病（PD）的啮齿类动物模型中诱导运动障碍。</td></tr><tr><td>玻璃琥珀色闪烁小瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>B7921</td><td>用于在 -20 ℃ 下储存左旋多巴/苄丝肼 &amp;deg;C，直至与无菌生理盐水混合。</td></tr><tr><td>L-3,4-二羟基苯丙氨酸甲酯盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1507</td><td>L-3,4-二羟基苯丙氨酸甲酯是多巴胺的前体&amp;nbsp;L-DOPA可穿过血脑屏障，用于治疗啮齿类动物的帕金森症状。</td></tr><tr><td>Paper Mate Sharpwriter 按动铅笔</td><td>订书钉</td><td>107250</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物营养全面的强化零食</td><td>Bio-Serv</td><td>F05478</td><td></td></tr><tr><td>2.5升圆形带盖冰桶</td><td>康宁</td><td>432129</td><td></td></tr><tr><td>标准塑料文件夹</td><td>订书钉</td><td>1227770</td><td></td></tr><tr><td>钢制线缆 6 英尺长可移动货架单元</td><td>Uline</td><td>H9488</td><td>宽度/高度可根据每次实验所需大鼠数量进行调整</td></tr><tr><td>0.9% 无菌生理盐水</td><td>Covidien/Argyle</td><td>1020</td><td>用于皮下注射前与左旋多巴/苄丝肼混合。</td></tr></tbody></table>

帕金森病大鼠模型中左旋多巴诱导异动症的诱导与评估

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson's Disease

左旋多巴（L-DOPA）仍是治疗帕金森病（PD）运动症状的金标准疗法。然而，随着这种多巴胺前体的长期使用，会出现被称为左旋多巴诱导的异动症（LIDs）的不自主运动副作用。&#160;据估计，在接受治疗10至15年后，约90%的帕金森病患者会出现LIDs。要理解这一病症的机制，并开发出新型且有效的抗异动症治疗方法，就需要建立稳定且准确的临床前模型，用于治疗干预措施的测试。本文介绍了一种在6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的帕金森病大鼠模型中，可靠诱导并全面评估LIDs的详细方法。在大鼠中进行可靠的LIDs评估，为各实验室提供了一种强有力的工具，可用于测试旨在减轻或消除帕金森病患者这一常见治疗相关负担的新兴疗法。

帕金森病大鼠的左旋多巴诱导运动障碍（LIDs）可表现为一系列异常的不自主运动（AIMs），包括肌张力障碍、多动性运动和刻板样行为。本文提供了针对这些行为的LID评分标准，涵盖强度（表1）和频率（表2）两个方面。该评分体系可为每只大鼠提供一个综合的LID严重程度评分，反映在每次评分时间点上这些行为发生时的质量（强度）和持续时间的多少（频率）。最终的LID严重程度评分通过将每种行为成分的强度评分与频率评分相乘得出。本文以文字描述形式提供了LID行为各项特征的评分标准（表1–2），并以静态图像配详细说明（图3）以及视频资料（动画视频1–4）展示具体示例。各运动类型的详细描述及评分说明见图注。
通过为期12周的L-DOPA剂量递增方案，可在6-OHDA损毁后进行8周的L-DOPA注射，从而全面评估任何治疗手段对LID行为随时间改善的影响（图1</stron...

本文介绍了一种在帕金森病大鼠模型中诱导和评估左旋多巴诱导的运动障碍的方法。该方案提供了关于多种运动障碍行为（包括肌张力障碍和多动性运动障碍）的强度和频率的详细信息，为针对这一尚未满足的医疗需求的治疗手段提供了可靠的测试工具。

