Name: 使用胺还原甲基化进行样品制备和相对定量，用于肽学研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学习利用热灭活蛋白酶保存内源性肽，并通过同位素标记与LC-MS实现相对定量分析。该方法使用人神经母细胞瘤细胞，试剂商业可得且成本低廉，适用于多种生物样本的肽组学研究。

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本文所述技术的开发与使用得到了巴西国家研究理事会基金项目 420811/2018-4（LMC）以及圣保罗研究基金会（www.fapesp.br）基金项目 2019/16023-6（LMC）、2019/17433-3（LOF）和 21/01286-1（MEME）的支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或文章撰写过程中均未发挥任何作用。

以下多肽提取与还原性甲基化的操作步骤改编自先前已发表的方法24,25,26,27。本方案遵循巴西国家动物实验控制委员会（CONCEA）的指导原则，并已获得圣保罗州立大学生物科学研究所动物使用伦理委员会（CEUA）的批准。方案步骤见图1。
注意：所有水溶液均需使用超纯水配制。
1. 肽段提取
<ol>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下，将SHSY5Y细胞培养于15 cm培养皿中2 在含15%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中。</li>
		<li>每个样本使用2-3个培养板。将细胞培养至100%汇合度。</li>
		<li>处理结束后，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。随后加入10 mL磷酸盐缓冲液，刮取细胞并收集至15 mL离心管中。</li>
		<li>以 800 x g 离心 g 5 分钟后去除上清液。将沉淀物重悬于 1 mL 80 °C 的超纯去离子水中。</li>
		<li>将管内物质（细胞裂解液）转移至2 mL微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物组织（主要是神经组织）：
	<ol>
		<li>麻醉野生型雄性成年果蝇 Danio rerio （斑马鱼）用致死剂量的 MS 222（100 mg/L）安乐死后，立即接受 8 秒微波辐射以灭活肽酶和蛋白酶。 
		注意：可使用家用型微波炉。本实验采用900 W微波炉，全功率加热8至10秒。所使用的微波炉必须能够将脑组织温度升高至 &gt; 80 °C，耗时10秒。将组织置于微波炉内的相同位置，也有助于提高样品间加热的重复性。</li>
		<li>热灭活后，将整个大脑收集至2 mL微量离心管中，并于−80 °C冷冻保存，直至分析。</li>
		<li>将组织样本重悬于1 mL超纯去离子水中，80 °C下孵育。使用探头超声处理组织，以4 Hz频率进行30次脉冲，每次1 s。 
		注意：对于肝脏和肾脏组织，使用机械匀浆器在10,000–30,000 rpm条件下匀浆20秒。对于肌肉组织，使用瓷研钵和研杵在液氮中研磨组织。后续步骤与细胞裂解液或匀浆组织的处理相同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞裂解液或组织匀浆在 80 °C 下孵育 20 分钟。随后在冰上冷却 10–30 分钟。</li>
	<li>每1 mL样品体积加入10 µL的1 M HCl储备液，使终浓度为10 mM。涡旋混匀20 s，再于冰上孵育15 min。 
	注意：在酸化前，确保样品已完全冷却，以避免因高温下酸化导致肽键断裂。</li>
	<li>将细胞裂解液或组织匀浆在12,000 x g 4 °C 下孵育 15 分钟。将上清液收集至低吸附蛋白微量离心管中，并于 -80 °C 保存。</li>
	<li>清洁超滤装置（10 kDa 截留分子量滤器），加入水后在 2300 x g 条件下离心 g 3 分钟。重复此步骤两次。</li>
