Name: EWS-FLI1凝聚物在DNA上组装的单分子成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学习使用DNA Curtains单分子成像技术观察EWS-FLI1转录因子在DNA上的相分离动态过程。该方法可实时可视化凝聚物形成，揭示DNA基序数量与EWS-FLI1凝聚物形成的关系，为尤文肉瘤研究提供新见解。

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本工作得到国家自然科学基金项目 No. 31670762（Z.Q.）的资助。

1. 脂质双层母液的制备
<ol>
	<li>用双蒸水（ddH2O）和99%乙醇冲洗玻璃小瓶，并在60 °C的干燥烘箱中干燥。</li>
	<li>通过将1 g 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷胆碱（DOPC）、100 mg 聚乙二醇修饰脂质（18:1 的 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（PEG2000 DOPE））和25 mg 生物素化脂质（18:1 的 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-（帽生物素）（钠盐）（Biotinyl Cap DOPE））溶解于10 mL 氯仿中，配制脂质母液。</li>
	<li>按每瓶1 mL将脂质母液分装至洁净玻璃小瓶中，并于-20 °C保存。 
	注意：溶解后的脂质应保存在玻璃小瓶中，储存时瓶盖需用封口膜包裹。</li>
</ol>
2.&#160;脂质体溶液的制备
<ol>
	<li>用 ddH2O 和 99% 乙醇冲洗一个 2 mL 玻璃小瓶，并在 60 °C 的干燥烘箱中彻底干燥。</li>
	<li>用氯仿冲洗一个 250 µL 玻璃注射器，然后将 200 µL 脂质母液转移至干燥的玻璃小瓶中。</li>
	<li>使用氮气喷枪轻轻吹入 N2，同时将小瓶朝一个方向持续旋转。 
	注意：N2 有助于蒸发氯仿，残留的脂质将在玻璃小瓶内壁形成一层薄膜。初始时调节氮气流速非常轻微，当小瓶中出现白色薄膜后可逐渐增加气流；整个蒸发过程应在 5 分钟内完成。</li>
	<li>将玻璃小瓶转移至室温（RT）下的真空干燥烘箱中，干燥 16–24 小时，以彻底去除脂质中的氯仿。</li>
	<li>向玻璃小瓶中加入 2 mL 新鲜脂质缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 7.5）和 100 mM NaCl），在室温下溶解脂质 2 小时。期间多次涡旋混匀，然后转移至一个 5 mL 聚丙烯培养管中。</li>
	<li>在冰上使用微尖超声探头对脂质溶液进行超声处理，以形成小单层囊泡，设置如下：6 秒开启、12 秒关闭（20% 振幅），重复 6 个循环；然后 6 秒开启、6 秒关闭（30% 振幅），重复 3 个循环；最后 10 秒开启（40% 振幅）。 
	注意：超声过程中温度升高可能导致泡沫破裂并破坏脂质体。因此，需定期检查泡沫状态和温度，并频繁补充冰块。</li>
	<li>通过 0.22 µm 尼龙注射滤器过滤脂质体溶液，分装后于 4 °C 保存。 
	注意：由于储存时间延长会导致其流动性下降，脂质体必须在 2–3 个月内使用，或在使用前新鲜制备。</li>
</ol>
3. Lambda DNA 的序列克隆与生物素标记
<ol>
	<li>将结合基序插入Lambda DNA
	<ol>
		<li>用NheI和XhoI酶切含有结合基序的目标片段和Lambda DNA。使用T4连接酶在室温下过夜连接目标片段与Lambda DNA。</li>
		<li>在无抗生素的LB培养基中培养大肠杆菌（E.coli）VCS257细胞，直至OD600达到0.6。将细菌储存于4 °C以备后续使用。</li>
		<li>将连接反应液在65 °C加热20分钟，以使T4连接酶失活。</li>
		<li>解冻Lambda噬菌体提取物，用平头枪头轻轻将其与步骤3.1.4中的连接产物混合，并在室温下孵育2小时。</li>
		<li>向步骤3.1.4的包装混合物中加入500 µL SM缓冲液（50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、100 mM NaCl和8 mM MgCl2，经0.22 μm滤膜过滤）和20 µL氯仿，充分混匀后离心。 
		注：包装提取物的活性可在4 °C长期保持。</li>
		<li>将10 µL包装提取物、90 µL SM缓冲液&#160;和100 µL VCS257细胞（来自步骤3.1.2）混合配制反应体系，在37 °C孵育15分钟。 
		注：包装溶液的浓度取决于次日噬菌斑的密度；可根据需要进行稀释或添加。</li>
		<li>取约5 mL熔化的顶层琼脂（22 g/L NZCYM培养基含15 g/L琼脂）置于15 mL离心管中。当顶层琼脂冷却至约42 °C时，用平头枪头缓慢加入反应混合物（来自步骤3.1.6），并将液体倾注至无抗生素的LB琼脂平板上。将平板置于37 °C培养箱中过夜培养。</li>
		<li>通过PCR确认顶层琼脂平板上透明噬菌斑中的阳性克隆。用枪头将阳性噬菌斑转移至新的顶层琼脂平板，并在37 °C培养箱中过夜培养。</li>
		<li>向400 µL含有10 mM MgCl2和10 mM CaCl2的缓冲液中加入400 µL VCS257细胞，接种一个噬菌斑至该细胞混合液中，并在37 °C摇床中以250 rpm振荡培养15分钟。</li>
		<li>将含有噬菌斑的800 µL悬浮液加入2 L锥形瓶中的200 mL NZCYM培养基中，在37 °C摇床中以125 rpm振荡培养。</li>
		<li>培养约4小时后测定细菌悬浮液的OD600。需注意OD600值先上升，随后下降至约0.2的低谷。当OD600值即将再次上升时停止培养，加入500 μL氯仿，并以80 rpm继续振荡5分钟。 
		注：OD600在低谷后的上升过程非常迅速；因此当OD600降至0.3时必须更频繁地监测，以避免VCS257细胞在培养物中过度生长。</li>
		<li>将噬菌体培养物转移至500 mL瓶中，加入11.7 g NaCl并摇动瓶子。将瓶子置于冰上孵育10分钟。</li>
		<li>将悬浮液等量分装至四个50 mL离心管中，在4 °C条件下以12,000 x&#160;g离心10分钟。 
		注：本节3.1中所有离心步骤均需在4 °C下进行。</li>
		<li>将上清液转移至四个新的50 mL离心管中，以相同转速再次离心5分钟。</li>
		<li>收集上清液，加入10% (w/v) PEG8000粉末，在4 °C旋转孵育30分钟。</li>
