Name: 软件辅助骨关节炎软骨下骨厚度的定量测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 了解使用ImageJ软件定量测量小鼠膝骨关节炎软骨下骨厚度的方法。该方案通过内侧半月板失稳手术建立模型，结合组织学处理和显微成像，实现对早期骨关节炎变化的敏感检测。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所根据资助号R01 AR059088、美国国防部（DoD）根据研究资助号W81XWH-12-1-0304以及Mary和Paul Harrington杰出教授席位捐赠基金资助。

本方案中包含的所有动物实验程序均经堪萨斯大学医学中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，符合所有联邦和州的法律与法规要求。
1. 小鼠膝骨关节炎的建立
<ol>
	<li>通过手术切断内侧半月板（DMM）以建立小鼠膝骨关节炎模型，方法参照Glasson等人的描述。18 在22只10至11周龄的野生型BALB/c小鼠中进行实验。另选取相同遗传背景和年龄的8只小鼠进行假手术作为对照。 
	注意：本研究的原始项目使用了两种性别的实验对象，以满足美国国立卫生研究院（NIH）关于将性别作为生物变量加以考虑的要求，但本方案并不涉及对性别差异的考察。</li>
	<li>通过吸入异氟烷对动物进行麻醉。通过监测其呼吸频率/呼吸力度以及对脚趾/尾部夹捏无反应来检查麻醉深度。将动物置于仰卧位。</li>
	<li>剃除膝关节区域的毛发，使用聚维酮碘-酒精皮肤擦洗剂清洁皮肤，重复交替进行三次。</li>
	<li>在手术显微镜下对右膝进行DMM手术。通过内侧髌旁切口（长1.2–1.5 cm）暴露膝关节，并切开关节囊。保持髌骨和髌腱完整。仔细暴露将内侧半月板固定于胫骨平台的内侧半月板胫骨韧带（MML）后，使用显微外科剪将其横断，以使内侧半月板失稳。</li>
	<li>在右膝进行假手术作为对照操作，其中仅暴露内侧半月板韧带（MML）但不予以切断。</li>
	<li>使用8-0可吸收聚乳酸羟基乙酸缝线缝合关节囊，使用7-0不可吸收缝线缝合皮肤切口，DMM组和假手术组均采用此方法，以确保愈合后膝关节功能正常。</li>
	<li>术前立即皮下注射缓释型丁丙诺啡（SR Buprenorphine，0.20–0.5 mg/kg）以提供镇痛，单次给药可维持镇痛效果长达72小时。术后密切监测动物状态。</li>
	<li>使用 CO2 术后2、8和16周处死动物。动物失去意识后，通过物理方法（打开胸腔）确认死亡。这些安乐死方法符合美国兽医医学协会（AVMA）安乐死专家组的建议。</li>
	<li>在DMM手术后2、8和16周以及假手术后2和16周采集膝关节，用于组织学分析，以获得具有不同程度骨关节炎严重性或软骨下骨增厚的小鼠膝关节。</li>
</ol>
2. 组织切片与组织学图像的制备
<ol>
	<li>用2%多聚甲醛固定小鼠膝关节组织样本，25%甲酸脱钙，石蜡包埋，并进行冠状面切片，以观察内侧和外侧间室。</li>
	<li>使用切片机从膝关节后侧切割膝关节标本，以70–80 µm的间隔收集厚度为5 µm的组织切片，共获得约40张跨越整个膝关节的组织切片。根据微米尺辅助估算，第1–6号切片来自膝关节最远后部，第11–18号来自中后部，第23–30号来自中前部，第35–40号来自最远前部。中间的切片可弃去或另行收集用于其他染色。</li>
	<li>按照制造商说明书，每五张切片进行一次Safranin-O和快绿染色，以特异性识别软骨细胞和基质。按照制造商说明书进行苏木精-伊红染色，以在细胞和组织水平上观察膝关节，方法如先前所述19,20,21,22。</li>
	<li>使用配备数字相机的显微镜采集组织学图像。组织病理学的一般分析及骨关节炎组织学分级按先前所述方法进行15,19,20,21,22。</li>
</ol>
3. 使用 ImageJ 软件对骨关节炎软骨下骨进行定量测量
<ol>
	<li>下载 ImageJ 软件并打开感兴趣的组织学图像。
	<ol>
		<li>从&#160;https://imagej.nih.gov/ij/ 下载捆绑 Java 1.8.0_172 的 ImageJ。</li>
		<li>打开 ImageJ 程序。点击功能区上的 文件 选项卡，然后点击 打开 选项以打开组织学图像。</li>