	<li>将上清液加入预先清洗过的10 kDa截留分子量滤膜中，在4 °C条件下，于冷冻离心机中以2,300 × g离心50分钟。穿滤液即为肽提取物。</li>
	<li>使用反相纯化柱对样品进行脱盐处理，具体操作按照制造商说明书进行，所用溶液为下述的乙腈（ACN）和三氟乙酸（TFA）溶液：
	<ol>
		<li>用1 mL 100%乙腈平衡色谱柱。</li>
		<li>用1 mL含0.1%三氟乙酸的5%乙腈溶液洗涤色谱柱。</li>
		<li>将样品的全部体积上样至色谱柱中。</li>
		<li>用1 mL含0.1%三氟乙酸的5%乙腈溶液洗涤色谱柱</li>
		<li>使用含有0.15% TFA的100%乙腈溶液1.8 mL，将肽段从色谱柱洗脱至蛋白质低吸附性微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在真空离心机中将样品完全干燥。设置有机溶剂的浓缩模式，温度为 30 °C。浓缩时间由显示屏实时监测。
	<ol>
		<li>将样品于−80°C保存，直至进行下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用荧光胺进行肽段定量
注意：可使用荧光胺在 pH 6.8 条件下定量多肽含量，方法如前所述11,28。该方法基于荧光胺分子与多肽中赖氨酸（K）残基和/或N端存在的伯胺基团发生偶联反应。反应在 pH 6.8 条件下进行，以确保荧光胺仅与多肽的氨基反应，而不与游离氨基酸反应。荧光胺信号通过荧光分光光度计检测，激发波长为 370 nm，发射波长为 480 nm。
<ol>
	<li>配制不同浓度的标准肽溶液（0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.5 和 0.7 µg/µL），并将分装样品储存于 -20 °C。 
	注：建议使用肽 5A（LTLRTKL），因其具有已知的组成和浓度。</li>
	<li>用丙酮配制荧光胺储备液（0.3 mg/mL）。迅速分装至微量离心管中（每管 1 mL），用封口膜密封，并于 -20 °C 避光保存。</li>
	<li>配制 pH 6.8 的 0.2 M 磷酸盐缓冲液（PB）。 
	注：通过将 0.1 M 磷酸盐缓冲液 pH 6.8（26.85 mL 的 1 M Na2HPO3）和 0.1 M 磷酸盐缓冲液 pH 6.8（23.15 mL 的 1 M NaH2PO3）加入 250 mL 水中，配制 0.2 M PB。</li>
	<li>用 100–200 µL 超纯水重悬肽样品。</li>
	<li>用移液器将 2.5 µL 的标准肽溶液各浓度及样品分别加入白色 96 孔板中，每个样本设三个复孔，用于荧光检测。每孔加入 25 µL 的 0.2 M 磷酸盐缓冲液。</li>
	<li>使用多通道移液器加入 12.5 µL 荧光胺溶液，并在轨道振荡摇床上轻轻混匀 1 分钟。</li>
	<li>随后，使用多通道移液器加入 110 µL 水以终止反应。 
	注：将荧光胺储备液和超纯水分别转移至两个储液槽中，以便使用多通道移液器加样。</li>
	<li>在荧光分光光度计上设置以下读数参数：从顶部读数，激发波长为 370 nm，发射波长为 480 nm。</li>
	<li>在荧光分光光度计上读取酶标板数据。</li>
</ol>
3. 胺类标记的还原性甲基化
注意：该同位素标记方法基于使用氘代和非氘代的甲醛与氰基硼氢化钠试剂对胺基进行二甲基化。该反应的最终产物在每个可用的标记位点（赖氨酸或N端）使每个肽段的最终质量增加28 Da、30 Da、32 Da、34 Da或36 Da。在质谱图中，使用不同形式试剂标记的肽段会产生不同的m/z值（表1）。
警告：操作这些化合物时应使用适当的安全设备，并注意尽量减少暴露。甲醛和氰基硼氢化钠试剂的操作必须在通风橱中进行，因为这些物质具有很强的毒性（包括称量氰基硼氢化钠时）。在淬灭反应和酸化过程中，可能会产生有毒气体（氰化氢）。
<ol>
	<li>在实验当天，使用超纯水从储备液或试剂中配制以下新鲜溶液：
	<ol>
		<li>将37%甲醛（CH2O) 至 4%。</li>
		<li>将20%氘代甲醛（CD2O) 至 4%。</li>
		<li>稀释20%的氘代C储备液13 甲醛（13CD2O）至 4%。</li>
