小鼠肺组织中固有和适应性免疫细胞鉴定的流式细胞术分析

由于肺部拥有非常复杂且独特的免疫系统，目前已开发并报道了多种用于鉴定肺部免疫细胞的设门策略。多种不同方法的存在使得不同实验室获得的结果难以相互比较。我们的设门策略提供了一种全面且可重复的方法，利用九个标记物可鉴定多达12种不同的肺部髓系和非髓系免疫细胞群体。

本方案描述了稳态条件下肺部免疫细胞群体的表征与鉴定方法。然而，该方案也可用于研究多种疾病模型中这些细胞群体的变化，有助于识别疾病特异性的肺部免疫微环境改变。首次操作该技术的研究人员应特别注意消化条件和试剂的选择，因为这些因素对从肺组织中释放免疫细胞的效果具有显著影响。

首先为已处死的动物进行手术前准备。使用针头或胶带将小鼠背侧固定于四肢，然后用70%乙醇消毒腹部区域的皮肤。从颈部至腹部做一切口。

去除胸部区域的皮肤以及肋骨和胸骨。使用18至21号针头向右心室注入10毫升冷磷酸盐缓冲液（PBS），冲洗肺部直至其完全变白。随后，在不接触肺部的情况下，移除胸腺和心脏。

将肺组织从周围组织中分离，并转移至含有冷BSA缓冲液的离心管中。将肺组织转移至培养皿，用两把精细手术刀将其切碎，然后放入50毫升锥形管中。加入5毫升消化缓冲液以洗涤样品。

拧紧管盖，在37摄氏度下以每分钟150转的速度于摇床中消化肺组织30分钟。加入10毫升冷的BSA缓冲液以终止反应。消化完成后，使用18号针头混合并溶解肺组织碎片。

将一个70微米的滤网置于新的50毫升锥形管上方，将消化后的肺组织混合物转移至滤网上。使用10毫升注射器活塞的橡胶端将滤网上残留的肺组织块碾碎，并用BSA缓冲液冲洗。将单细胞悬液在7摄氏度下以350 ×g离心8分钟。

弃去上清液，并将细胞重悬于1毫升ACK裂解缓冲液中。使用1毫升移液器混匀悬浮液，在室温下孵育90秒。向反应混合物中加入10毫升冷的BSA缓冲液，并在4摄氏度下以350 G离心7分钟。

弃去上清液，将沉淀重悬于染色缓冲液中，并使用血细胞计数板对细胞进行计数。将细胞重悬至浓度为每毫升500万个细胞，用于表面染色。将每孔200微升含100万个细胞的悬液转移至96孔板中，在4摄氏度下以350 ×g离心7分钟。

通过将抗-1632抗体稀释于染色缓冲液中来制备流式细胞术封闭溶液。将细胞重悬于50微升流式细胞术封闭溶液中。在4摄氏度或冰上孵育15至20分钟。

然后，向孔板中加入 150 微升染色缓冲液，在 4 摄氏度下以 350 ×g 离心 5 分钟。通过将表面抗体稀释于染色缓冲液中，制备表面抗体溶液。将细胞重悬于 50 微升表面抗体溶液中，并在 4 摄氏度避光条件下孵育孔板。

随后，用染色缓冲液将细胞洗涤两次。通过混合三份固定和透化稀释液与一份染色缓冲液，制备固定和透化缓冲液。每孔加入50 µL预配好的缓冲液重悬96孔板中的细胞，并在4°C避光孵育20至25分钟。

用纯化的去离子水稀释通透缓冲液，制备成一倍浓度的通透缓冲液，并用其洗涤细胞。用1毫升通透缓冲液稀释制备细胞内抗体溶液。每孔加入50微升稀释后的细胞内抗体溶液重悬96孔板中的细胞，在4摄氏度避光孵育40分钟。

用透化缓冲液洗涤细胞，然后用染色缓冲液洗涤。最后一次洗涤后，将细胞重悬于200微升染色缓冲液中。在流式细胞仪上每样本至少采集150万个细胞。

成功手术并经过适当的术后处理后，通过设门策略排除了碎片和双联体。使用CD45+造血标志物通过流式细胞术鉴定免疫细胞，并区分细胞的活死状态。

使用抗GR-1和抗CD68抗体将肺部免疫细胞分为三组。中性粒细胞通过Ly6G这一特异性标志物进行鉴定和确认。CD45+群体还包含自然杀伤细胞、T细胞和B细胞。

这些细胞通过自然杀伤细胞1.1、CD3和B220抗体进行染色并验证。支气管肺泡灌洗液中鉴定出嗜酸性粒细胞，其CD11b标志物呈阳性，以及肺泡巨噬细胞，后者不表达高水平的CD11b。发现CD45+树突状细胞，并通过CD24表达予以确认。

这些细胞对CD103和CD11b标志物表现出阳性或阴性反应。根据CD64的表达情况，CD103阴性细胞被归类为传统型树突状细胞和单核细胞来源的树突状细胞。单核细胞来源的树突状细胞对树突状细胞标志物CD24呈低水平阳性，对泛巨噬细胞标志物CD64呈阳性。

根据CD64和GR-1的表达情况，可区分出间质巨噬细胞、经典单核细胞和非经典单核细胞。这些细胞对CX3C趋化因子受体1呈阳性表达。本实验最关键步骤包括适当的组织采集、消化以及单细胞悬液的制备，以及对活细胞和单细胞进行设门分析。

除了通过流式细胞术对肺部免疫细胞进行表征外，还可对分离的细胞群体进行细胞培养和功能检测。该技术可为研究人员探索肺部疾病（如感染、自身免疫性疾病和癌症）中的新问题提供途径。