一种用于嗅觉环路组装延时成像研究的组织块培养系统 果蝇

本方案介绍了一种在单轴突水平上对发育中果蝇大脑的嗅觉环路组装过程进行活体成像的方法。通过解剖去除覆盖发育中大脑的组织，可从大脑内部获取高质量图像。该方法为揭示环路发育的细胞生物学基础提供了重要见解。

该方法也可轻松修改用于研究其他神经环路的发育。操作者需要一定时间才能在显微解剖中实现稳定的手部控制，更多的练习将有所帮助。

首先，准备用于在延时成像过程中移动外植体的培养皿：将厚度为0.5厘米的Sylgard铺在培养皿底部表面，并在室温下静置固化48小时。为准备用镊子固定外植体的微针，将多个微针粘附于胶带上，使尖端朝向同一侧对齐，然后用剪刀剪去约2毫米长的尖端部分。接着使用镊子将剪好的微针插入预先制备好的Sylgard培养皿的Sylgard层中。

使用毛刷收集白色蛹，这些蛹在1小时内形成蛹壳，并将其转移至新的小瓶中。将蛹置于37摄氏度的水浴中孵育40分钟，以诱导产生稀疏的随机类型嗅觉受体神经元克隆。热激后，将小瓶置于25摄氏度环境中30小时，使蛹在形成蛹壳后发育至30小时龄。

然后按照文稿中所述方法制备外植体培养基，并于4 °C保存。成像当天，在含有45 mL Schneider's Drosophila培养基的50 mL离心管中加入胎牛血清、人胰岛素储备液以及溶于乙醇的20-羟基蜕皮酮储备液。充分混匀后，将15 mL完全培养基转移至新的50 mL锥形管中，其余完全培养基于4 °C保存，可使用一周。

然后用石蜡膜封住装有完全培养基的试管开口，并通过无菌的5毫升移液枪头以每秒一个气泡的速度向液面下通入氧气泡，持续20至30分钟以氧合培养基。接下来，用70%乙醇对解剖皿表面以及预先准备好的Sylgard板进行表面灭菌，并使其干燥后备用。使用毛刷将30小时羽化后（APF）的蛹转移至滤纸上，以干燥蛹的外部表面，持续5分钟。

在玻璃载片上贴上双面胶带后，将干燥的蛹小心地背面向上粘附在胶带的粘性表面。用刷子轻轻按压蛹体，使腹面也牢固地粘附在胶带上，注意不要损伤蛹体。从蛹的侧面将镊子的一个尖端插入棕色蛹壳与蛹体之间，沿直线小心地将棕色蛹壳从侧面至蛹体后端逐步撬开。

用镊子打开褐色的蛹壳后，用镊子轻轻夹住蛹体，并将其转移至含有1毫升含氧完全培养基的解剖孔中。将蛹体浸入培养基中，使其沉入孔底。为从蛹体中分离出触角脑外植体，用一只手以镊子轻轻固定蛹体，另一只手使用显微剪从蛹体后侧开一个小孔，以释放蛹体内部的高压。

从孔处开始，沿腹侧中线剪至颈部，然后环绕颈部剪一圈，将头部与蛹体分离，并将蛹体放入另一个孔中。接着，剪开覆盖在脑背侧的透明角质层，暴露脑上方的脂肪体，注意保留视网膜和触角所附着的角质层；同样地，剪开脑腹侧的角质层。使用P10移液枪将培养基缓慢吹向头部背侧和腹侧的开口区域，轻轻冲洗掉覆盖在脑和触角上的脂肪体。

为了研究双侧 ORN 轴突之间或 ORN 轴突与 PN 树突投射之间的相互作用，可在特定发育阶段小心地将显微剪刀的刀片置于体壁与脑之间，切断目标触角神经。为将解剖得到的组织外植体转移至 Sylgard 培养板，需先在 Sylgard 表面滴加约 200 微升的充氧完全培养基。在将外植体从解剖孔转移至 Sylgard 板上的培养基液滴过程中，为防止其粘附在移液枪头内壁，可先用 200 微升移液枪头反复吹打取自解剖躯干的脂肪体，以使其包被枪头内表面。

用镊子将外植体固定在两个视叶的Sylgard层上，然后小心地将Sylgard板放置于成像台上，用胶带固定Sylgard板，并使用P1000移液器缓慢向Sylgard板中加入10毫升含氧完全培养基。嗅觉神经元轴突在羽化前18至36小时到达触角叶，随后在触角叶内导航，穿过中线并支配小球结构。在进行图像配准前，随着脑组织的发育，轴突表现出一定程度的侧向漂移；完成配准后，该漂移现象被校正。

通过神经毡标记物和钙黏蛋白的免疫染色揭示了所提取的嗅觉受体神经元轴突的肾小球身份。通过与内侧叶图谱进行比较，可确定每个肾小球的身份。在离体培养过程中，细菌生长通常会导致嗅觉环路发育停滞。

因此，成像前彻底灭菌培养皿和金属针，并保持成像室清洁与隔离非常重要。为了获得更高的时空分辨率，可使用更先进的显微镜——自适应光学晶格光片显微镜对这一外植体系统进行成像。尽管本文以工厂神经环路发育为例进行了展示，但该系统未来有望拓展应用于发育中的中枢脑内其他神经环路及发育过程的研究。