		<li>将步骤3.1.15所得悬浮液在12,000 x&#160;g离心15分钟，获得噬菌体沉淀。</li>
		<li>将沉淀重悬于四个离心管中各1 mL噬菌体稀释缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、100 mM NaCl和10 mM MgCl2），然后将全部4 mL混合液转移至一个50 mL离心管中。</li>
		<li>加入RNase A（终浓度20 µg/mL）和DNase I（终浓度5 µg/mL），在37 °C孵育30分钟以降解过量的核酸。</li>
		<li>向管中加入4.5 mL 300 mM Tris-HCl (pH 7.5)、2.76 mL 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）、1.67 mL 10%十二烷基硫酸钠（SDS）和75 µL蛋白酶K（10 mg/mL），在65 °C孵育10分钟。</li>
		<li>加入4.5 mL预冷的3 M乙酸钾，冰上孵育10分钟。</li>
		<li>在8,000 x&#160;g离心10分钟，再将上清液在10,000 x&#160;g额外离心5分钟。</li>
		<li>向上清液（来自步骤3.1.21）中加入等体积70%异丙醇，充分混匀后在室温孵育2分钟，随后在8,000 x&#160;g离心10分钟。弃去异丙醇后再次离心5分钟。 
		注：第一次10分钟离心前DNA沉淀呈弥散状；第二次5分钟离心后沉淀将集中于管底。</li>
		<li>用2–3 mL 70%乙醇洗涤沉淀，再次离心1分钟。在4 °C干燥沉淀2小时，然后在室温下用500 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 8.0)和1 mM EDTA）过夜重悬DNA。</li>
		<li>将DNA转移至1.5 mL离心管中，在18,000 x&#160;g离心3分钟。将DNA转移至新的1.5 mL离心管中。分装纯化的Lambda DNA并储存于-20 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物素标记的Lambda DNA制备
	<ol>
		<li>将50 µL含克隆基序的纯化Lambda DNA在65 °C加热10分钟使其解链。 
		注：由于Lambda DNA长约48 kbp，移液前必须加热以避免DNA断裂。</li>
		<li>将50 µL Lambda DNA、1 µL生物素引物（5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3'）（100 µM）和54 µL ddH2O混合。在65 °C共孵育5分钟后置于实验台冷却至室温。</li>
		<li>加入12 µL 10× T4连接酶缓冲液和3 µL T4连接酶，在室温孵育数小时或过夜。</li>
		<li>向连接产物中加入等体积酚-氯仿（1:1）混合液，立即充分混匀后在室温下以12,000 x&#160;g离心2分钟。</li>
		<li>小心将含有DNA的上层水相转移至新离心管中，加入等体积氯仿，充分混匀后再次在12,000 x&#160;g离心2分钟。</li>
		<li>将上层水相转移至新离心管中，加入等体积异丙醇和10%体积的3 M乙酸钠，在室温孵育2分钟。随后在12,000 x&#160;g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀，然后在12,000 x&#160;g离心5分钟。</li>
		<li>去除75%乙醇，在室温下空气干燥DNA 10分钟，用120 µL TE缓冲液溶解DNA。</li>
		<li>向步骤3.2.8所得溶液120 µL中加入60 µL缓冲液A（30% (w/v) PEG8000和30 mM MgCl2），在4 °C旋转孵育20–24小时。</li>
		<li>在18,000 g离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用180 µL预冷的75%乙醇洗涤沉淀，并重复步骤3.2.10。</li>
		<li>在室温下干燥沉淀，用100 µL TE150缓冲液溶解DNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 纳米制造的之字形屏障
<ol>
	<li>将载玻片置于丙酮中，超声处理20分钟，随后转移至含有1 M NaOH的新玻璃容器中，继续超声处理20分钟。将90 mL H2SO4 与30 mL H2O2 混合，将载玻片浸入该混合液中30分钟。用丙酮和异丙醇冲洗载玻片，并用N2 吹干。 
	注：H2SO4 与H2O2 的混合为放热过程，操作时需采取充分的安全防护措施。</li>
	<li>依次在清洁后的载玻片上涂覆25 kDa聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、49.5 kDa PMMA，以及最外层的导电保护涂层。采用电子束光刻技术制备锯齿状屏障（图1A）。</li>
	<li>用ddH2O冲洗载玻片以去除导电保护涂层，并用N2 吹干。</li>
	<li>使用磁控溅射仪沉积一层30 nm厚的铬（Cr）膜，并用丙酮去除残留的PMMA层。 
	&#8203;注：一个流动池可重复用于20次以上的DNA Curtains实验。如需重复使用流动池，需依次用乙醇、洗涤剂和NaOH清洗。</li>
</ol>
5. EWS-FLI1 蛋白的纯化
注意：在25个Lambda DNA上观察500 nM EWS-FLI1&#215; GGAA基序是将DNA帘技术应用于相分离凝聚体形成研究的一个良好示例。EWS-FLI1是一种融合蛋白，由EWSR1的N端（1-265）与FLI1的C端（220-453）融合而成。为便于可视化，将mCherry标签连接至EWS-FLI1融合蛋白的N端。
<ol>
	<li>将 EWS-FLI1 基因克隆至重建的 pRSF 载体或其他合适的原核表达载体中。</li>
	<li>将编码 7x His-mCherry-EWSFLI1 的质粒转化至 E.coli BL21(DE3) 菌株中；在 37 °C 下于 5 mL LB 培养基中过夜培养单菌落。转入 2 L LB 培养基后，当 OD600 值达到 0.6–0.8 时，加入 0.5 mM IPTG，并在 18 °C 下摇床培养 16–18 小时。</li>
	<li>离心培养物以去除上清液，并用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5；1 M KCl；1 M 尿素；10 mM 咪唑；1.5 mM 巯基乙醇（β-ME）；5% 甘油）重悬细胞。</li>
