Name: 自动化秀丽隐杆线虫的聚集定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学习使用CellProfiler自动化定量秀丽隐杆线虫中的多聚谷氨酰胺聚集体，以研究蛋白质稳态变化。该方法可高通量筛选影响宿主蛋白质稳态的细菌基因，为神经退行性疾病机制研究提供可靠框架。

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本研究由美国国立卫生研究院（1RO3AG069056-01）和美国传染病学会对 DMC 的资助支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。我们感谢 Czyz 实验室成员对稿件的校对。卡通图示使用 BioRender 付费许可证生成。

所有操作均遵循经佛罗里达大学机构生物安全委员会审查和批准的安全指南。已采取适当的&#160;生物安全措施，以降低暴露于生物安全二级细菌的风险。
注意：所有实验中，秀丽隐杆线虫（C. elegans）必须在接种了大肠杆菌OP50（Escherichia coli OP50）的线虫生长培养基（NGM）平板上培养和维持。
1. 10 cm NGM 平板的制备
<ol>
	<li>将3 g NaCl、2.5 g 胰蛋白胨和17 g 琼脂加入2 L 锥形瓶中，用双蒸水（ddH2O）定容至1 L。灭菌前放入磁力搅拌子。</li>
	<li>在121 °C、21 psi 压力下高压灭菌45分钟。随后将混合物置于水浴中冷却至50 °C。</li>
	<li>采用无菌操作技术，加入以下无菌溶液：1 mL 1 M CaCl2·2H2O、1 mL 1 M MgSO4·7H2O、1 mL 溶于100%乙醇中并预热至室温的5 mg/mL胆固醇溶液，以及25 mL 1 M KH2PO4 （pH = 6.0）。使用磁力搅拌器混匀，可在700 RPM转速下搅拌1分钟。</li>
	<li>将培养基倒入培养皿，直至完全覆盖10 cm培养皿底部。或者，可使用带刻度的血清移液管，每皿加入约20 mL培养基。</li>
	<li>制备好的平板在室温下干燥24小时，然后接种细菌；或干燥后于4 °C保存备用。 
	&#8203;注意：所有培养基组分均需采用无菌操作。步骤1.3–1.4应在超净工作台内进行。</li>
</ol>
2. 在24孔板中制备含FUDR的NGM琼脂
<ol>
	<li>按照步骤 1.1–1.3 操作。</li>
	<li>在 NGM 中添加 5-氟-2′-脱氧尿苷（FUDR），混匀，使终浓度达到 100 µg/mL。 
	注意：FUDR 可抑制 DNA 复制，通过靶向生殖系和胚胎发生过程阻断线虫 C. elegans 的繁殖，从而影响其寿命。因此，在将线虫转移至含 FUDR 的培养板之前，必须使其充分发育至年轻成虫阶段。 
	警告：FUDR 具有毒性，操作时应遵循生产商提供的安全数据表（Safety Data Sheet）中的指导。</li>
	<li>使用移液器将 1 mL NGM-FUDR 加入每个孔中。 
	&#8203;注意：此过程可借助自动平板注液系统完成。</li>
	<li>在接种细菌前，或将未接种的平板储存于 4 °C 前，于室温下干燥 24 小时。</li>
</ol>
3. 平板接种：OP50 及其他测试菌
<ol>
	<li>过夜培养的准备 E. coli OP50 培养物，将 200 µL 冻存菌种中的细菌等分试样加入含有 250 mL 新鲜的&#160;无菌LB肉汤（Luria broth）。 
	注意：培养基的体积取决于需要接种的培养板数量。准备其他细菌培养物时，用无菌微量移液器吸头从冻存菌种中取菌，接种至含有5 mL生长培养基的16 mL培养管中。</li>
	<li>在37 °C摇床培养箱中，以220 RPM（每分钟转数）振荡培养过夜。 
	注意：使用灭菌的锥形瓶，其容积至少为培养基工作体积的两倍，并用经高压灭菌的铝箔封口。接种步骤及细菌分装操作均须采用无菌技术进行。</li>
	<li>加入1-2 mL过夜培养物 E. coli 将OP50菌液接种至每块10 cm NGM平板的中心。无需将菌液涂布至整个NGM平板表面。</li>
	<li>在使用或储存前，将培养板在室温下晾干。 
	&#8203;注意：接种后的平板可连同盖子置于有气流的通风橱中，以促进干燥。</li>
</ol>
4. 培养与铺板：24孔板
<ol>
	<li>按照步骤 3.1–3.2 中的培养说明，制备所需细菌菌株的过夜培养物。</li>
	<li>将每种细菌培养物各 200 µL 转移至含有 NGM 琼脂的 24 孔板的每个孔中。200 µL 的细菌液可覆盖整个琼脂表面，以最大化食物量，确保线虫不会避开细菌菌苔。</li>
	<li>将平板在生物安全柜（BSC）中保持微开状态，以促进干燥。定期检查平板，防止过度脱水，并调整平板方向以促进空气均匀流通和干燥。平板应在 5 小时内干燥。 
