Name: 多囊卵巢综合征小鼠模型中肝葡萄糖产生的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 了解多囊卵巢综合征小鼠模型中肝葡萄糖产生的定量方法。本研究使用稳定同位素葡萄糖示踪剂和GCMS技术，在禁食与富葡萄糖状态下测量M+2富集度，为PCOS代谢失调机制研究提供基础。

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本研究得到了贝勒医学院妇产科系的培训资助（ALG）以及美国国立卫生研究院向CSB、SC和JM提供的R-01研究资助（资助号 DK114689）的支持。

所有动物实验程序均经贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. [6,6-2H2]葡萄糖的制备
<ol>
	<li>在实验前一天，将稳定同位素葡萄糖示踪剂用生理盐水配制。本实验使用[6,6-2H2]葡萄糖作为示踪剂，用于测定血浆葡萄糖出现率。 
	注意：本实验中需测量禁食状态和富葡萄糖条件下的葡萄糖生成情况，因此需配制两种不同的葡萄糖同位素溶液。配制时应使最终输注剂量分别接近1 mg/(kg·min)和2 mg/(kg·min)。这些浓度经过多次前期预实验优化确定。</li>
	<li>通过将无菌无热原的[6,6-2H2]葡萄糖溶解于无菌0.9%氯化钠溶液中，配制第一种输注液，仅含[6,6-2H2]葡萄糖示踪剂，用于代表禁食状态。</li>
	<li>通过将[6,6-2H2]葡萄糖示踪剂与非同位素葡萄糖（约20 mg/kg·min）共同溶解于无菌0.9%氯化钠溶液中，配制第二种输注液，以模拟进食状态。 
	注意：在本实验中，采用初始脉冲加恒速输注的方式，[6,6-2H2]葡萄糖在禁食条件下的输注速率为约1.08 mg/(kg·min)，在富葡萄糖条件下的输注速率为约1.9 mg/(kg·min)。为模拟“富葡萄糖状态”，D-葡萄糖的输注速率设定为约18.8 mg/(kg·min)。</li>
	<li>溶液配制完成后，使用0.22 µm滤器进行无菌过滤，并于4 °C保存。输注前将溶液恢复至室温，并装入预先标记的1 mL注射器中。</li>
	<li>设置输液泵，用于输注仅含示踪剂的第一种输注液（基础状态），并编程使同位素以150 µL/h的恒定速率持续输注3小时。</li>
	<li>在3小时禁食阶段结束后，将第一个输注液注射器更换为含有同位素示踪剂和D-葡萄糖的第二个输注液注射器（模拟进食状态），并在最初15分钟内以600 µL/h进行初始脉冲输注。随后将泵设定为以150 µL/h的恒定速率继续输注3小时。</li>
</ol>
2. 输注实验的设置
<ol>
	<li>将小鼠从饲养笼中取出，并在实验开始前3小时将其放入禁食笼中。本实验使用了4月龄的雌性C57BL/6J品系小鼠。 
	注意：由于该操作具有最小侵入性，因此在操作前或操作过程中无需使用任何镇痛剂。</li>
	<li>通过将小鼠按每台胰岛素泵固定数量分组来组装笼具设备。将隔板放置在平坦、稳定的基座上，为每只小鼠创建独立的隔间。为确保输注过程能够顺利进行，必须能够接触到尾静脉导管，因此需确保笼门底部设有缺口。 
	注意：视频中所示笼具是专为此实验设计的。笼具为透明材质，由有机玻璃制成。其底部为平坦且稳定的基座（标准笼具设备），隔板置于其上。该装置由多个部件组成，可根据实验台高度及实验人员需求，在不同环境中灵活组装。笼门可滑动关闭，底部设有缺口以便小鼠尾巴穿过。</li>
	<li>准备含有1 mL基础输注液的1&#160;mL注射器，然后使用内径0.28 mm × 外径0.61 mm的聚乙烯管将其连接至输液泵管路。</li>
	<li>设置输液泵流速为150 µL/h，此为维持基础输注的速率。</li>
	<li>将水浴锅加热至48 °C。</li>
	<li>在水浴锅旁准备导管插入操作台，配备30 G 0.5英寸针头、内径0.3 mm × 外径0.64 mm的硅胶管以及1英寸透明透气胶带。</li>
	<li>禁食3小时后，开始进行导管插入操作，具体步骤如下所述。</li>
</ol>
3. 导管插入
<ol>
	<li>选取一只小鼠，将其放入一个固定装置中，并确保尾部可接触。可使用一个切去一半并带有尾部缺口的瓶子作为示例。将固定装置置于平坦的基座上。用一段胶带覆盖尾部近端，以便在更远端留出导管插入的空间。 