	<li>超声处理后，在约 30 分钟内于 18000 ×g 离心，将上清液上样至已用 5 倍体积裂解缓冲液平衡的 Ni-NTA 树脂，随后用 10 倍体积的洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 7.5），1 M KCl，1 M 尿素，40 mM 咪唑，1.5 mM β-ME，5% 甘油）洗涤树脂。</li>
	<li>用 15 mL 洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 7.5），1 M KCl，1 M 尿素，500 mM 咪唑，1.5 mM β-ME，5% 甘油）洗脱结合的蛋白，并将洗脱液浓缩至约 500 µL。</li>
	<li>将浓缩后的蛋白溶液上样至凝胶过滤柱，并通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析产物。迅速将纯化后的蛋白在液氮中冷冻，并保存于 -80 °C。</li>
</ol>
6. DNA 幕帘流动池的制备
<ol>
	<li>为 DNA Curtains 实验准备带有之字形纳米制造屏障的流动池，并确定流动方向。为此，需将输入和输出管路按正确方向连接。</li>
	<li>使用两个3 mL注射器，以2.5 mL脂质缓冲液冲洗流动池。确保流动池内无气泡。</li>
	<li>将注射器从输出端取下，注入1 mL脂质体溶液（40 &#181;来自第2节的脂质体储备液 L 和 960 &#181;用脂质缓冲液冲洗三次，每次注入后孵育5分钟。</li>
	<li>在修复步骤中，用2.5 mL脂质缓冲液缓慢清洗流动池，并在室温下孵育30分钟。 
	注意：如有必要，可延长修复时间；若出现气泡，需重复步骤5.3和5.4进行二次修复以去除气泡。</li>
	<li>制备 30 mL 牛血清白蛋白（BSA）缓冲液（40 mM Tris-HCl（pH 7.5），2 mM MgCl₂，150 mM NaCl，1 mM DTT，0.1 mg/mL BSA，0.1% Tween-20）2，1 mM 二硫苏糖醇，以及用于表面钝化的 0.5 mg/mL BSA）。孵育 30 分钟后，从输出端用 2.5 mL BSA 缓冲液冲洗流路池。 
	注意：BSA 储液为 20 mg/mL 溶液，保存于 4 °C &#176;C，必须在 1-2 周内使用。缓冲液中的 BSA 浓度可根据表面状况进行调整。</li>
	<li>注入 800 &#181;L 链霉亲和素缓冲液（10 &#181;1 mg/mL 链霉亲和素储备液的 L，790 &#181;将BSA缓冲液分两步从入口端加入流动池，每步加入后孵育10分钟。 
	注意：由于链霉亲和素具有多价性，可通过连接生物素化脂质与生物素化DNA，将DNA锚定在脂质上。</li>
	<li>用2.5 mL BSA缓冲液冲洗流路池，以去除所有游离的链霉亲和素分子。</li>
	<li>使用BSA缓冲液将第3节中含克隆序列的生物素标记Lambda DNA稀释（2.5 &#181;L 的 DNA 和 998 &#181;BSA 缓冲液中。以 5 分钟间隔缓慢注入 λ DNA，重复 4 次。</li>
	<li>注射过程中打开显微镜和科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）系统。用 10 mL 去离子水冲洗管路2O. 用清水、2% 液体比色皿清洁剂和 99% 乙醇冲洗棱镜和管路连接器。在 BSA 缓冲液中加入 KCl 和双链 DNA 染料，配制成终浓度分别为 150 mM 和 0.5 nM 的成像缓冲液，并用 30 mL 注射器吸取至少 20 mL 该成像缓冲液。</li>
	<li>将流动池安装到显微镜载物台上，并将其连接至微流控系统。</li>
	<li>以0.03 mL/min的流速冲洗DNA分子至屏障处，持续10分钟；停止流动，孵育30分钟；随后关闭流体系统，使DNA在表面侧向扩散。 
	&#8203;注意：此30分钟孵育的目的是通过简单扩散使DNA分子在屏障前方更均匀地分布，因为DNA分子 tends to accumulate 在靠近输入端的屏障一侧，即它们被冲入的位置。孵育时间可根据需要进行调整。</li>
</ol>
7. DNA 幕布上 EWS-FLI1 凝聚体形成的成像
<ol>
	<li>打开成像软件，在明场下找到并标记 3 × 3 锯齿状图案的位置。</li>
	<li>以 0.2 mL/min 的流速通入双链 DNA 染料，对 DNA 进行染色，持续 10 分钟。</li>
	<li>在离心管中用成像缓冲液将 mCherry-EWS-FLI1 稀释至 100 nM 浓度，总体积为 100 µL。</li>
	<li>使用 100 µL 玻璃注射器通过阀门加载蛋白样品，并将流速调整为 0.4 mL/min。</li>
	<li>开启 488 nm 激光器，对每个区域进行预扫描以检查 DNA 分布状态；选择 DNA 分子分布均匀的区域。将 488 nm 激光器的功率设为 10%，561 nm 激光器的功率设为 20%。使用功率计测量棱镜附近的实际激光功率：488 nm 激光器为 4.5 mW，561 nm 激光器为 16.0 mW。</li>
	<li>图像采集
	<ol>
		<li>同时使用 488 nm 和 561 nm 激光器，以 2 秒间隔开始采集图像。</li>
		<li>60 秒后，将阀门从手动模式切换至注射模式，使成像缓冲液将蛋白样品冲洗入流动池。 
		&#8203;注意：此过程约需 30 秒，一旦 EWS-FLI1 蛋白进入流动池，视野中将立即出现 mCherry 信号。</li>
		<li>为去除游离的 EWS-FLI1，仅开启 561 nm 激光器，用成像缓冲液持续清洗流动池 5 分钟。停止流动，在 37 °C 下孵育 10 分钟。</li>
		<li>以 0.4 mL/min 的流速通入缓冲液使 DNA 伸展，并在不同帧之间以 2 秒间隔采集图像，以获得 EWS-FLI1 生物分子凝聚体形成的高通量数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. mCherry-EWS-FLI1 强度分析
<ol>
	<li>将数据作为图像序列导入 ImageJ 软件，选取 25× GGAA 位点处的点状信号，范围为 8×8 像素的正方形区域，并以 .tif 格式保存图像。</li>
	<li>通过计算 8×8 像素正方形区域内所有像素强度的总和来确定信号强度（包含整个点状信号），并通过减去邻近相同大小区域的背景强度来扣除背景。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