	注意：所有涉及生物安全等级 2 级细菌的操作必须在经过认证的生物安全柜中进行，并须经机构生物安全委员会批准。</li>
</ol>
5. 年龄同步化
注意：所有步骤均应采用适当的无菌技术进行（即在火焰附近或生物安全柜内操作）。
<ol>
	<li>使用滤膜过滤除菌的 M9 溶液（5.8 g Na2HPO4·7H2O，3.0 g KH2PO4，5 g NaCl，0.25 g MgSO4·7H2O，溶于 1 L ddH2O 中）从 10 cm OP50 平板上冲洗出怀卵的雌雄同体线虫。
	<ol>
		<li>使用无菌玻璃或塑料移液管将 M9 溶液多次加入平板，以使线虫脱离细菌菌苔。</li>
		<li>收集线虫悬液，并将液体转移至 15 mL 聚苯乙烯圆锥形离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温（RT，约 23 °C）下以 270 x g 离心 2 分钟。</li>
	<li>使用真空抽滤瓶吸除上清液并弃去，保留管底线虫沉淀不受扰动。
	<ol>
		<li>加入 5–10 mL M9 溶液重悬沉淀，清洗线虫，并重复步骤 5.2–5.3 两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向离心管中加入 5 mL 20% 漂白溶液（8.25 mL ddH2O，3.75 mL 1 M NaOH，3.0 mL 非杀菌型次氯酸钠），持续颠倒混匀以溶解线虫。当线虫几乎完全溶解时，即可进行离心。
	 
	注：漂白时间及漂白溶液体积取决于样品量。漂白过度或不足均为常见错误。因此，通常需要优化该步骤以确定样品何时适合离心。</li>
	<li>以 423 x g 离心 2 分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>加入 10 mL 无菌 M9 溶液以重悬卵沉淀。
	<ol>
		<li>以 423 x g 离心 2 分钟使卵沉淀，使用抽滤瓶移除上清液。</li>
		<li>重复步骤 5.6–5.6.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将卵沉淀重悬于 5 mL 无菌 M9 溶液中，并在设定温度下置于旋转混合仪（nutator）上过夜。
	 
	&#8203;注：同步化年龄的 L1 幼虫将于次日准备好转移至培养平板。</li>
</ol>
6. 年龄同步化后线虫的制备
<ol>
	<li>在室温（约 23 °C）下，以 270 × g 离心同步化年龄的线虫 3 分钟。</li>
	<li>在洁净环境中（如超净台或本生灯旁）吸除上清液，保留约 200 µL 上清液，并将线虫重新悬浮。</li>
	<li>使用移液器将浓缩的线虫悬液转移至预先接种 OP50 的 10 cm NGM 平板。 
	注意：每个平板最多可容纳 1,500 条线虫而不会食物不足；但具体数量需根据细菌菌苔密度和培养温度进行调整。建议使用多个平板以防止线虫饥饿。需特别注意，这些平板中不得含有 FUDR。</li>
	<li>让平板干燥后倒置，并在 25 °C 下培养 48 小时。 
	注意：根据筛选条件的不同，第 6.1 步中的线虫可直接放置于测试平板（含细菌、药物或待测化合物）。若待测条件影响发育，则应先将线虫在含 OP50 的 NGM 平板上培养至年轻成虫阶段（约 48 小时），再暴露于测试条件下。</li>
	<li>经过 48 小时培养后，用无菌 M9 溶液冲洗平板上的线虫，并将其转移至锥形管中。 
	注意：成年线虫会沉降至管底。沉降所需的确切时间取决于从 10 cm 平板回收的线虫数量。在此条件下，线虫通常在 10 分钟内完成沉降。</li>
	<li>通过肉眼观察确定沉降时间，以确保去除残留的卵或已孵化的幼虫。</li>
	<li>加入额外的 10 mL M9 溶液以冲洗线虫体表残留的细菌。
	<ol>
		<li>在 23 °C 下以 270 × g 离心线虫 2–3 分钟。</li>
		<li>再重复洗涤步骤 3 次。为获得最佳效果，最后一次洗涤后在管中保留约 1–1.5 mL M9 溶液。</li>
		<li>取 10 µL 线虫悬液滴加到载玻片上，计数线虫数量。</li>
		<li>将线虫密度调整至每 10 µL M9 溶液中约含 150 条线虫。离心后可通过添加或去除 M9 溶液来调节悬液中的线虫浓度。</li>
		<li>通过多次不同液滴的计数取平均值，确认已达到目标浓度。建议至少对三个液滴进行计数并取平均值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用无菌操作技术，将含有约 150 条线虫的 10 µL 线虫悬液转移至测试板的每一孔中。</li>