		<li>找到文件目录地址，选择图片文件，然后点击 打开。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用组织学图像上的显微测微尺对 ImageJ 进行校准。
	<ol>
		<li>使用直线工具在显微测微尺上绘制一个单位长度，然后点击 分析&#62;（然后）设置标尺。将 已知距离 和 像素纵横比 设置为 1，然后点击 确定。ImageJ 可将像素长度转换为显微测微尺上的单位长度。</li>
		<li>将测量因子设置为面积。点击 分析&#62; 设置测量，并在新窗口中勾选 面积 和 限制于阈值 选项。此步骤将 ImageJ 设置为在选定的 &#34;阈值&#34; 范围内测量 &#34;面积&#34; 参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量感兴趣区域的全部软骨下骨（SCB）面积。
	<ol>
		<li>将 SCB 感兴趣区域（ROI）定义为 图 1A 中橙色框所示区域，该区域覆盖股骨内侧髁（MFC）和胫骨内侧平台（MTP）中 SCB 皮质板及其下方邻近皮质板的一部分小梁骨，每个 ROI 具有特定尺寸。骨关节炎相关的 SCB 增厚通常发生于这些区域。为确保所有动物的特定 ROI 测量尺寸一致，应在所有被检关节的每个 MFC 或 MTP 中以相同形状和尺寸定义 SCB ROI。</li>
		<li>使用 ImageJ 主窗口中的多边形选择工具勾勒出整个 SCB 感兴趣区域的轮廓。 
		注：选择工具为系统提供一个阈值，以限制测量区域。</li>
		<li>测量总 SCB 面积：选定阈值后，点击 分析&#62; 测量。将弹出一个显示面积测量结果的 &#34;结果&#34; 窗口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量不含骨髓的实骨部分面积。
	<ol>
		<li>点击 编辑&#62; 清除外侧，以排除总 SCB 区域以外的部分。 
		注：点击 清除外侧 选项后，仅总 SCB 区域可见，该区域外的图像将变为黑色。此步骤使观察者能够专注于感兴趣区域内的实骨部分。</li>
		<li>点击 图像&#62; 调整&#62; 颜色阈值，打开 &#34;颜色阈值&#34; 窗口。在 &#34;颜色阈值&#34; 窗口底部点击 原始，将图像恢复至原始状态。使用第 3.3.2 步中的选择工具在实骨区域绘制一个小框。在 &#34;颜色阈值&#34; 窗口底部点击 取样 选项，以定义实骨区域。 
		注：&#34;颜色阈值&#34; 窗口中的 &#34;取样&#34; 选项允许 ImageJ 在整个 SCB 区域中选取与实骨样本区域相同的全部像素。所选的实骨区域将变为红色。</li>
		<li>在颜色阈值平衡窗口底部点击 选择，以创建面积测量的阈值。在 ImageJ 主菜单中点击 分析&#62; 测量，实骨面积的测量结果将显示在 &#34;结果&#34; 窗口中。</li>
		<li>保存总 SCB 面积和实骨面积的数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算实骨面积（mm2）与总 SCB 面积（mm2）的比值，该比值代表在总 SCB 面积内实骨的厚度（mm2/1.0 mm2）。</li>
	<li>测量 DMM 诱导的骨关节炎远后侧、中后侧、中前侧和远前侧区域（如步骤 2.2 所述）组织切片/图像的 SCB 厚度（如步骤 3.1–3.5 所述），以评估 6 个膝关节的区域特异性 SCB 厚度（图 1B）。 
	&#8203;注：此操作可验证该定量测量方案的可靠性，因为已知骨关节炎相关的 SCB 改变与软骨病变共定位，且在啮齿类动物膝关节的负重区域（中段）中，伴有 SCB 增厚的骨关节炎性软骨损伤更为严重14,15。因此，使用中段切片进行骨关节炎性 SCB 增厚的定量测量是合理的。</li>
</ol>
4. 统计学
<ol>
	<li>使用定量测量和SCB厚度视觉分级的数据进行统计分析。通过Pearson相关系数分析确定观察者间和观察者内变异性和可重复性。</li>
	<li>采用Student t-检验或单因素方差分析（ANOVA），随后使用电子表格软件进行事后检验（Tukey），以确定研究组间差异的显著性。将p值小于0.05视为具有统计学显著性。</li>
</ol>