		<li>配制 0.6 M NaBH3CN。</li>
		<li>配制 0.6 M NaBD3CN。</li>
		<li>配制1%碳酸氢铵溶液。</li>
		<li>配制5%甲酸溶液。 
		注意：关于肽段的相对定量，由于根据所用标签数量的不同可采用多种实验方案，因此在化学标记过程中需格外注意。建议将标签的小份样品分别置于不同的试管架中，并与相应的待标记样品对应放置，以降低将错误试剂加入样品管中的人为错误风险。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备每个含有最多25 µg肽的样品。样品中不得含有Tris或碳酸氢铵。 
	注：以下所述用量适用于每个体积为 100 µL 的样品。 
	在通风橱中进行步骤 3.3–3.8。</li>
	<li>加入1/10th 加入1 M TEAB溶液至样品中（TEAB终浓度为100 mM）。用pH试纸检测pH值，应在5–8之间；若需要，可用HCl或NaOH调节。</li>
	<li>加入4 µL非氘代甲醛、氘代甲醛或C13 根据既定标记方案加入氘代甲醛，涡旋混匀5秒。</li>
	<li>加入 4 µL NaBH3CN（0.6 M）或 NaBD3根据既定标记方案加入 CN（0.6 M）。涡旋混匀 5 秒。</li>
	<li>在室温下于通风橱中孵育2小时，每30分钟混匀一次。</li>
	<li>重复步骤 3.4 和 3.5。将样品在室温下于通风橱中孵育过夜。</li>
	<li>加入16 µL碳酸氢铵（1%），涡旋混匀。将样品置于冰上，加入8 µL甲酸（5%），涡旋混合5秒。</li>
	<li>将样品合并，调节pH至2-4，并按照步骤1.8中所述方法，使用反相纯化柱对合并后的样品进行脱盐。</li>
	<li>在真空离心机中将样品完全干燥。设置有机溶剂的浓缩模式，温度为 30 °C。浓缩时间由显示屏实时监控。</li>
	<li>将样品在 -20 °C 下保存。</li>
</ol>
4. 液相色谱与质谱分析
<ol>
	<li>使用与甲基标签兼容的纳米高效液相色谱系统连接质谱仪进行液相色谱-质谱分析。 
	​注意：多种质谱仪均兼容RMA标记。通常采用连接Orbitrap的纳米高效液相色谱系统，通过纳米电喷雾离子源进行液相色谱-质谱分析。首先将样品加载至预柱，肽段在分析柱中分离。使用含0.1%甲酸的5%-45%乙腈线性梯度在90分钟内洗脱肽段，流速为200 nL/min。质谱仪设置为数据依赖模式。每次全扫描的参数为10-30 eV、2.3 Kv，随后选择强度最高的十个峰进行碰撞诱导解离（CID）碎裂。离子阱的注入时间设为100 ms，傅里叶变换（FT）-MS的注入时间固定为1000 ms，分辨率设为30,000，m/z范围为300-1800。碎裂扫描时采用至少5000计数的阈值，并设置70秒的动态排除时间。</li>
</ol>
5. 肽的相对定量
注意：质谱数据在质谱仪配套软件中进行分析。在质谱图中识别出带有不同标签的标记肽段的峰组。相对定量通过各单一同位素峰的强度进行计算。每个处理组均与相应的对照组进行比较。
<ol>
	<li>右键双击原始样品文件以打开质谱分析软件。在上方和下方的两个标签页中分别加载保留时间（RT）和质谱（EM）色谱图。</li>
	<li>依次在软件工具栏中右键单击 Display 和 Mass 选项图标，并将质量精度设置为四位小数。</li>
	<li>将鼠标光标置于 RT 标签页任意位置，查找待分析离子对应的保留时间，然后单击鼠标右键。所选时间点的质谱图将自动在 EM 标签页中显示。</li>
	<li>将鼠标光标置于 EM 标签页任意位置，查找待分析的离子。</li>
	<li>在这些离子左侧相邻区域附近右键单击并按住，然后向右拖动鼠标至所需范围，以放大目标区域。</li>
	<li>保持鼠标位于 EM 标签页，点击键盘上的左或右方向键，以定义待分析离子的范围。</li>
	<li>再次将鼠标光标移至 RT 标签页中所需时间区间的起始位置。</li>
	<li>右键单击并拖动鼠标至选定的时间值后松开按钮。离子的累积强度将自动在 EM 标签页中显示。</li>
	<li>将 m/z、z 值和离子强度数据收集到电子表格中。 
	注：未添加甲基基团的每个肽段的单一同位素质量可通过以下公式计算： 
	 