	<li>在显微镜下检查各孔，确保每孔含有足够数量的线虫。可在培养前添加额外线虫。</li>
	<li>让平板干燥约 10 分钟，然后倒置并转移至 25 °C 培养箱中培养 72 小时。 
	注意：最终培养时间可根据实验需求进行调整。在 25 °C 下，72 小时的培养时间足以支持 24 孔板中每孔 150 条线虫以 200 µL 细菌为食的生长。</li>
</ol>
7. 准备用于成像的线虫
<ol>
	<li>为促进更有效的沉淀并减少样本损失，在洗涤前固定线虫以防止其游动。 
	注意：如果处理的样本较少，可通过暴露于左旋咪唑（100 µM）实现固定。然而，若处理大量样本，可通过冷冻固定线虫。此外，长时间冷冻（18–24 小时）可在制备过程中防止 polyQ 聚集体的进一步形成。
	<ol>
		<li>将多孔板置于 -20 °C 冰箱中 15–20 分钟，或直至线虫不再移动。</li>
		<li>将样本从冰箱中取出，静置 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用移液器向目标孔中加入 1 mL 预冷至 4 °C 的 M9 培养基，反复按压和释放移液器活塞 4–6 次，以洗涤每个孔中的线虫。 
	注意：有时线虫会粘附在移液器吸头内壁上。因此，应在每孔之间更换新的吸头，以避免线虫交叉污染。</li>
	<li>将线虫悬液转移至微量离心管中，静置使线虫沉降至管底。</li>
	<li>吸除并弃去上清液。总共洗涤样本三次。</li>
	<li>在最后一次洗涤中待线虫完全沉降后，吸除 500 µL 上清液，保留 500 µL 用于重悬线虫。</li>
	<li>将剩余的线虫悬液转移至新的平底 24 孔板中，放入 -20 °C 冰箱冷冻 48 小时。 
	注意：冷冻线虫可降低背景荧光，有助于更清晰地观察聚集体。</li>
</ol>
8. 成像
<ol>
	<li>从超低温冰箱中取出培养板，使其自然解冻，擦去多余的冷凝水，然后在成像前取下盖子。 
	注意：图像采集的具体细节将根据所使用的设备和软件而有所不同。本部分的方案仅作为指导，预期可能需要进行适当调整。此外，必须以 TIFF 文件格式保存图像。</li>
	<li>在图像采集过程中，使用以下显微镜设置：曝光时间 500 毫秒；40 倍物镜配合 0.63 倍相机适配器（总放大倍数 25.2 倍）；GFP 荧光强度设为 100%。 
	注意：不同的显微镜配置和系统所获取的图像可能与结果部分提供的图像存在差异。为了更通用地描述所需图像，此处提供更为客观的图像参数标准。在 CellProfiler 中，只有直径为 1.0–10.0 像素、荧光强度为 0.10–1.0（任意单位，量程 0–1）的聚集体才能被准确识别。这些聚集体图像的荧光背景强度通常低于 0.10 的阈值。对于明场图像，线虫的强度范围为 0.7–1.0，背景强度为 0.1–0.2。明场图像中线虫的平均长度从头到尾约为 250 至 350 像素。</li>
	<li>调节透射光控制参数，使线虫相对于暗背景呈现明亮清晰的成像效果。避免过度曝光，否则会导致线虫尺寸被错误放大。</li>
	<li>可能需要调整孔内线虫的位置，以防止过度聚集。可使用移液器吸头将聚集的线虫分散开。</li>
	<li>将通道设置为 GFP，以确定两张图像的焦平面。 
	注意：必须在 GFP 通道中确定焦平面。在采集明场图像过程中任何对焦的改变，都会导致在图像分析时聚集体与线虫的位置无法对齐。</li>
	<li>采集一张明场图像后，立即在不移动培养板的情况下采集对应的荧光图像。</li>
	<li>将测试图像导入分析流程，根据第 8.2 步后的&#34;注意&#34;说明，确定图像中目标物的强度和尺寸参数。 
	注意：在正式分析前，CellProfiler 可提供有关目标物强度和长度的所有必要信息。</li>
	<li>为评估图像，首先下载 CellProfiler17。打开软件后，将感兴趣的图像直接拖拽至“Images”（图像）框中。</li>
	<li>点击文件列表中的图像以打开查看。</li>
	<li>屏幕左上角有多个图标，可用于测量目标物尺寸或放大特定区域。选择放大镜图标以高亮显示感兴趣区域。</li>
	<li>选择箭头图标以测量线虫和聚集体的长度。</li>
	<li>将鼠标悬停在目标物上，可在屏幕底部查看其强度值。 
	&#8203;注意：由于所有图像均为灰度图像，因此所有红色、蓝色和绿色像素值均相同。</li>
</ol>
9. 图像分析
<ol>
	<li>使用 CellProfiler 图像分析流程前，需正确命名图像对。命名格式如下：P1_A01_S1_C1，其中 P1 表示特定的培养板及其对应的数字编号；&#34;A&#34; 表示行，&#34;01&#34; 表示列；&#34;S&#34; 表示单个孔的特定图像对；&#34;C&#34; 表示通道，其中 &#34;1&#34; 用于表示明场图像，&#34;2&#34; 用于表示荧光图像。</li>