由于单分子方法对反应体系的组分极为敏感，在DNA Curtains实验过程中，必须投入额外努力以确保所有材料和溶液的质量，特别是第1和第2节中制备的脂质以及第5节中使用的缓冲液。缓冲液必须使用更高纯度的试剂配制，并且必须为单分子实验新鲜配制。
当将500 nM的mCherry标记的EWS-FLI1冲洗入样品室时，在含有25× GGAA序列的Lambda DNA上出现了多个品红色斑点。请注意，即使在用空白缓冲液清洗10分钟后，整个DNA上仍存在连续的非特异性品红色信号分布（图1B，C）。有趣的是，在无缓冲液流动条件下孵育10分钟后，EWS-FLI1分子在DNA上发生重排，并聚集形成数个斑点（图1D，E）。其中一个斑点形成于克隆的25× GGAA位点处，而其余所有斑点均形成于含有高密度连续GGAA基序的区域。该现象强烈表明，无流动孵育过程可使EWS-FLI1分子更快速地在DNA上搜寻靶位点并组装成复合...

转录调控是活细胞中实现基因精确表达的关键步骤。染色体修饰、转录因子（TFs）和非编码RNA等多种因素参与了这一复杂过程。1,2,3在这些因素中，转录因子通过识别并结合被称为启动子或增强子的特定DNA序列，进而招募其他功能蛋白以激活或抑制转录，从而赋予转录调控以特异性。4,5,6,7这些转录因子如何在人类基因组中搜寻其靶位点，并与包裹在组蛋白及非组蛋白DNA结合蛋白上的DNA相互作用，几十年来一直困扰着科学家。在过去几年中，已建立了多个经典的转录因子靶向搜寻机制模型，用以描述它们如何 &#34;载玻片&#34; &#34;啤酒花&#34; &#34;跳跃&#34; 或 &#34;节段间转移&#34; 沿着DNA链8,9,10,11这些模型主要关注单个转录因子分子在DNA上的搜索行为。然而，最近的研究表明，一些转录因子在细胞核内可单独或与中介复合物共同发生液-液相分离（LLPS）。12转录因子形成的液滴与启动子或增强子区域相关联，凸显了生物分子凝聚体形成在转录及三维基因组中的作用13,14,15这些生物分子凝聚体与无膜区室相关联 体内 和 体外它们通过液-液相分离（LLPS）形成，其中模块化生物大分子和蛋白质的内在无序区域（IDRs）是介导多价相互作用的两个主要驱动力。16因此，转录因子不仅在这些缩合物中搜索DNA，还能在其中协同发挥作用。4,17,18迄今为止，这些转录缩合物在DNA上的生物物理特性仍不明确。
因此，本研究旨在应用一种单分子方法——DNA幕布技术（DNA Curtains），直接观察转录因子（TFs）在DNA上形成的转录凝聚体的形成过程及其动态行为。 体外DNA幕布，一种高通量 体外 用于研究蛋白质与DNA相互作用的成像平台已应用于DNA修复研究19,20,21，靶标搜索22，以及LLPS17,23,24DNA 幕帘的流动池表面涂覆有生物素化脂双层，用于钝化表面并允许生物分子在表面上扩散。纳米加工的之字形图案限制了 DNA 的移动。生物素化的 Lambda DNA 底物可沿屏障边缘排列，并通过定向缓冲液流拉伸。所有分子具有相同的起始和终止序列，从而可追踪蛋白质在 DNA 上的运动，并描述结合事件的位置分布25,26此外，DNA Curtains 技术与全内反射荧光显微镜（TIRFM）相结合，有助于最大限度地降低背景噪声，并在单分子水平上检测信号。因此，DNA Curtains 可能成为研究转录凝聚体在DNA基序上形成动态过程的一种有前景的方法。本文描述了一个FUS/EWS/TAF15（FET）家族融合致癌蛋白EWS-FLI1的示例，该蛋白由染色体易位产生。实验所用Lambda DNA包含25× GGAA——即EWS-FLI1的结合序列27在DNA Curtains实验中，使用该DNA作为底物，以观察EWS-FLI1分子在DNA上发生液-液相分离（LLPS）的过程。本文详细讨论了实验方案及数据分析方法。