左旋多巴（L-DOPA）仍是治疗帕金森病（PD）运动症状的金标准疗法。然而，长期使用常导致不自主的异常运动……

本方案提供了一种在帕金森病大鼠模型中可靠诱导并全面评估左旋多巴诱导性异动症的详细方法。本异动症评分量表的主要优势在于，它能够对特定异常不自主运动的强度以及动物表现出该行为所持续的时间进行量化。稳定可靠的左旋多巴诱导性异动症动物模型，对于实现最终目标——即找到有效治疗手段以减轻或消除帕金森病患者此类副作用——至关重要。通过每周称量大鼠体重，根据体重变化计算合适的药物剂量，开始实验前的准备工作。为大鼠提供营养全面且适口性良好的零食。在左旋多巴（L-DOPA）治疗的第一天，将大鼠转移至单笼饲养环境，并提供经机构动物护理与使用委员会批准的环境丰富化物品。在整个研究期间将大鼠单独饲养，以避免同伴干扰行为学评估。在进行运动障碍评分的当天，移除笼中的水瓶、食槽和 enrichment 物品，以避免干扰行为学评估，并将笼子放置在倾斜约 45 度的钢丝架上，然后将标识标签翻转至向上位置。在注射 L-DOPA 前，向已预先称重的棕色瓶中冻干的 L-DOPA 和苄丝肼混合物加入适量无菌生理盐水，充分振荡 10 秒。配制完成后，立即用装有26号针头的注射器分别抽取每只动物所需的L-DOPA-苄丝肼混合液体积，并用个体动物标识标记每支注射器。将第一个笼子移至注射操作台后，将大鼠从笼中取出并放置在注射操作面上。用非优势手手掌抵住操作面，固定大鼠的头部和肩部，同时用拇指和食指捏住肩胛骨区域背部的皮肤使其固定。用惯用手将 L-DOPA 溶液注射到手指间的皮下间隙，保持针头与身体平行，以避免肌肉注射。注射后，将大鼠放入笼中。接着，设置计时器为一到两分钟，每隔一到两分钟注射一只大鼠，重复此操作，直至所有大鼠完成注射。在评分当天，将计时器放置于笼子旁，观察左旋多巴诱导的运动障碍（LID）行为强度，同时在评分期间估算任何特定行为的发生频率。在预定的时间点数量下，对肌张力障碍和多动性运动障碍动作的强度与频率进行评分，包括LID行为的初始出现、行为高峰以及衰退阶段。若采用一分钟为间隔的评分方式，则设置一分钟计时器，对第一只大鼠进行评分，并以一分钟为间隔依次完成所有大鼠的评分。帕金森病大鼠异常不自主行为的LID评分被分为行为强度和频率两个方面。在大鼠中观察到一系列异常不自主运动，包括肌张力障碍、多动和刻板行为。代表性分析示例展示了在整个实验时间线和给药方案中，以峰值剂量LID形式呈现的数据。峰值剂量LID被定义为群体平均LID评分最高的时间点。此外，将不同L-DPOA浓度下各每日评分时间过程的LID评分数据合并各组后，以单个动物为单位进行分析和绘图。行为学评估受试者的死后组织可用于探索与左旋多巴诱导的运动障碍相关的分子机制，以及治疗干预对这些分子机制的影响。左旋多巴诱导的运动障碍动物模型在阐明该行为异常的多种潜在机制方面发挥了重要作用。这些认识已推动了多个靶点的临床前和临床评估。

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小鼠MPTP诱导帕金森病模型中自发运动行为评估

我们提供了一种通过将导管植入基底神经节和小脑并连接至渗透压泵，以建立药理学DYT/PARK-ATP1A3肌张力障碍小鼠模型的实验方案。本文描述了通过施加运动刺激诱导类肌张力障碍样运动，并利用行为评分系统对表型进行特征分析的方法。...

植入渗透压泵并诱导应激以建立症状性药理学小鼠模型用于 DYT/PARK-ATP1A3 肌张力障碍研究

本文介绍了RatWalker系统，该系统通过重新设计MouseWalker装置，以适应大鼠更大的体型和体重。该系统采用全内反射失配（FTIR）技术、高速视频采集以及开源分析软件，用于追踪并量化步态参数。...

应用 RatWalker 系统对帕金森病遗传性大鼠模型进行步态分析

6-羟基多巴胺（6-OHDA）模型已被使用数十年，以促进对帕金森病的理解。在本方案中，我们演示如何通过在内侧前脑束注射6-OHDA，在大鼠中建立单侧黑质纹状体损伤，评估运动功能缺陷，并利用步态测试预测损伤程度。...

帕金森病的6-羟基多巴胺大鼠模型

L-多巴诱导的运动障碍啮齿类动物模型是识别治疗干预措施以减轻或缓解因反复给予L-多巴而引发的运动障碍发生与表现的宝贵工具。本方案展示了如何在单侧6-羟基多巴胺（6-OHDA）损毁的帕金森病大鼠模型中诱导并分析类似运动障碍的动作。...

评估帕金森病单侧6-OHDA损毁大鼠模型中L-DOPA诱导的运动障碍

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