	<li>从官方网站下载 CellProfiler（版本 4.1.3 或更高）17。</li>
	<li>下载分析流程（补充文件 1）。通过选择 文件 &#62; 导入 &#62; 从文件导入流程，将该流程（Pipeline）上传至 CellProfiler。 
	注意：模块 2 和模块 3 已被禁用，因其被认为非必要。若图像分析未能实现线虫的有效分离与识别，可恢复其功能；但需对流程进行修改。</li>
	<li>如需启用这些模块，请选中各模块左侧的复选框。将 &#34;UntangleWorms&#34; 模块的输入二值图像重命名为 &#34;convertobjectstoimage&#34; 模块的输出图像。</li>
	<li>初次使用时可能出现与模块 2 相关的错误提示。若出现此情况，可继续进行分析。</li>
	<li>将用于识别线虫的训练集上传至 &#34;UntangleWorms&#34; 模块。该训练集可在 补充文件 2 中找到。
	<ol>
		<li>选择 UntangleWorms 模块以打开其设置界面。</li>
		<li>找到 训练集文件名，并点击上传文件图标。</li>
		<li>上传 补充文件 2（训练集）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过点击左上角的 图像 模块上传图像。将按步骤 9.1 所述正确命名的图像拖放至该区域。</li>
	<li>在分析图像前，选择用于存储结果的目标输出文件夹。
	<ol>
		<li>点击程序左下角附近的 输出设置 按钮。</li>
		<li>点击 默认输出 右侧的文件夹图标，选择所需的输出路径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击 分析图像 图标以开始图像分析。</li>
	<li>若分析耗时过长且卡在单张图像处理上，可能是由于图像采集问题所致。若发生此情况，请中止运行，并通过检查输出文件夹、查找缺失的图像名称，来确定未处理的图像。 
	注意：部分图像可能需要额外预处理，以去除流程无法处理的大尺寸或高亮度伪影。某些情况下，此类图像需从分析中排除。</li>
	<li>分析完成后，软件将结果整理为 Excel 表格，其中包含每条线虫的信息（N 列）及其对应的聚集体数量（K 列）。 
	注意：成功运行后将生成一个 Excel 表格，列出每个孔中每条被识别线虫的聚集体数量。实验人员可根据需要对这些数据进行进一步处理。</li>
	<li>从 补充文件 3（Windows）或 补充文件 4（Mac）下载元数据整理工具（图形用户界面），以便便捷地整理 CellProfiler 输出的 CSV 文件数据。 
	注意：该软件无正式许可证，下载后不会自动打开。</li>
	<li>若使用 64 位 Windows 操作系统，请执行步骤 9.14–9.17；若使用 Mac 操作系统，请执行步骤 9.18–9.20。步骤 9.21–9.22 适用于两种操作系统。</li>
	<li>对于 Windows 操作系统，找到已下载的文件并将其解压至目标位置。</li>
	<li>找到并打开解压后的文件夹 gui_windowsOS_64x，通过点击 &#34;gui&#34; 应用程序图标启动程序。</li>
	<li>系统可能会弹出请求运行权限的提示。选择 更多信息，然后点击 仍然信任。</li>
	<li>元数据整理工具现已就绪，可直接拖放 CellProfiler 输出的 CSV 文件。继续执行步骤 9.21。</li>
	<li>对于 Mac 操作系统，找到已下载的文件并打开 gui_macOS_64x.zip。此操作将自动解压所有文件。</li>
	<li>打开位于 &#34;下载&#34; 文件夹中的解压后文件夹。</li>
	<li>右键点击 &#34;gui&#34; 应用程序，选择 打开。由于缺少官方许可证，系统将弹出权限请求提示。选择 打开，然后继续执行步骤 9.21。</li>
	<li>点击 上传您的文件 或直接拖放所需的 CellProfiler CSV 文件。</li>
	<li>点击 整理 按钮，程序将跳转至新界面并显示 下载文件 按钮。点击该按钮并选择保存输出文件的目标位置。输出文件将以原始文件名加上 &#34;_organized&#34; 后缀的形式保存。</li>
</ol>

<ol><li>Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+the+role+of+protein+misfolding+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).</li>