<table><tbody><tr><td>488 nm 半导体泵浦固体激光器</td><td>Coherent</td><td>OBIS488LS</td><td></td></tr><tr><td>561 nm 半导体泵浦固体激光器</td><td>Coherent</td><td>OBIS561LS</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Rhawn</td><td>R003215-50g</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的 DOPE</td><td>Avanti</td><td>870273P</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Amresco</td><td>1595C027</td><td></td></tr><tr><td>Coating Electra 92</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-PC 5090.02</td><td>导电保护涂层</td></tr><tr><td>牛脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Sigma</td><td>D5139-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>λ DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>λ 噬菌体包装提取物</td><td>Epicentre</td><td>MP5120</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>s3014</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Idex</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>尼康倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NZCYM 肉汤</td><td>Sigma</td><td>N3643-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-2000 DOPE</td><td>Avanti</td><td>880130P-1G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 200K, 乙基乳酸酯 4%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 649.04</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950K, 苯甲醚 2%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 672.02</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B 科学级 CMOS 相机</td><td>PHOTOMETRICS</td><td>Prime95B</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>石英玻璃载玻片</td><td>G.Finkenbeiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>六通进样阀</td><td>Idex</td><td>MXP9900-000</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>Thermo</td><td>S888</td><td>用 ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 稀释</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Pump11 Elite</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146V</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 碘化物 (491/509)</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td>用 DMSO 稀释</td></tr></tbody></table>