	未修饰肽段质量 = (m/z a × z) - (C a × T) - (1.008 × z) 
	 
	m/za 表示每个使用不同标签组合标记的肽段单一同位素峰的观测质荷比（a = 1, 2, 3, 4 或 5，对应样品编号）。 
	z 表示电荷态。 
	Ca 表示一对甲基基团的单一同位素质量： 
	当 a=1 时，Ca = 28.0313（向伯胺净添加两个 CH3 基团） 
	当 a=2 时，Ca = 30.0439（两个 CHD2 基团） 
	当 a=3 时，Ca = 32.0564（两个 CD2H 基团） 
	当 a=4 时，Ca = 34.0690（两个 CD3 基团） 
	当 a=5 时，Ca = 36.0757（两个 13CD3 基团） 
	T 表示整合到肽段中甲基对的数量。当使用五种标签时，可通过以下公式计算： T = z*(m/z5 - m/z1)/8。对于仅含有一个伯胺的肽段，仅被两个甲基标记，在使用相邻标签时其质谱峰会出现重叠。每个标记肽段的峰强度可使用 Tashima 和 Fricker25 描述的方程进行校正。</li>
</ol>
6. 肽段鉴定
<ol>
	<li>为鉴定肽段，使用数据库搜索引擎分析 MS/MS 数据29,30。</li>
	<li>为利用诱饵融合法计算错误发现率（FDR），需搜索诱饵数据库。 
	​注意：通常使用的搜索参数包括：无酶切特异性；前体离子质量容差设为 15–50 ppm；碎片离子质量容差为 0.5 Da；可变修饰：赖氨酸残基和肽段N端反应性胺基的同位素甲基化标记（L1 (+28)、L2 (+30)、L3 (+32)、L4 (+34) 和 L5 (+36)）、甲硫氨酸氧化（+15.99 Da）以及乙酰化（+42.01 Da）。</li>
	<li>随后，根据肽段的局部置信度平均值对其进行排序，以选择最佳谱图进行注释，并通过 FDR ≤5% 进行筛选。</li>
</ol>
<img alt="多肽提取流程图；蛋白酶失活、同位素标记、液相色谱-串联质谱定量过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62971/62971fig01.jpg" data-altupdatedat="1762425657000" data-alt="图1"> 
图1：多肽组学研究工作流程。多肽提取及胺类还原甲基化步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62971/62971fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

不存在竞争性财务利益。

在大多数肽组学研究中，一个关键步骤无疑是样品制备，必须谨慎操作以避免死后数分钟内蛋白酶降解产生的肽段片段。早期对非微波处理样品制备的脑组织提取物研究表明，10-kDa 微滤液中存在大量蛋白质片段。已有多种方法被描述用于避免蛋白质降解带来的肽谱干扰：采用聚焦微波辐照法处死动物6,8、冷冻切片后使用沸水提取缓冲液31,以及动物处死后使用家用微波炉对组织进行微波辐照9,26。对于细胞培养物和某些组织，可通过直接加入80 °C的水实现蛋白酶的失活。然而，某些样品（如神经组织）对死后变化更为敏感，微波辐照灭活蛋白酶被认为是一种优选方法。此外，肽提取过程中的另一个重要环节是确保在加入酸之前提取物始终处于冰浴状态，以防止酸不稳定的化学键断裂，例如Asp-Pro键的裂解26。
<p class="...