<ol><li>Kotlarz, H., Gunnarsson, C. L., Fang, H., Rizzo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insurer+and+out-of-pocket+costs+of+osteoarthritis+in+the+US%3A+evidence+from+national+survey+data%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Insurer and out-of-pocket costs of osteoarthritis in the US: evidence from national survey data.</a> Arthritis and Rheumatology. 60 (12), 3546-3553 (2009).</li>
<li>Buckwalter, J. A., Martin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (2), 150-167 (2006).</li>
<li>Weinans, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+peri-articular+bone+changes+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of peri-articular bone changes in osteoarthritis.</a> Bone. 51 (2), 190-196 (2012).</li>
<li>Baker-LePain, J. C., Lane, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+bone+architecture+and+anatomy+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Role of bone architecture and anatomy in osteoarthritis.</a> Bone. 51 (2), 197-203 (2012).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subchondral+bone+in+osteoarthritis%3A+Insight+into+risk+factors+and+microstructural+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Subchondral bone in osteoarthritis: Insight into risk factors and microstructural changes.</a> Arthritis Research and Therapy. 15 (6), 223(2013).</li>
<li>Madry, H., van Dijk, C. N., Mueller-Gerbl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+science+of+the+subchondral+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surgery%2C+Sports%2C+Traumatology%2C+Arthrosclerosis%22%5BJournal%5D)">The basic science of the subchondral bone.</a> Knee Surgery, Sports, Traumatology, Arthrosclerosis. 18 (4), 419-433 (2010).</li>
<li>Milz, S., Putz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+morphology+of+the+subchondral+plate+of+the+tibial+plateau%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Quantitative morphology of the subchondral plate of the tibial plateau.</a> Journal of Anatomy. 185, Pt 1 103-110 (1994).</li>
<li>Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+instability+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine+Insights%3A+Arthritis+and+Musculoskeleton+Disorders%22%5BJournal%5D)">Joint instability and osteoarthritis.</a> Clinical Medicine Insights: Arthritis and Musculoskeleton Disorders. 8, 15-23 (2015).</li>
<li>Waung, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+X-ray+microradiography+for+high-throughput+phenotyping+of+osteoarthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Quantitative X-ray microradiography for high-throughput phenotyping of osteoarthritis in mice.</a> Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1396-1400 (2014).</li>
<li>Botter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+damage+pattern+in+relation+to+subchondral+plate+thickness+in+a+collagenase-induced+model+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Cartilage damage pattern in relation to subchondral plate thickness in a collagenase-induced model of osteoarthritis.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (4), 506-514 (2008).</li>
<li>Nalesso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+calmodulin+kinase+II+activity+is+required+for+cartilage+homeostasis+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis.</a> Science Reports. 11 (1), 5682(2021).</li>
<li>Ding, M., Christian Danielsen, C., Hvid, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hyaluronan+on+three-dimensional+microarchitecture+of+subchondral+bone+tissues+in+guinea+pig+primary+osteoarthrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Effects of hyaluronan on three-dimensional microarchitecture of subchondral bone tissues in guinea pig primary osteoarthrosis.</a> Bone. 36 (3), 489-501 (2005).</li>
<li>Kraus, V. B., Huebner, J. L., DeGroot, J., Bendele, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OARSI+histopathology+initiative+-+recommendations+for+histological+assessments+of+osteoarthritis+in+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 35-52 (2010).</li>
<li>McNulty, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+histological+assessment+of+osteoarthritis+lesions+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in Mice.</a> Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).</li>
<li>Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OARSI+histopathology+initiative+-+recommendations+for+histological+assessments+of+osteoarthritis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).</li>
<li>Pritzker, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis+cartilage+histopathology%3A+grading+and+staging%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging.</a> Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).</li>
<li>Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+metabolic+abnormalities+in+articular+cartilage+from+osteo-arthritic+human+hips.+II.+Correlation+of+morphology+with+biochemical+and+metabolic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery+American%22%5BJournal%5D)">Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data.</a> Journal of Bone and Joint Surgery American. 53 (3), 523-537 (1971).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+Nfat1+deficiency+causes+osteoarthritis+through+dysfunction+of+adult+articular+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor Nfat1 deficiency causes osteoarthritis through dysfunction of adult articular chondrocytes.</a> Journal of Pathology. 219 (2), 163-172 (2009).</li>
<li>Zhang, M., Lu, Q., Budden, T., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFAT1+protects+articular+cartilage+against+osteoarthritic+degradation+by+directly+regulating+transcription+of+specific+anabolic+and+catabolic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Joint+Research%22%5BJournal%5D)">NFAT1 protects articular cartilage against osteoarthritic degradation by directly regulating transcription of specific anabolic and catabolic genes.</a> Bone Joint Research. 8 (2), 90-100 (2019).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetically+mediated+spontaneous+reduction+of+NFAT1+expression+causes+imbalanced+metabolic+activities+of+articular+chondrocytes+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Epigenetically mediated spontaneous reduction of NFAT1 expression causes imbalanced metabolic activities of articular chondrocytes in aged mice.</a> Osteoarthritis Cartilage. 24 (7), 1274-1283 (2016).</li>
<li>Rodova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nfat1+regulates+adult+articular+chondrocyte+function+through+its+age-dependent+expression+mediated+by+epigenetic+histone+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Nfat1 regulates adult articular chondrocyte function through its age-dependent expression mediated by epigenetic histone methylation.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1974-1986 (2011).</li>
<li>Jackson, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+protease-activated+receptor+2+but+not+protease-activated+receptor+1+may+confer+protection+against+osteoarthritis+in+mice+through+extracartilaginous+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms.</a> Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性利益冲突。