单分子成像观察ews-fli1凝聚体在dna上的组装

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

染色体易位产生的融合基因已在多种实体瘤或白血病中被发现。EWS-FLI1 属于 FUS/EWS/TAF15（FET）家族的融合癌蛋白，是尤文肉瘤中最常涉及的融合基因之一。这些 FET 家族融合蛋白通常在其 N 末端含有 FET 蛋白的低复杂性结构域（LCD），在 C 末端含有 DNA 结合结构域（DBD）。已证实 EWS-FLI1 可通过 LCD-LCD 和 LCD-DBD 相互作用，在其靶向结合位点形成生物分子凝聚体，这些凝聚体能够招募 RNA 聚合酶 II 以增强基因转录。然而，这些凝聚体如何在其结合位点组装仍不清楚。最近，一种单分子生物物理方法——DNA 幕帘技术（DNA Curtains）被用于可视化 EWS-FLI1 凝聚体的组装过程。本文讨论了应用 DNA 幕帘技术研究生物分子凝聚体在靶 DNA 上组装的详细实验方案及数据分析方法。

DNA Curtains 示意图如图所示 图1A, 图1B，以及 图1D含有25个连续GGAA重复的克隆目标序列位于 NORB1 尤因肉瘤中启动子的关键靶序列对于EWS-FLI1的招募至关重要28通过561 nm激光检测mCherry标记的EWS-FLI1信号来观察EWS-FLI1分子图1C 和 图1E）。在完成DNA Curtains实验的设置后， 体外 在DNA底物的25× GGAA位点处，EWS-FLI1生物分子凝聚物的形成可被直接可视化（图1B-E）。通过凝胶电泳迁移率实验，使用含25个GGAA重复序列和不含GGAA的DNA模...