	注意：用于此操作的胶带必须具有适中的强度和黏性。本实验中使用的是多用途纸质标签胶带，因其温和且易于剥离。</li>
	<li>将导管（连接至1 mL注射器的30 G针头，带有0.3 mm硅胶管和PE-10管，均已进行气体灭菌）连接至含有无菌肝素化生理盐水冲洗液的1 mL注射器上，轻轻冲洗导管。</li>
	<li>将小鼠移至水浴装置，将尾部浸入水浴中约30–45秒。此步骤有助于扩张尾部血管，便于导管置入。</li>
	<li>在无菌条件下进行导管插入。尾部加热后，用苯扎氯铵擦拭巾清洁尾部，并在尾部近端放置一个预先塑形为尾部轮廓的小型无齿铜制鳄鱼夹作为止血带。在放大镜下观察尾侧静脉，小心将导管插入尾静脉，随后撤出针头。轻轻冲洗液体，以确保导管通畅。</li>
	<li>用一段1英寸的透析胶带围绕插入部位缠绕，以固定导管。移除尾部的小型止血带。</li>
</ol>
4. 输注装置的设置与首次输注
<ol>
	<li>将小鼠放入其单独的笼子中，并关上滑动门，确保尾巴从缺口处伸出并保持在笼子外部。</li>
	<li>在整条导管及尾巴上再贴一条胶带，以将其固定在笼底板上。此步骤使用了多用途彩色标签胶带。</li>
	<li>断开尾静脉导管的冲洗装置，并在导管的硅胶管部分夹上一个小夹子，以防止在连接泵的输注管路时发生回流。</li>
	<li>连接牢固后，移除夹子，并用预充溶液（即输注液）进行冲洗。确保管路内液体澄清，无血液污染。</li>
	<li>记录输注开始时间，以确保输注持续约 3 小时。若同时使用多个笼子，应错开输注时间，以便有效管理。</li>
	<li>确认输注管路正常工作后，移除覆盖小鼠的遮盖物，并在小鼠周围放置标准垫料。</li>
	<li>启动第一种含示踪剂的输注液，连续输注 3 小时。在整个输注过程中，持续监测小鼠的健康状况及输注管路情况。确保输注管路固定良好，连接处无泄漏。</li>
</ol>
5. 血液采样
<ol>
	<li>首次输注完成后，停止输注，并在导管的硅胶管上夹上夹子以防止回流。轻柔地将小鼠从饲养盒中取出，注意不要扰动导管，以便采集血液。将小鼠放置在靠近笼子的区域进行采血。本实验中，采用4 mm采血针进行小鼠颊静脉穿刺采血。</li>
	<li>在所需小瓶中收集约 75 µL 血液。为进行质谱分析前的去蛋白处理，将约 15 µL 血液加入 500 µL 丙酮中。剩余血液可用于检测血糖水平 通过 血糖仪检测和/或离心分离血浆以备将来进行激素测定。</li>
</ol>
6. 第二次输注
<ol>
	<li>通过将管路从注射器上断开，从注射泵中移除灌注液，并更换为含有示踪剂和葡萄糖的第二种灌注液。使用富含葡萄糖的同位素葡萄糖输注液重复步骤 4.2 至 4.7。
	<ol>
		<li>为达到稳态，以 600 µL/h 的速率对第二种灌注液进行 15 分钟的脉冲输注。记录每组笼子的起始时间。将输注速率降低至 150 µL/h，完成总共 3 小时的输注时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤 5.1 和 5.2。</li>
	<li>停止输注泵，轻柔地移除尾静脉导管，在导管插入部位施加压力直至出血停止，并将小鼠放回其原饲养笼中。</li>
	<li>使用标准肥皂和水对笼具装置进行彻底清洁和消毒。 
	注意：本操作为可存活手术。如需继续实验，小鼠可放回笼中并保留用于后续实验。建议在本操作后至少一周内不再进行其他实验，以确保动物福利。</li>
</ol>
7. 质谱分析
<ol>
	<li>将样品送交质谱分析。</li>
	<li>分析
	<ol>
		<li>采用气相色谱-质谱联用技术（GCMS），通过葡萄糖五乙酸酯衍生物测定[6,6-2H2]葡萄糖的同位素富集度21,22。简而言之，该方法包括制备葡萄糖的五乙酸酯衍生物，随后使用GCMS进行样品分析20,22。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算
	<ol>
		<li>所有动力学测量均在稳态条件下进行。总血浆葡萄糖出现率（葡萄糖Ra）根据血浆中[6,6-2H2]葡萄糖的M+2富集度，利用已建立的同位素稀释方程计算得出21。在稳态条件下，假设葡萄糖的出现速率等于其消失速率。内源性葡萄糖生成速率（mg/(kg·min)）（GPR）= 葡萄糖Ra － 外源性葡萄糖输入速率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