&#34;组学&#34; 科学的特点是对一系列分子（如DNA、RNA、蛋白质、肽、代谢物等）进行深入分析。这些产生的大规模数据集（基因组学、转录组学、蛋白质组学、肽组学、代谢组学等）已彻底改变了生物学，并推动了对生物过程的深入理解1肽组学（peptidomics）这一术语始于21世纪初th 世纪，一些作者将其称为蛋白质组学的一个分支2然而，肽组学具有其独特之处，主要关注在细胞过程中天然生成的肽类物质的组成，以及这些分子生物学活性的表征。3,4.
最初，生物活性肽的研究仅限于通过埃德曼降解法和放射免疫分析法进行的神经肽和激素肽研究。然而，这些技术无法实现全局分析，因为它们依赖于每种肽的高浓度分离、抗体的制备时间，以及存在交叉反应的可能性5。
肽组学分析只有在液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）和基因组学项目取得多项进展后才成为可能，这些进展为蛋白质组学/肽组学研究提供了全面的数据资源6,7此外，需要建立一种针对肽组的特异性肽提取方案，因为早期对脑组织样本中神经肽进行全貌分析的研究表明，蛋白质在死亡后1分钟内主要于该组织中发生大量降解，从而影响检测结果。这些肽片段的存在会掩盖神经肽信号，且不能代表真实的肽组。 体内该问题主要通过微波辐射快速加热灭活蛋白酶得以解决，这种方法显著减少了这些人工片段的存在，不仅实现了神经肽片段的鉴定，还揭示了一组来源于胞质、线粒体和细胞核蛋白的肽段，其组成不同于降解组。6,8,9.
这些方法学步骤使得肽组的范围超出了已知的神经肽，已在酵母10、斑马鱼11、啮齿类动物组织12和人类细胞13中鉴定出主要由蛋白酶体作用产生的数百种细胞内肽。已有大量研究表明，这些细胞内肽中的数十种具有生物学和药理学活性14,15。此外，这些肽可作为疾病生物标志物，可能具有临床意义，例如在颅内囊性动脉瘤患者脑脊液中的研究结果所示16。
目前，除了鉴定肽段序列外，还可通过质谱技术获得绝对定量和相对定量的数据。在绝对定量中，生物样本中的肽段水平与合成标准品进行比较；而在相对定量中，则对两个或多个样本之间的肽段水平进行比较17相对定量可以采用以下方法进行：1） &#34;无标记&#34;18; 2) 体内 代谢标记或3）化学标记。后两种方法基于使用掺入肽段中的稳定同位素形式19,20在无标记分析中，通过考虑液相色谱-质谱（LC-MS）过程中的信号强度（谱图计数）来估算肽段水平。18然而，同位素标记能够获得更准确的肽段相对定量水平。
许多肽组学研究曾使用三甲基铵丁酸酯（TMAB）标记试剂进行化学标记，而近年来，也逐渐采用氘代和非氘代的甲醛与氰基硼氢化钠试剂对胺基进行还原甲基化标记（RMA）11,21,22。然而，TMAB 标记试剂无法商业获取，且其合成过程极为繁琐。相比之下，RMA 所用试剂可商业化获得，成本较低，操作简便，且标记后的肽段稳定性良好23,24。
RMA 的使用涉及通过使肽与甲醛反应形成席夫碱，随后通过氰基硼氢化物进行还原反应。该反应导致 N 末端和赖氨酸侧链上的游离氨基发生二甲基化，并使 N 末端的脯氨酸发生单甲基化。由于脯氨酸残基在 N 末端通常较为罕见，实际上所有在 N 末端具有游离氨基的肽均被标记上两个甲基基团23,24,25.