测量软骨下骨（SCB）增厚是评估骨关节炎（OA）严重程度组织学评价中的重要组成部分。现有的大多数OA分级系统主要关注软骨的改变15,16,17。一种广泛使用的小鼠骨关节炎SCB厚度分级方法将SCB增厚分为轻度、中度和重度，但该方法在很大程度上依赖主观判断，其可靠性尚未得到充分验证15。本研究开发并验证了一种新的SCB厚度定量测量方案，包括以下步骤：在小鼠中建立膝关节OA模型、制备组织切片和组织学图像、使用ImageJ软件对骨关节炎软骨下骨进行定量测量，以及通过统计分析验证该方案的敏感性和可重复性。
尽管本实验方案的总体技术遵循 ImageJ 软件的操作说明，但我们已补充了详细的分步技术内容，以便新用户更容易理解和验证其可重复性。BoneJ 程序是 ImageJ 软件的一个插件，适用于测量黑白二维图像，但在排除骨髓区域以计算骶骨板（SCB）总面积时效果...

骨关节炎（OA）是最常见的关节炎类型，其放射学特征表现为由于关节软骨丢失、骨赘形成以及软骨下骨（SCB）硬化所导致的关节间隙变窄1,2。尽管关节周围骨组织在OA病因学中的作用尚未完全明确，但通常认为骨赘形成和软骨下骨硬化是疾病进程的结果而非致病因素；然而，关节周围骨结构/形态及生物学特性的改变可能参与了OA的发生与发展3,4。建立一种准确且易于执行的OA分级系统，包括对软骨下骨的测量，对于不同研究实验室之间的比较研究以及评估旨在预防或减缓OA进展的治疗药物疗效至关重要。
软骨下骨（SCB）由一层薄的穹顶状骨板和其下方的松质骨层构成。SCB骨板即为皮质骨板，位于钙化软骨下方并与之平行。动脉和静脉的小分支以及神经穿过SCB骨板中的通道，在钙化软骨与松质骨之间进行沟通。软骨下松质骨含有血管、感觉神经和骨髓，比SCB骨板更具孔隙性且代谢更为活跃。因此，SCB具有缓冲震荡和支持作用，同时在正常关节中对软骨的营养供应和代谢也具有重要意义5,6,7,8。
在组织学中，软骨下骨（SCB）增厚和在放射学中的硬化是骨关节炎（OA）的主要特征，也是OA病理生理学研究的关键领域。测量SCB增厚是评估OA严重程度的组织学方法中的重要组成部分。既往已有报道采用数字显微放射技术测量啮齿类动物SCB的矿化密度9，以及基于显微计算机断层扫描（micro-CT）对OA啮齿类动物模型中SCB进行定量测量的方法10,11,12,13，这些技术加深了我们对SCB结构及其在OA病理生理过程中作用的理解。此外，已有研究利用配备专用且昂贵的骨组织形态计量学软件的复杂计算机系统，通过组织学切片对SCB面积和厚度进行量化14。然而，目前基于视觉估计的半定量OA分级系统（包括SCB增厚分级）仍比micro-CT更为广泛使用，因为这些分级系统操作简便，尤其适用于大量组织学图像的筛查。但大多数现有的OA分级系统主要关注软骨的改变15,16,17。一种广泛使用的骨关节炎SCB厚度分级方法将SCB增厚分为轻度、中度和重度，但该方法在很大程度上依赖主观判断，其可靠性尚未得到充分验证15。目前尚缺乏完善或标准化的、可可靠执行的骨关节炎SCB厚度测量操作步骤方案。