高血糖及葡萄糖代谢/稳态异常是多囊卵巢综合征（PCOS）的特征。血糖水平由饮食摄入的葡萄糖和内源性葡萄糖生成共同维持。 通过 糖原分解、糖异生和糖原合成，这些过程受激素和酶的调控。肝脏葡萄糖生成在循环血糖水平升高时受到抑制。在葡萄糖代谢异常的疾病中，葡萄糖生成的抑制调节功能受损，导致高血糖。尽管已有许多研究在多囊卵巢综合征（PCOS）动物模型中间接测量了肝脏葡萄糖生成，但直接测量该指标的研究仍较少。本研究描述了一种可同时在多只小鼠中直接测定肝脏葡萄糖生成速率的简便方法。该技术可广泛应用于涉及不同小鼠模型中葡萄糖代谢的多种研究。此外，该技术还可作为进一步扩展测量的基础，例如糖异生和糖原分解的测定。20,23.
本实验的关键步骤是导管插入以及准确定量[6,6-2H2]葡萄糖和天然葡萄糖配制输注溶液，以适于进行气相色谱-质谱分析（GCMS）。导管插入技术参见 Marini 等（2006）的描述。<sup cla...

多囊卵巢综合征（PCOS）是一种常见疾病，影响12%–20%的育龄女性1,2这是一种复杂的疾病，可导致多种表型，包括多囊卵巢、月经不规律以及临床或实验室检查显示高雄激素血症；通常在女性符合上述三项标准中的任意两项时即可确诊。3多囊卵巢综合征（PCOS）的一个主要特征及其发病机制中的关键因素是患者女性中存在的代谢紊乱。患有PCOS的女性出现胰岛素抵抗、糖耐量异常、肥胖和代谢综合征的几率更高。3,4,5,6胰岛素抵抗不仅是该疾病的临床表现，还被认为通过增强黄体生成素在卵巢中的作用，促进雄激素的过度产生，从而参与疾病的发生发展。7,8胰岛素抵抗被认为可能有多种成因，但研究表明其可能源于胰岛素受体信号传导的异常模式9,10已采用胰岛素-正葡萄糖钳夹技术这一金标准方法，对多囊卵巢综合征患者中的胰岛素抵抗进行了研究评估。11,12,13,14,15多囊卵巢综合征（PCOS）女性，无论体重指数（BMI）如何，其胰岛素抵抗水平均高于对照组。在胰岛素抵抗状态下，胰岛素对葡萄糖生成的调控能力受损，导致葡萄糖过度生成。例如，糖尿病患者糖异生速率升高，且糖原分解的抑制作用受损。16此外，在糖尿病大鼠中已观察到葡萄糖生成的抑制作用受损。17尽管钳夹研究可以测量胰岛素抵抗，但针对多囊卵巢综合征（PCOS）的研究中，很少有研究专注于在空腹和进食状态下直接测量葡萄糖生成。这需要使用非放射性同位素标记的葡萄糖示踪剂输注并进行检测 通过 质谱法
动物模型已广泛应用于多囊卵巢综合征（PCOS）的研究。通过在产前、青春期前或青春期后给予雄激素，已成功建立瘦型和肥胖型PCOS小鼠模型18。与相应对照组相比，啮齿类PCOS模型也表现出代谢差异。本实验室先前的数据表明，PCOS小鼠模型（包括瘦型和肥胖型）存在异常的葡萄糖耐量试验（GTT）结果，这与人类PCOS的研究文献一致19。使用瘦型和肥胖型动物模型有助于进一步探究其代谢差异。具体而言，该模型可用于通过同位素标记的葡萄糖示踪剂直接评估葡萄糖生成速率。其中最常用的稳定同位素标记葡萄糖示踪剂之一是[6,6-2H2]葡萄糖。[6,6-2H2]葡萄糖的富集度可通过五乙酸酯衍生物进行测定，方法如前所述20。
本研究旨在通过同位素标记葡萄糖输注法，测定多囊卵巢综合征（PCOS）小鼠在禁食状态和高糖状态下的肝脏葡萄糖生成速率。这些技术可广泛应用于涉及葡萄糖代谢动力学的多种实验。