<table><tbody><tr><td>10 kDa 截留分子量滤膜</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL 膜, 10 kDa</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11213</td><td></td></tr><tr><td>分析柱（EASY-Column）</td><td>EASY-Column</td><td>(SC200)</td><td>&amp;nbsp;10 cm, 内径75 &amp;micro;m, 3 &amp;micro;m, C18-A2</td></tr><tr><td>氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>荧光胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>甲醛-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C, d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>596388</td><td></td></tr><tr><td>甲醛-d2 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33015</td><td></td></tr><tr><td>通风橱</td><td>Quimis</td><td>Q216</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 - HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>LoBind 蛋白质保留管</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108116-100EA</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTQ Velos</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Panasonic</td><td>NN-ST67HSRU</td><td></td></tr><tr><td>n Easy-nLC II 纳米液相色谱仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC140</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio</td><td>Bioinformatics Solutions Inc.</td><td>VERSION 8.5</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>3002</td><td>片剂</td></tr><tr><td>预柱（EASY-Column）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>(SC001)</td><td>2 cm, 内径100 &amp;micro;m, 5 &amp;micro;m, C18-A1</td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Hermle</td><td>Z326K</td><td>用于锥形管</td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Vision</td><td>VS15000CFNII</td><td>用于微量管</td></tr><tr><td>反相净化柱&amp;nbsp;&amp;nbsp;（Oasis HLB 1 cc 小柱）</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td>Oasis HLB 1 cc 小柱</td></tr><tr><td>氰基硼氘化钠 - NaBD&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190020</td><td></td></tr><tr><td>氰基硼氢化钠 - NaBH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156159</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td>注：0.2 M PB = 0.1 M 磷酸盐缓冲液 pH 6.8（26.85 mL 1M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）加 0.1 M 磷酸盐缓冲液 pH 6.8（23.15 mL 1M NaH2PO3）定容至 250 mL 水</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Qsonica</td><td>Q55-110</td><td></td></tr><tr><td>标准肽段</td><td>Proteimax</td><td></td><td>氨基酸序列：LTLRTKL</td></tr><tr><td>三乙基铵缓冲液 - TEAB 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸 - TFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>Milli-Q</td><td>Direct-Q 3UV</td><td></td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪</td><td>GeneVac</td><td>MiVac DNA 浓缩仪</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Cientec</td><td>266</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 软件</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>OPTON-30965</td><td></td></tr></tbody></table>

用于肽组学研究的胺类还原甲基化法样品制备与相对定量

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

肽组学可定义为对生物样品中肽类进行定性和定量分析。其主要应用包括鉴定疾病或环境胁迫的肽类生物标志物、鉴定神经肽、激素及具有生物活性的细胞内肽类、从蛋白质水解物中发现抗菌肽和营养功能肽，以及用于研究蛋白水解过程。近年来，样品制备、分离方法、质谱技术以及与蛋白质测序相关的计算工具的进步，显著增加了已鉴定肽段的数量和被表征的肽组。肽组学研究通常分析在细胞内天然生成的肽段。本文描述了一种基于热灭活的样品制备方案，该方法可消除蛋白酶活性，并在温和条件下进行提取，从而避免肽键的断裂。此外，还展示了利用胺基还原甲基化进行稳定同位素标记以实现肽段相对定量的方法。该标记方法具有若干优势：试剂 commercially available（商品化）、成本较低、化学性质稳定，并允许在单次液相色谱-质谱（LC-MS）分析中同时检测多达五个样品。

在质谱仪上运行所获得的结果被存储在原始数据文件中，这些文件可在质谱仪软件中打开。在质谱图中，可以观察到代表标记肽的峰群，其数量取决于所使用的标记方案，标记数通常为2至5个。例如，在图2中，展示了在同一运行中对两个不同样品使用两种同位素标记时，在某一色谱时间点检测到的成对峰。图3展示了在每次液相色谱-质谱（LC-MS）运行中使用3种和4种不同标记时其他可能的阳性结果。当在一次液相色谱/质谱（LC/MS）运行中使用4种或5种标记时，不同标签标记肽的峰可能会发生重叠，需进行校正，以获得各峰的真实强度值（图4）。
同位素标记也可用于显示底物和产物 体外 对于特定的蛋白酶或肽酶，如图所示 图5最后，可以使用不同的软件来鉴定标记的肽段，例如 Peaks Studio 或 MASCOT。这些软件专为蛋白质组学分析而设计，因此其蛋白质定量数据不...

