软件辅助的骨关节炎软骨下骨厚度定量测量

软骨下骨增厚，即硬化，是骨关节炎的标志性特征之一，在动物模型和人类中均可见。目前，组织学上软骨下骨增厚的严重程度主要依赖于基于半定量分级系统的视觉估测。本研究旨在建立一种可重复且易于操作的定量测量方法，用于评估通过内侧半月板失稳诱导的小鼠膝骨关节炎模型中软骨下骨的厚度。

我们通过手术显微镜下在无菌条件下对内侧半月板进行手术性失稳，建立了小鼠膝骨关节炎模型。小鼠膝关节的组织学处理包括组织固定、脱钙、修块、处理、包埋、切片和染色，随后进行显微成像。屏幕上的图像显示小鼠膝骨关节炎存在关节软骨损伤、骨赘形成以及软骨下骨增厚。使用 ImageJ 软件对骨关节炎软骨下骨进行定量测量。

从 imagej.nih.gov/ij 下载 ImageJ。打开 ImageJ，点击“文件”选项卡，然后选择“打开”以打开组织学图像。

找到文件目录地址，选择图片文件，然后点击“打开”。使用直线工具绘制一个长度单位，即微米，然后点击“分析”，再选择“设置比例尺”。设置已知距离和像素纵横比为1，然后点击“确定”。ImageJ 可将像素长度转换为单位长度，即微米。

将测量参数设置为面积。点击“分析”然后选择“设置测量”，在新窗口中勾选“面积”和“限定于阈值”选项。此步骤用于设置 ImageJ 测量选定阈值范围内的面积参数。

如X光片所示，将软骨下骨的感兴趣区域定义为包含软骨下皮质骨板及其下方邻近皮质骨板的一部分松质骨。在图像主窗口中使用选择工具勾画出软骨下骨总面积的轮廓。选择工具可为系统设定阈值，选定阈值后可限制后续测量范围。

单击“分析”，然后选择“测量”。将打开一个显示面积测量结果的窗口。单击“编辑”，然后选择“清除外部”，以排除总软骨下骨区域以外的面积。

单击“清除外部”选项后，仅显示总的软骨下骨区域。单击“图像”，然后选择“调整”，再选择“颜色阈值”，以打开阈值颜色窗口。在阈值颜色窗口底部单击“原始”，可将图像恢复至原始状态。

使用选择工具在骨质区域绘制一个小方框。点击窗口底部的“采样选项”以定义骨质区域。选定的骨质区域将变为红色。

在阈值颜色窗口底部点击“选择”以创建面积测量阈值。在 ImageJ 主菜单中点击“分析”，然后选择“测量”。骨组织面积的测量结果将显示在结果窗口中。

保存软骨下骨总面积和骨质面积的数据。通过皮尔逊相关系数分析确定观察者间和观察者内变异度及可重复性。采用学生t检验或单因素方差分析（ANOVA）确定研究组间差异的显著性，随后进行事后检验。

该图包含上部和下部两个部分。上部显示假手术组和DMM组的组织学图像显微照片，用于基于视觉评估的软骨下骨分级。下部显示假手术组和DMM组的组织学图像显微照片，用于ImageJ辅助的定量软骨下骨测量。

使用 Adobe Illustrator 绘制的黄色虚线框定义了感兴趣的全部软骨下骨区域。框内的骨组织区域以橙色突出显示。可使用 ImageJ 软件对股骨内侧髁和胫骨内侧平台处明显的软骨下骨增厚进行定量分析。

本图中，观察者间变异性的检测结果表明，在内侧胫骨平台和内侧股骨髁感兴趣区域，两次软骨下骨厚度测量值在不同观察者之间均具有高度可重复性。本图中，观察者内变异性检测结果表明，在内侧胫骨平台和内侧股骨髁感兴趣区域内，同一观察者对软骨下骨厚度进行的第一次与第二次测量之间亦具有高度可重复性。表1展示了软骨下骨厚度的视觉分级评估与ImageJ辅助定量测量在可重复性方面的比较分析结果。

相关系数检验表明，定量测量的可重复性相对高于视觉分级法。该图显示了对内侧股骨髁和内侧胫骨平台软骨下骨厚度的视觉分级与ImageJ辅助定量测量的比较敏感性分析。用于视觉估计分级的组织学图像被分为三组。

三位观察者对视觉评分为零的DMM图像测得的定量软骨下骨厚度值均显著高于视觉评分为零的假手术组图像，表明定量测量对轻度软骨下骨增厚的敏感性高于视觉评分。新建立的骨关节炎软骨下骨厚度定量测量方案，相较于广泛使用的视觉评分系统，对轻度软骨下骨变化具有更高的敏感性。该方案可用于检测早期骨关节炎相关的软骨下骨改变，并可与骨关节炎软骨评分联合用于评估骨关节炎治疗在体内的疗效。