<table><tbody><tr><td>0.9% 氯化钠溶液</td><td>McKesson</td><td>275595</td><td></td></tr><tr><td>10 mL BD 鲁尔锁头注射器</td><td>VWR</td><td>75846-756</td><td>每只动物使用两个注射器（一个用于同位素标记葡萄糖溶液，一个用于高葡萄糖浓度的同位素溶液）</td></tr><tr><td>1 英寸透明透波胶带</td><td>3M</td><td>70200400169</td><td></td></tr><tr><td>1 英寸标签胶带</td><td>Fisher</td><td>GS07F161BA</td><td>品牌仅为示例</td></tr><tr><td>含肝素化生理盐水冲洗液的 5 mL 注射器</td><td>McKesson</td><td>191-MIH-2235</td><td>也可自行配制肝素冲洗液（每毫升 0.9% 氯化钠溶液中含 10 单位肝素）</td></tr><tr><td>5 mm Medipoint Goldenrod 动物采血针</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9891620</td><td>若动物年龄在 2 至 6 个月之间，则使用 5 mm 针头</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>高级加热磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>97042-602</td><td>品牌仅为示例</td></tr><tr><td>BD 27 号 0.5 英寸针头</td><td>Health Warehouse</td><td>A283952</td><td></td></tr><tr><td>BD 30 号 0.5 英寸针头</td><td>Medvet</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic 聚乙烯（PE）管，内径 0.28 mm × 外径 0.61 mm</td><td>VWR</td><td>63019-004</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic 聚乙烯（PE）管，内径 0.28 mm × 外径 0.61 mm</td><td>VWR</td><td>63019-004</td><td></td></tr><tr><td>烧杯，1000 mL</td><td></td><td></td><td>任意品牌</td></tr><tr><td>笼养颗粒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带密封盖的透明 VOA 玻璃小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-719-120</td><td>用于储存丙酮和采血样本</td></tr><tr><td>铜制无齿鳄鱼夹（用于止血带）</td><td>Amazon</td><td></td><td>任意品牌；由实心铜制成、表面光滑无齿的鳄鱼夹</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖 &gt;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖（6,6-D2, 99%）</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-349-PK</td><td></td></tr><tr><td>道康宁硅胶管，内径 0.3 mm × 外径 0.64 mm</td><td>VWR</td><td>62999-042</td><td></td></tr><tr><td>放大镜</td><td>Amazon</td><td></td><td>任意品牌；类似于 LANCOSC 带光源和支架的放大镜</td></tr><tr><td>微量天平</td><td>Ohaus Adventurer Pro</td><td>AV264C</td><td>任何具有 0.0001 g 精度的类似型号均可使用</td></tr><tr><td>Nalgene 瓶，500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0158-12EA</td><td>或任何类似品牌；需沿中线剖开（包括瓶盖），并在底部切出适合尾巴穿过的凹口</td></tr><tr><td>PHD Ultra 多通道注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3024A</td><td></td></tr><tr><td>有机玻璃板</td><td></td><td></td><td>任意品牌；用于在导管插入过程中稳定小鼠</td></tr><tr><td>有机玻璃板及隔板</td><td></td><td></td><td>任意品牌；用于在输注期间隔离饲养小鼠</td></tr></tbody></table>

多囊卵巢综合征小鼠模型中肝糖生成的评估

Evaluation of Hepatic Glucose Production in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model

多囊卵巢综合征（PCOS）是一种常见疾病，可导致葡萄糖代谢紊乱，如胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良。葡萄糖代谢失调是该疾病的重要表现，也是其发病机制的关键。因此，针对PCOS中葡萄糖代谢评估的研究具有重要意义。目前极少有研究在PCOS模型中使用非放射性葡萄糖示踪剂直接定量肝脏葡萄糖生成。本研究逐步阐述了通过测定[6,6-2H2葡萄糖，一种稳定的同位素标记葡萄糖示踪剂 通过 气相色谱-质谱联用（GCMS）。该实验流程包括制备稳定的同位素标记葡萄糖示踪剂溶液，通过尾静脉插管，在同一小鼠体内依次进行禁食状态和高糖状态下的葡萄糖示踪剂输注。[6,6-2H2采用五乙酸酯衍生物法通过气相色谱-质谱联用（GCMS）测定葡萄糖。该技术可用于多种涉及肝脏葡萄糖生成速率直接测定的研究。

根据先前描述的同位素稀释方程，通过在空腹和富葡萄糖条件下使用五乙酸酯衍生物测定[6,6-2H2]葡萄糖的M+2富集度，计算总血浆葡萄糖速率（glucoseRa）21。在稳态条件下，假设葡萄糖的出现速率等于其消失速率。对照组在空腹6小时后总glucoseRa为19.98 ± 2.53 mg/(kg·min)，在富葡萄糖条件下为25.80 ± 1.76 mg/(kg·min)。根据上述计算，GPR在空腹6小时后为19.08 ± 2.53 mg/(kg·min)，在富葡萄糖条件下为8.56 ± 1.40 mg/(kg·min)（表1 和 图1）。
<img alt="禁食与高糖条件下葡萄糖生成速率 mg/(kg·min) 的柱状图比较。" class="xfigimg" src="/files/f...