本文介绍了一种基于加热灭活的样品制备方法，用于保护内源性肽段以避免死后降解，随后采用同位素标记结合液相色谱-质谱法（LC-MS）进行相对定量。

肽组学可定义为对生物样品中肽类进行定性和定量分析。其主要应用包括鉴定……

本文介绍了一种基于快速加热灭活蛋白酶的教学方法，用于保存天然的细胞内肽段，避免细胞和组织中肽段的降解，随后通过同位素标记进行肽段的相对定量。该标记方法具有诸多优势：试剂可商业获取，价格低廉，化学性质稳定，并可在单次血清样本中同时分析多达五个样品。首先，在含有15%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于15厘米培养皿中培养人神经母细胞瘤细胞。将细胞置于37°C、5%二氧化碳条件下培养。用PBS洗涤细胞两次，然后加入10毫升PBS，刮取细胞并收集至15毫升离心管中。将细胞在800 × g离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于1毫升80摄氏度的超纯去离子水中，然后将管内液体转移至2毫升微量离心管中。在对斑马鱼进行热灭活后，将其全脑收集至2毫升微量离心管中，并于-80摄氏度冷冻保存，直至分析。将组织样本重悬于1 mL超纯去离子水中，于80摄氏度下使用探头超声处理，共30次，每次1秒。将细胞裂解物或匀浆组织在80摄氏度孵育20分钟，然后置于冰上冷却10至30分钟。每1 mL样本体积加入10 µL 1 M盐酸储备溶液。涡旋振荡20秒混匀，冰上孵育15分钟。在4°C条件下，以12,000 × g离心细胞裂解物或组织匀浆15分钟。收集上清液至低吸附蛋白微量离心管中，并于-80°C保存。用水清洗超滤装置，并在2,300 × g条件下离心3分钟，然后弃去超滤装置中的水。用移液器将上清液转移至预先清洗过的10千道尔顿截留分子量滤膜中，在4°C条件下于冷藏离心机中离心。检测样品的pH值。用1毫升100%乙腈平衡色谱柱，然后用1毫升含0.1%三氟乙酸的5%乙腈洗涤色谱柱。将样品的全部体积上样至色谱柱，并用1毫升含0.1%三氟乙酸的5%乙腈洗涤色谱柱。用1.8毫升含0.15%三氟乙酸的1%乙腈将肽段从色谱柱中洗脱至低吸附蛋白微量离心管中。在30摄氏度下使用真空离心机将样品完全干燥，并监测显示屏上的浓缩时间。将样品储存在-80摄氏度条件下。用100至200微升超纯水重悬肽样品，并用移液器将2.5微升的标准肽浓度溶液和样品加入白色96孔板中。加入 25 微升 0.2 摩尔磷酸缓冲液和 12.5 微升荧光胺。在轨道摇床上轻轻混匀一分钟。接着，加入 110 微升水以终止反应。调整荧光分光光度计的设置，然后读取酶标板。向每份含有最多25微克肽的样品中加入等体积十分之一的1摩尔三甲基溴化铵溶液。确保pH值在5至8之间，必要时用盐酸或氢氧化钠调节。加入4 µL非氘代、氘代或碳-13氘代甲醛。涡旋混合5秒。向肽样品中加入4 µL氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠。然后通过涡旋混合样品5秒。将肽样品在室温下于通风橱中孵育2小时，每30分钟涡旋一次。重复加入非氘代、氘代或碳-13氘代甲醛以及氰基硼氢化钠或氘代氰基硼氢化钠，每次加入后均进行涡旋混合。将样品在室温下的通风橱中孵育过夜。加入16 µL碳酸氢铵，涡旋混匀。将样品置于冰上。加入8 µL 5%甲酸，涡旋振荡5秒。合并肽样品，调节pH至2到4之间，然后使用乙腈和三氟乙酸在反相纯化柱上对合并的样品进行脱盐，方法如前所述。在30°C下用真空离心浓缩仪将样品完全干燥，随后于-20°C保存。通过质谱观察标记的肽段。红色箭头指示了使用两种同位素形式（L1 和 L5）标记的不同肽段峰对的存在，用于分别比较两个不同样品 S1 和 S2。此处展示了在三个不同样品 S1、S2 和 S3 中存在的某一肽段的质谱图，该肽段分别用 L1、L3 和 L5 标签进行标记。进行了四重标记实验。对照样品S1和S3分别用L1和L3标记，并与两个实验样品S2和S4（分别用L2和L4标记）进行比较。未观察到显著差异。该同位素标记用于在体外显示特定蛋白酶或肽酶反应中产物所含的底物。此处显示的是一种在神经溶素酶存在下不发生变化的肽。在酶存在时消失或减少的肽被视为底物，而增加的肽则被视为产物。该图展示了通过数据库搜索引擎进行肽段序列鉴定的一个示例，图中用三种不同形式的标签进行标注。在进行定义之前，需确保样品已完全冷却，以避免因剧烈酸化导致肽键断裂。此外，超滤装置的清洗至关重要。质谱法是一种优异的方法，可用于在不同实验条件下定量肽段，并通过鉴定肽酶底物来开展分析研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用胺还原甲基化进行样品制备和相对定量，用于肽学研究