<li>Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+as+a+modifier+of+neurodegenerative+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk.</a> Cell Host & Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).</li>
<li>Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Our+gut+microbiome%3A+The+evolving+inner+self%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Our gut microbiome: The evolving inner self.</a> Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).</li>
<li>Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+understanding+the+role+of+the+gut+microbiota+in+brain+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7 (1), 13023(2016).</li>
<li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), 1003466(2013).</li>
<li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438(2011).</li>
<li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li>
<li>Walker, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+with+human+enteric+bacterial+pathogens+leads+to+proteostasis+disruption+that+is+rescued+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate.</a> PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510(2021).</li>
<li>Goya, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+Bacillus+subtilis+protects+against+%CE%B1-Synuclein+aggregation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Probiotic Bacillus subtilis protects against α-Synuclein aggregation in C. elegans.</a> Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).</li>
<li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337(2017).</li>
<li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).</li>
<li>Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signaling+and+the+heat+shock+response+modulate+protein+homeostasis+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).</li>
<li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WorMachine%3A+machine+learning-based+phenotypic+analysis+tool+for+worms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms.</a> BMC Biology. 16 (1), 8(2018).</li>
<li>Wählby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).</li>
<li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+Analyst%3A+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 482(2008).</li>
<li>CellProfiler: an open-source image analysis software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cellprofiler.org">http://www.cellprofiler.org</a> (2021).</li>
<li>Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-verified+two-allele+transposon+mutant+library+for+Pseudomona+aeruginosa+PA01%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).</li>
<li>Schulenburg, H., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+pathogen+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964(2014).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li>
<li>Haldimann, P., Muriset, M., Vígh, L., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+hydroxylamine+derivative+ng-094+suppresses+polyglutamine+protein+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).</li>
<li>Shinn-Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wrapping+culture+plates+with+Parafilm+M%C2%AE+increases+Caenorhabditis+elegans+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Wrapping culture plates with Parafilm M® increases Caenorhabditis elegans growth.</a> BMC Research Notes. 12 (1), (2019).</li>
<li>Alexander-Floyd, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+cell+type-dependent+effects+of+autophagy+on+polyglutamine+aggregation+revealed+by+natural+genetic+variation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans.</a> BMC Biology. 18 (1), 18(2020).</li>
<li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li>
<li>Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+positives+in+the+early+stages+of+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">False positives in the early stages of drug discovery.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

C. elegans 的培养、成像及图像处理流程描述了利用 CellProfiler（一种开源图像分析软件）的操作步骤。代表性结果表明该方法具有可重复性、可减少偏差并具备可扩展性。这一标准化流程将有助于改进针对大型细菌库、基因组库或药物库的筛选策略。尽管目前已存在其他自动化的 C. elegans 目标检测方法，但本研究所述技术提供了一条标准化、高通量的整合性流程，涵盖生物培养、图像采集与分析环节。