本研究通过使用稳定同位素标记的葡萄糖示踪剂，对多囊卵巢综合征小鼠模型中的肝脏葡萄糖生成进行直接测定 通过 在禁食和高糖状态下同时进行尾静脉注射。

多囊卵巢综合征（PCOS）是一种常见疾病，可导致葡萄糖代谢紊乱，如胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良。

本实验的目的是在多囊卵巢综合征（PCOS）小鼠模型中测定肝脏葡萄糖的生成。葡萄糖代谢紊乱是PCOS的重要表现之一，也是其发病机制的关键环节。因此，涉及PCOS中葡萄糖代谢评估的研究具有极其重要的意义。本研究中，我们逐步介绍如何通过气相色谱-质谱联用技术（GCMS）检测六氘代葡萄糖（一种稳定的同位素标记葡萄糖示踪剂）的M+2富集度，从而定量多囊卵巢综合征（PCOS）小鼠模型中肝脏葡萄糖生成速率。该方法包括制备稳定的同位素标记葡萄糖示踪剂溶液，并在同一小鼠身上联合实施尾静脉插管，分别在禁食状态和高糖状态下输注葡萄糖示踪剂。在实验前一天，需将稳定同位素标记的葡萄糖示踪剂溶于生理盐水中进行配制。本实验在富含葡萄糖的条件下测量了禁食期间的葡萄糖生成，因此葡萄糖同位素被配制成两种不同的制剂。示踪剂在无菌条件下配制，将无菌无热原的6,6-二氘代葡萄糖溶解于无菌0.9%氯化钠溶液中，该溶液可含或不含葡萄糖。第一种输注液仅含有示踪剂。第二种输注液包含示踪剂和非同位素标记的葡萄糖。溶液配制完成后，使用0.22微米滤器进行无菌过滤，并在4摄氏度下保存。溶液的配制使得最终输注剂量分别接近1毫克/千克·分钟和2毫克/千克·分钟。在基础状态及高糖条件下测量葡萄糖出现率时，分别采用预注射加平均恒定速率输注六氘代葡萄糖，剂量分别为1.08毫克/千克·分钟和1.9毫克/千克·分钟。为了模拟进食状态，在高糖条件下采用平均D-葡萄糖输注速率为18.8毫克/千克·分钟。在实验开始前3小时，将小鼠从其饲养笼中取出，并放入禁食笼中。本实验采用四月龄雌性C57BL6J品系小鼠。将小鼠按每台胰岛素泵固定数量分组，组装笼具设备。将隔板放置在平坦、稳定的基座上，为小鼠制作独立的隔间。笼子为透明材质，由有机玻璃制成。底部为平坦且稳固的基座，用于放置隔板。笼门可滑动关闭，底部设有凹槽，以便尾巴穿过。组装含有1毫升基础灌注液的注射器，然后使用聚乙烯管将其连接到输液泵管路。将输液泵的流速设置为每小时150 µL，即基础输注速率。将水浴加热至48 °C。在装有30 gauge半英寸针头、硅胶管和一英寸透明胶带的水浴槽旁边准备导管插入操作台。选取一只小鼠，将其放入固定装置中，并暴露其尾部。在尾部近端贴一段胶带，以便在更远端留出导管插入的空间。将小鼠移至水浴中，将其尾巴浸入水浴约30至45秒。这有助于扩张尾部血管，便于导管置入。导管插入操作必须在无菌条件下进行。待尾部 warmed 后，清洁尾部，并在尾部近端放置一个小的无齿铜制鳄鱼夹作为止血带。在放大镜下观察尾侧静脉。然后，小心地将导管插入尾静脉，并轻轻冲洗溶液以确保导管通畅。用一段转运胶带包裹插入部位以固定导管，并从尾部取下小的止血带。将小鼠放入其单独的笼子中并关上滑动门，确保尾巴穿过缺口并保持在笼子外面。在整根导管和尾部上方再贴一段胶带，将其固定在笼子的底板上。断开尾

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