本研究旨在建立一种可重复、灵敏且易于操作的定量测量骨关节炎（OA）小鼠模型中软骨下骨（SCB）厚度的实验方案。通过严格的测量测试和统计学分析，我们证实了这种基于ImageJ软件辅助的定量测量方法能够对正常和骨关节炎膝关节中的SCB厚度进行量化。新建立的方案具有良好的可重复性，并且对轻微的SCB改变比广泛使用的视觉评分系统更为敏感。该方法可用于早期骨关节炎SCB变化的检测以及相关干预效果的评估 体内 OA 治疗疗效与 OA 软骨分级相结合的评估

<table><tbody><tr><td>番红O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>快绿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS216</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4382</td><td></td></tr><tr><td>插图绘制者</td><td>Adobe</td><td>不适用</td><td></td></tr></tbody></table>

软件辅助的骨关节炎软骨下骨厚度定量测量

Software-Assisted Quantitative Measurement of Osteoarthritic Subchondral Bone Thickness

软骨下骨增厚和硬化是骨关节炎（OA）在动物模型和人类中的主要特征。目前，组织学上软骨下骨增厚的严重程度主要依赖于基于半定量评分系统的视觉估测。本文介绍了一种可重复且易于操作的实验方案，用于定量测量内侧半月板失稳（DMM）诱导的小鼠膝关节OA模型中的软骨下骨厚度。该方案利用ImageJ软件，在定义股骨内侧髁和胫骨内侧平台这一DMM诱导膝关节OA中常见软骨下骨增厚的感兴趣区域后，对组织学图像上的软骨下骨厚度进行量化分析。以假手术组小鼠膝关节的组织学图像作为对照。统计学分析表明，新建立的定量软骨下骨测量系统具有高度可重复性，且观察者内和观察者间的变异率较低。结果提示，与广泛使用的视觉评分系统相比，该新方案对轻微或轻度的软骨下骨增厚更为敏感。本方案适用于检测早期及进展期骨关节炎相关的软骨下骨改变，并可用于评估 体内 OA 治疗疗效与 OA 软骨分级相结合的评估

目测估算法与ImageJ辅助定量测量的可重复性比较： 
对24个膝关节/动物每个膝关节的中段切面中定义的48个感兴趣区域（ROI）（24个内侧股骨髁，MFC，和24个内侧胫骨平台，MTP）进行评分，由三位独立操作者采用文献中已报道的0-3级目视评分系统15,23进行，其中0 = 正常（无软骨下骨增厚），1 = 轻度，2 = 中度，3 = 重度软骨下骨增厚。这些图像选自DMM或假手术后三个不同的术后时间点：2周、8周和16周。通常，接受DMM手术的小鼠在术后2周时目视评分为0分，8周时为1-2分，16周时为2-3分。随后，由另外三位独立观察者使用ImageJ软件对这些组织学图像的软骨下骨厚度进行定量测量，以验证新评分方案的可重复性和敏感性。用于目测评分或定量测量的代表性组织学图像（含或不含MFC和MTP区域的ROI轮廓）见图2，其中所分析的图像分为三组：假手术膝关节（目测评分0分）、DMM膝关节（目测评分0分）和DMM膝关节...

