用于肽组学研究的胺类还原甲基化法样品制备与相对定量

本文介绍了一种基于快速加热灭活蛋白酶的教学方法，用于保存天然的细胞内肽段，避免细胞和组织中肽段的降解，随后通过同位素标记进行肽段的相对定量。该标记方法具有诸多优势：试剂可商业获取，价格低廉，化学性质稳定，并可在单次血清样本中同时分析多达五个样品。

首先，在含有15%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于15厘米培养皿中培养人神经母细胞瘤细胞。将细胞置于37°C、5%二氧化碳条件下培养。用PBS洗涤细胞两次，然后加入10毫升PBS，刮取细胞并收集至15毫升离心管中。

将细胞在800 × g离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于1毫升80摄氏度的超纯去离子水中，然后将管内液体转移至2毫升微量离心管中。在对斑马鱼进行热灭活后，将其全脑收集至2毫升微量离心管中，并于-80摄氏度冷冻保存，直至分析。

将组织样本重悬于1 mL超纯去离子水中，于80摄氏度下使用探头超声处理，共30次，每次1秒。将细胞裂解物或匀浆组织在80摄氏度孵育20分钟，然后置于冰上冷却10至30分钟。每1 mL样本体积加入10 µL 1 M盐酸储备溶液。

涡旋振荡20秒混匀，冰上孵育15分钟。在4°C条件下，以12,000 × g离心细胞裂解物或组织匀浆15分钟。收集上清液至低吸附蛋白微量离心管中，并于-80°C保存。

用水清洗超滤装置，并在2,300 × g条件下离心3分钟，然后弃去超滤装置中的水。用移液器将上清液转移至预先清洗过的10千道尔顿截留分子量滤膜中，在4°C条件下于冷藏离心机中离心。检测样品的pH值。

用1毫升100%乙腈平衡色谱柱，然后用1毫升含0.1%三氟乙酸的5%乙腈洗涤色谱柱。将样品的全部体积上样至色谱柱，并用1毫升含0.1%三氟乙酸的5%乙腈洗涤色谱柱。用1.8毫升含0.15%三氟乙酸的1%乙腈将肽段从色谱柱中洗脱至低吸附蛋白微量离心管中。

在30摄氏度下使用真空离心机将样品完全干燥，并监测显示屏上的浓缩时间。将样品储存在-80摄氏度条件下。用100至200微升超纯水重悬肽样品，并用移液器将2.5微升的标准肽浓度溶液和样品加入白色96孔板中。

加入 25 微升 0.2 摩尔磷酸缓冲液和 12.5 微升荧光胺。在轨道摇床上轻轻混匀一分钟。接着，加入 110 微升水以终止反应。

调整荧光分光光度计的设置，然后读取酶标板。向每份含有最多25微克肽的样品中加入等体积十分之一的1摩尔三甲基溴化铵溶液。确保pH值在5至8之间，必要时用盐酸或氢氧化钠调节。

加入4 µL非氘代、氘代或碳-13氘代甲醛。涡旋混合5秒。向肽样品中加入4 µL氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠。

然后通过涡旋混合样品5秒。将肽样品在室温下于通风橱中孵育2小时，每30分钟涡旋一次。重复加入非氘代、氘代或碳-13氘代甲醛以及氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠，每次加入后均进行涡旋混合。

将样品在室温下的通风橱中孵育过夜。加入16 µL碳酸氢铵，涡旋混匀。将样品置于冰上。

加入8 µL 5%甲酸，涡旋振荡5秒。合并肽样品，调节pH至2到4之间，然后使用乙腈和三氟乙酸在反相纯化柱上对合并的样品进行脱盐，方法如前所述。在30°C下用真空离心浓缩仪将样品完全干燥，随后于-20°C保存。

通过质谱观察标记的肽段。红色箭头指示了使用两种同位素形式（L1 和 L5）标记的不同肽段峰对的存在，用于分别比较两个不同样品 S1 和 S2。此处展示了在三个不同样品 S1、S2 和 S3 中存在的某一肽段的质谱图，该肽段分别用 L1、L3 和 L5 标签进行标记。

进行了四重标记实验。对照样品S1和S3分别用L1和L3标记，并与两个实验样品S2和S4（分别用L2和L4标记）进行比较。未观察到显著差异。该同位素标记用于在体外显示特定蛋白酶或肽酶反应中产物所含的底物。

此处显示的是一种在神经溶素酶存在下不发生变化的肽。在酶存在时消失或减少的肽被视为底物，而增加的肽则被视为产物。该图展示了通过数据库搜索引擎进行肽段序列鉴定的一个示例，图中用三种不同形式的标签进行标注。

在进行定义之前，需确保样品已完全冷却，以避免因剧烈酸化导致肽键断裂。此外，超滤装置的清洗至关重要。质谱法是一种优异的方法，可用于在不同实验条件下定量肽段，并通过鉴定肽酶底物来开展分析研究。