本文介绍了利用单分子成像技术——DNA幕帘法，研究EWS-FLI1凝聚物在DNA上组装的生物物理机制。

单分子成像观察EWS-FLI1凝聚体在DNA上的组装

染色体易位产生的融合基因已在多种实体瘤或白血病中被发现。EWS-FLI1 属于 FUS/EWS/TAF15 家族……

我们提供一种单分子检测方法，用于观察转录因子在DNA上的相分离过程。该技术可实时呈现转录因子在DNA上组装形成液滴状凝聚体的动态过程。EWS-FL1 是尤文肉瘤发生中最常涉及的融合基因之一。本研究可揭示DNA基序数量与EWS-FL1凝聚体形成之间的关系，该关系与肿瘤细胞中基因转录的抑制相关，可能对预后具有参考价值。该方法可用于在体外研究任何转录凝聚物或复合物，例如 P53 和 MED1。为 DNA 幕实验准备带有锯齿状纳米结构障碍物的流动池时，应将输入和输出管路按正确方向连接。然后使用两个 3 毫升注射器，以 2.5 毫升脂质缓冲液冲洗流动池，确保流动池内无气泡存在。从出口处取下注射器，将一毫升脂质体溶液注入三次，每次注射之间间隔五分钟。进行修复时，用2.5毫升脂质缓冲液缓慢冲洗流动池，然后在室温下孵育30分钟。孵育期间，按照文本稿件中所述配制BSA缓冲液。然后，在愈合30分钟后，从出口端用2.5毫升BSA缓冲液冲洗流路池。接着，将800微升链霉亲和素缓冲液从入口端分两步注入流路池，每步后孵育10分钟。随后，用2.5毫升BSA缓冲液冲洗流路池，以去除所有游离的链霉亲和素分子。接下来，使用BSA缓冲液稀释带有克隆序列的生物素化Lambda DNA，并以五分钟间隔缓慢注射四次。注射过程中，启动科学级互补金属氧化物半导体系统中的显微镜。然后用10毫升双蒸水冲洗管路，并依次用水、2%液体比色皿清洁剂和99%乙醇清洗棱镜及管路连接器。接下来，用30毫升注射器吸取至少20毫升成像缓冲液。将流动池安装在显微镜载物台上，并连接至微流控系统。以0.03毫升/分钟的流速冲洗DNA分子至屏障处，持续10分钟。然后关闭微流控系统，在无流动条件下孵育30分钟，使DNA能够横向扩散。为了观察DNA帘上的EWS-FLI1凝聚体形成，打开成像软件，在明场下找到并标记九个锯齿状图案的位置。然后以每分钟0.2毫升的流速流动，用双链DNA染料对DNA染色10分钟。接着，将mCherry EWS-FLI1蛋白用成像缓冲液稀释至100纳摩尔浓度，总体积为100微升。随后，使用100微升玻璃注射器通过阀门加入蛋白样品，并将流速调整为每分钟0.4毫升。打开488纳米激光器后，预先扫描每个区域以检查DNA分布状态，并选择DNA分子分布均匀的区域。然后将488纳米激光器的激光功率设置为10%，561纳米激光器的激光功率设置为20%。使用功率计测量棱镜附近的实际激光功率。使用488纳米和561纳米激光器同时以每两秒一次的间隔开始采集图像。60秒后，将阀门从手动模式切换至注射模式，使成像缓冲液将蛋白质样品冲洗入流动池中。为了去除游离的EWS-FLI1，仅开启561纳米激光器，继续用成像缓冲液清洗流动池五分钟。然后停止流动，在37摄氏度下孵育10分钟。10分钟后，以0.4毫升/分钟的流速重新启动流动，使DNA延伸，并在不同帧之间以每2秒一次的间隔采集图像，以获得EWS-FLI1凝聚体形成的高通量数据。通过使用561纳米激光检测标记mCherry的EWS-FLI1信号来观察EWS-FLI1分子。可在体外直接观察到 EWS-FLI1 在 DNA 底物上 25 个 GGAA 重复序列位点处形成凝聚物的现象。通过分别使用含有和不含 25 个 GGAA 重复序列的 DNA 模板进行电泳迁移率变动实验，验证了 DNA 幕帘实验中所用 mCherry 标记 EWS-FLI1 的特异性。当 EWS-FLI1 浓度从 20 纳摩尔滴定至 500 纳摩尔时，EWS-FLI1 的荧光强度显著增强。当蛋白质饱和结合以覆盖GGAA重复序列时，FLI单个DNA结合结构域（DBD）的荧光强度变化可忽略不计，表明EWS-FLI1在DNA上形成了凝聚体。注射过程应非常缓慢且轻柔，以确保脂质体和DNA在流动池上均匀分布。进行分子筛层析（MSA）以确认纯化的转录因子在体外特异性结合靶序列非常重要。该技术可让人们探究凝聚相是否有助于转录因子对靶标的搜寻，及其对转录的影响。