本方法学文章介绍了一种软件辅助的定量测量方案，用于量化小鼠骨关节炎膝关节及作为对照的正常膝关节中组织学上的软骨下骨厚度。该方案对细微增厚具有高度敏感性，适用于检测早期骨关节炎相关的软骨下骨改变。

软骨下骨增厚和硬化是骨关节炎（OA）的主要特征，无论是在动物模型还是在人类中均如此。目前，……的严重程度

软骨下骨增厚，即硬化，是骨关节炎的标志性特征之一，在动物模型和人类中均可见。目前，组织学上软骨下骨增厚的严重程度主要依赖于基于半定量分级系统的视觉估测。本研究旨在建立一种可重复且易于操作的定量测量方法，用于评估通过内侧半月板失稳诱导的小鼠膝骨关节炎模型中软骨下骨的厚度。我们通过手术显微镜下在无菌条件下对内侧半月板进行手术性失稳，建立了小鼠膝骨关节炎模型。小鼠膝关节的组织学处理包括组织固定、脱钙、修块、处理、包埋、切片和染色，随后进行显微成像。屏幕上的图像显示小鼠膝骨关节炎存在关节软骨损伤、骨赘形成以及软骨下骨增厚。使用 ImageJ 软件对骨关节炎软骨下骨进行定量测量。从 imagej.nih.gov/ij 下载 ImageJ。打开 ImageJ，点击“文件”选项卡，然后选择“打开”以打开组织学图像。找到文件目录地址，选择图片文件，然后点击“打开”。使用直线工具绘制一个长度单位，即微米，然后点击“分析”，再选择“设置比例尺”。设置已知距离和像素纵横比为1，然后点击“确定”。ImageJ 可将像素长度转换为单位长度，即微米。将测量参数设置为面积。点击“分析”然后选择“设置测量”，在新窗口中勾选“面积”和“限定于阈值”选项。此步骤用于设置 ImageJ 测量选定阈值范围内的面积参数。如X光片所示，将软骨下骨的感兴趣区域定义为包含软骨下皮质骨板及其下方邻近皮质骨板的一部分松质骨。在图像主窗口中使用选择工具勾画出软骨下骨总面积的轮廓。选择工具可为系统设定阈值，选定阈值后可限制后续测量范围。单击“分析”，然后选择“测量”。将打开一个显示面积测量结果的窗口。单击“编辑”，然后选择“清除外部”，以排除总软骨下骨区域以外的面积。单击“清除外部”选项后，仅显示总的软骨下骨区域。单击“图像”，然后选择“调整”，再选择“颜色阈值”，以打开阈值颜色窗口。在阈值颜色窗口底部单击“原始”，可将图像恢复至原始状态。使用选择工具在骨质区域绘制一个小方框。点击窗口底部的“采样选项”以定义骨质区域。选定的骨质区域将变为红色。在阈值颜色窗口底部点击“选择”以创建面积测量阈值。在 ImageJ 主菜单中点击“分析”，然后选择“测量”。骨组织面积的测量结果将显示在结果窗口中。保存软骨下骨总面积和骨质面积的数据。通过皮尔逊相关系数分析确定观察者间和观察者内变异度及可重复性。采用学生t检验或单因素方差分析（ANOVA）确定研究组间差异的显著性，随后进行事后检验。该图包含上部和下部两个部分。上部显示假手术组和DMM组的组织学图像显微照片，用于基于视觉评估的软骨下骨分级。下部显示假手术组和DMM组的组织学图像显微照片，用于ImageJ辅助的定量软骨下骨测量。使用 Adobe Illustrator 绘制的黄色虚线框定义了感兴趣的全部软骨下骨区域。框内的骨组织区域以橙色突出显示。可使用 ImageJ 软件对股骨内侧髁和胫骨内侧平台处明显的软骨下骨增厚进行定量分析。本图中，观察者间变异性的检测结果表明，在内侧胫骨平台和内侧股骨髁感兴趣区域，两次软骨下骨厚度测量值在不同观察者之间均具有高度可重复性。本图中，观察者内变异性检测结果表明，在内侧胫骨平台和内侧股骨髁感兴趣区域内，同一观察者对软骨下骨厚度进行的第一次与第二次测量之间亦具有高度可重复性。表1展示了软骨下骨厚度的视觉分级评估与ImageJ辅助定量测量在可重复性方面的比较分析结果。相关系数检验表明，定量测量的可重复性相对高于视觉分级法。该图显示了对内侧股骨髁和内侧胫骨平台软骨下骨厚度的视觉分级与ImageJ辅助定量测量的比较敏感性分析。用于视觉估计分级的组织学图像被分为三组。三位观察者对视觉评分为零的DMM图像测得的定量软骨下骨厚度值均显著高于视觉评分为零的假手术组图像，表明定量测量对轻度软骨下骨增厚的敏感性高于视觉评分。新建立的骨关节炎软骨下骨厚度定量测量方案，相较于广泛使用的视觉评分系统，对轻度软骨下骨变化具有更高的敏感性。该方案可用于检测早期骨关节炎相关的软骨下骨改变，并可与骨关节炎软骨评分联合用于评估骨关节炎治疗在体内的疗效。