两种用于指定还原性α-和ε-二甲胺核磁共振信号的方法 13C-甲基化 N-末端赖氨酸的描述。一种方法利用还原性甲基化反应的pH诱导选择性，另一种方法使用氨肽酶选择性去除...

用于鉴定还原甲基化蛋白质N端二甲基胺13C标记核磁共振信号的方法

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi 标记）是一种快速、经济的基于质谱的定量蛋白质组学准确分析策略。本文展示了一种利用 ReDi...

使用还原性二甲基化进行稳定同位素标记的定量蛋白质组学

本方案介绍了如何在复杂的生物样品中使用选择反应监测技术对目标蛋白质进行绝对定量分析。该方法已用于准确量化小鼠巨噬细胞趋化信号通路中的蛋白质。文中详细描述了目标肽段的选择、检测方法的建立，以及定性和定量分析过程。...

选择性反应监测质谱法用于蛋白质绝对定量

前体同位素标记与等重标记联合技术（cPILOT）是一种定量蛋白质组学策略，可增强等重标签的样本多重检测能力。本方案描述了cPILOT在阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组织样本中的应用。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）增强组织样本的多重检测能力

本文介绍了一种长程静电排斥-亲水相互作用色谱-串联质谱法（LERLIC-MS/MS）的逐步实验方案。该方法是一种新颖的技术，首次实现了通过鸟枪法蛋白质组学对谷氨酰胺和天冬酰胺脱酰胺异构体进行定量分析和表征。...

基于LERLIC-MS/MS的鸟枪法蛋白质组学中谷氨酰胺与天冬酰胺脱氨作用深度表征与定量分析

前体同位素标记与等重标记联用技术（cPILOT）是一种增强的样本多重分析策略，能够利用现有的等重标签显著增加可同时分析的样本数量。结合机器人平台的应用，极大地提高了实验通量、重复性以及定量准确性。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）实现自动化样本多重分析

本方案旨在介绍使用三重四极杆质谱仪对临床样本中的蛋白质进行多反应监测（MRM）的方法。我们提供了一套系统的工作流程，涵盖从样本制备到数据分析的各个环节，并列出了处理临床样本时所需采取的所有必要预防措施。...

基于多重反应监测技术检测人脑组织蛋白质的定量蛋白质组学工作流程

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

本实验方案描述了通过1H-NMR波谱法对游离及蛋白结合的精氨酸和甲基化精氨酸进行制备与定量检测的方法。...

利用核磁共振波谱技术探索精氨酸甲基化修饰组

我们描述了一种利用紫外光介导的光交联和质谱技术在活细胞中鉴定RNA结合蛋白并绘制其RNA结合区域的实验方案。...

基于质谱的RNA结合区域鉴定的样品制备

学习利用热灭活蛋白酶保存内源性肽，并通过同位素标记与LC-MS实现相对定量分析。该方法使用人神经母细胞瘤细胞，试剂商业可得且成本低廉，适用于多种生物样本的肽组学研究。

用于肽组学研究的胺类还原甲基化法样品制备与相对定量

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