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EWS-FLI1凝聚物在DNA上组装的单分子成像

我们提出了一种纳米光子学（量子点-荧光共振能量转移，QD-FRET）与微流控技术相结合的创新且强大的方法，用于研究聚电解质聚集体（polyplexes）的形成过程，该方法有望为未来基于核酸的治疗药物提供对聚集体更精确的控制，并实现均匀、可定制聚集体的合成。...

结合量子点-荧光共振能量转移与微流控技术实时监测DNA纳米复合物的自组装过程

本视频介绍了一种利用单分子成像技术，在特定基因位点上可视化融合蛋白凝聚体在DNA分子上组装的方法。这些凝聚体的形成源于LCD-LCD和LCD-DBD相互作用，从而能够招募RNA聚合酶II并增强基因转录。...

单分子成像可视化融合蛋白在DNA幕上凝聚体的组装

本文介绍了检测单个荧光标记的蛋白质分子与悬浮在两个光镊微球之间的单个DNA分子相互作用的仪器设备和方法。...

结合单分子操控与成像技术研究蛋白质-DNA相互作用

本研究介绍了一种利用单分子荧光共振能量转移（FRET）技术测量双链DNA成环动力学的详细实验方法。该方案还描述了如何提取称为J因子的成环概率密度。...

通过单分子FRET研究DNA成环

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。...

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。...

成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

通过微流控腔室研究可视化单分子生物化学过程时，使用玻璃筒体的气密性注射器、将管路稳定连接至流动池，以及在注射器与管路之间安装切换阀以消除气泡，可极大地方便实验操作。本方案描述了双光镊技术，可用于观察DNA的动态过程及分子间相互作用。...

使用双光镊与微流控技术进行单分子研究

本文介绍了几种常用的研究质膜受体激酶膜运输事件的方法。文稿中描述了详细的实验方案，包括植物材料准备、药物处理以及共聚焦成像设置。...

基于图像的方法研究气孔谱系细胞中的膜运输事件

许多内在无序蛋白已被证实参与形成高度动态的生物分子凝聚体，这种行为对多种细胞过程具有重要意义。本文介绍了一种基于单分子成像的方法，用于定量分析蛋白质在活细胞生物分子凝聚体中相互作用的动力学过程。...

生物分子凝聚体中蛋白质相互作用动力学的单分子测量

本文介绍了一种用于重建含核小体的DNA系链以进行单分子相关力与荧光显微镜检测的详细实验流程。此外，还描述了若干后续实验，可用于观察染色质相互作用蛋白的结合行为，并分析核小体物理性质的变化。...

原位核小体组装用于单分子关联力与荧光显微镜技术

本方案演示了通过单分子实验对CMG解旋酶解旋DNA的过程进行活体可视化观察。内容包括：（1）制备DNA底物，（2）纯化荧光标记的黑腹果蝇（Drosophila...

CMG解旋酶解旋DNA的单分子实时可视化观察

学习使用DNA Curtains单分子成像技术观察EWS-FLI1转录因子在DNA上的相分离动态过程。该方法可实时可视化凝聚物形成，揭示DNA基序数量与EWS-FLI1凝聚物形成的关系，为尤文肉瘤研究提供新见解。

单分子成像观察EWS-FLI1凝聚体在DNA上的组装

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