software-assisted-quantitative-measurement-osteoarthritic-subchondral

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

软件辅助骨关节炎软骨下骨厚度的定量测量

本研究旨在报道一种利用微骨折技术结合纯化脂肪来源干细胞进行距骨软骨损伤关节镜治疗的操作方案。...

自体微骨折并纯化脂肪组织用于踝关节镜下距骨骨软骨损伤的治疗

关节镜手术中的探查通常用于评估软组织的状况，但这种方法一直具有主观性和定性特点。本报告介绍了一种探查装置，可在关节镜手术期间利用三轴力传感器对软组织的阻力进行定量测量。...

一种用于关节镜手术中定量测量软组织力学特性的探针装置

本方案建立了一种严格且可重复的方法，用于量化伴随骨关节炎发生的关节形态学变化。该方案的应用在监测骨关节炎疾病进展和评估治疗干预效果方面具有重要价值。...

标准化外科小鼠模型中骨关节炎的组织形态计量学评估

我们介绍一种利用原子力显微镜（AFM）在细胞水平上研究关节软骨早期骨关节炎变化的方法。...

原子力显微镜在早期骨关节炎检测中的应用

本实验方案描述了在切断小鼠内侧半月板胫骨韧带以使膝关节失稳后，对关节软骨表面进行可控的微刃划伤操作。该动物模型可诱导骨关节炎（OA）的加速发展，适用于研究骨赘形成、骨硬化以及早期疼痛等病理过程。...

内侧半月板失稳与软骨划痕小鼠加速性骨关节炎模型

我们提出了一种逐步识别和解决原子力显微镜微压痕实验中最常见问题的方法。我们以不同程度骨关节炎导致退变的原代人关节软骨组织为模型，示例说明实验中出现的各类问题。...

解决基于原子力显微镜的人类关节软骨离体组织微压痕实验中的实际问题

骨侵蚀是类风湿关节炎的重要病理特征。本研究的目的是介绍一种培训工具，旨在为用户提供指导，帮助其在高分辨率外周定量计算机断层扫描图像上识别病理性皮质断裂，以进行侵蚀分析。...

使用高分辨率外周定量计算机断层扫描识别类风湿关节炎中腕掌指关节的骨侵蚀

本文详细介绍了双向轴向传输（BDAT）超声设备的测量方案，并在一项可重复性研究中进行了测试，共纳入14名健康受试者和3名操作人员。以组内相关系数（ICC）评估的可靠性在四个关注参数上均表现良好至优异。...

使用超声导波评估皮质骨：一项健康人群中的可重复性研究

自动化关节间隙检测工作流程的开发实现了对野生型小鼠后肢足部骨骼的高通量分割，准确率超过&gt;98%。该方法可灵活应用于前肢足部以及患有炎性侵蚀性关节炎的足部，但在这些情况下的性能有所下降，未来研究需利用公开数据进一步优化。...

自动化关节间隙检测可提高骨分割的准确性

我们提出了一种在多个层次水平上评估骨再生的实验方案。该多模态方法能够实现跨不同长度尺度的结构分析，有效解决了样本制备中的挑战，并为评价生物材料促进骨再生的效果提供了可靠的分析流程。...

评估骨再生与支架性能的多模态方法

了解使用ImageJ软件定量测量小鼠膝骨关节炎软骨下骨厚度的方法。该方案通过内侧半月板失稳手术建立模型，结合组织学处理和显微成像，实现对早期骨关节炎变化的敏感检测。

软件辅助的骨关节炎软骨下骨厚度定量测量

探索更多视频