为了优化本文所述的实验方案，必须测试多种线虫培养条件。最初，线虫在年龄同步化后（L1阶段）立即转移至待测细菌上。然而，这种方法导致线虫群体体型存在差异，即使在同一孔内的线虫之间也存在不一致。C. elegans 已知具有病原体回避行为19，这可能导致观察到的体型差异，并最终影响后续成像过程中对线虫的检测。为消除此类变异，将每孔中的全部NGM区域均覆盖上待测细菌。此外，线虫先在 E. coli OP50 上饲养，并在25 °C条件下培养48小时，使其完全发育为年轻成虫。在转移至待测细菌前，让线虫在 E. coli OP50 上发育至成虫阶段，可获得更一致的体长。此外，通过在NGM琼脂中添加FUDR，避免了过度拥挤及子代快速消耗食物的问题。使用FUDR可消除子代干扰，提高自动识别线虫的准确性，因为子代与亲代混合会阻碍自动识别。然而，在使用FUDR时必须谨慎，并设置适当的对照，因为该化合物已被证实会影响 C. elegans 的蛋白质稳态和寿命20,21。在本实验方案所述条件下，FUDR并未影响肠道内polyQ的聚集（补充图5）；因此，其使用对本方法而言是合适且有益的。
成像前对样品进行冷冻被证明是成功应用该流程的关键步骤。冷冻前的聚集体计数显著高于手动计数（图3B）。在成像前将线虫置于-20 °C环境中保存18-48小时，可降低背景荧光，最终提高聚集体的检测效果（图3A）。目前仅针对polyQ模型研究了冷冻对聚集体检测的影响，因此在未进一步验证的情况下，不应将此效应推广至其他模型。
尽管所有条件均保持一致，但在不同实验运行之间，每条线虫的平均聚集体数量仍可能有所差异，而定植OP50与定植MPAO1动物之间聚集体数量的比值则保持一致（图6，补充图2，补充图5）。因此，每次实验运行中必须始终包含E. coli OP50对照，或任何其他合适的参考对照。实验间聚集体计数的此类变异性可能受环境条件（温度、湿度）22,23或遗传背景8的影响。事实上，观察到在长期培养后，肠道荧光显著减弱甚至完全消失，此时需从冻存菌种中重新复苏新菌株。荧光减弱可能是由于遗传变化抑制了毒性转基因（如表达polyQ的转基因）所致。然而，不同实验操作者之间（补充图2）、生物学重复之间（图5）以及同一样本内部（补充图3）结果所表现出的极高可重复性，凸显了该方法的可靠性。
已有大量研究报告采用肠道多聚谷氨酰胺（polyQ）来研究蛋白质稳态9,11,12,13,24,25。然而，由于不同实验方法和检测手段之间存在差异，各项研究结果难以直接比较。尽管如此，本文所述的自动化定量方法重现了部分先前发表的研究结果，包括细菌诱导的蛋白聚集现象9,13以及相似数量的聚集物11。综上所述，本研究所描述的分析流程为蛋白质稳态研究提供了一种有价值的工具。
本文所述方法存在一些固有的挑战。例如，需要足够的时间来掌握本方案的全部内容，尤其对于第8部分而言更是如此，该部分要求操作者熟悉该检测方法，以判断所获取的图像是否适用于本分析流程。可以偏离本方案中使用的图像采集参数设置；然而，这可能需要对参数设置和线虫训练集进行相应调整。本分析流程能够区分不同大小的聚集体以及相互接触的聚集体，从而减少聚集体之间发生&#34;融合&#34;的情况，并最终提高检测灵敏度。然而，在识别超出可接受尺寸范围的大聚集体时可能会出现问题，因为扩大上限尺寸阈值可能导致识别错误，例如无法区分相互接触的聚集体。在进行图像分析之前，必须在准确性、尺寸和强度之间找到平衡。通过引入机器学习构建能够增强聚集体检测能力的神经网络，可进一步提高聚集体识别的效率。目前正积极探索此类改进措施，未来将有助于解决现有难题，例如位于不同焦平面或具有异常形态的聚集体的检测问题。
所述方法的一个显著缺点是自动聚集体计数存在变异性，因为在饲喂不同细菌菌株的线虫中，这些结果并不总能通过人工计数重现。例如，根据自动计数结果，饲喂P. aeruginosa突变株53（M53）的线虫相比野生型菌株（MPAO1）具有显著更少的聚集体（图7）；然而，对该阳性结果的验证并未显示显著差异（补充图4）。通常情况下，高通量药物筛选具有较高的假阳性率，本方法也不例外26。因此，验证所有潜在阳性结果是该实验方案中的关键步骤。
尽管本实验方案已针对筛选影响宿主蛋白质稳态的细菌的策略进行了优化，但每一步均可进一步修改，以检测基因组RNAi文库、小分子或其他条件的影响。可根据特定筛选策略的需求，在每一步中进行额外的调整。此外，该技术具有一定的灵活性，允许对各个步骤进行优化，以适应特定的模型系统。例如，该方法可拓展应用于其他组织中的polyQ聚集研究，或提取图像中检测到的其他特征，如利用可诱导的荧光报告系统监测基因表达（例如热休克基因）、评估蛋白质的亚细胞定位（例如DAF-16的核定位）、研究其他疾病模型中的蛋白聚集（如Aβ1-42、α-synuclein、TDP-43等），或评估生理表型（如线虫体型大小）。

阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病以及肌萎缩侧索硬化症等与年龄相关的神经退行性蛋白质构象疾病（PCD），其特征是蛋白质错误折叠，进而导致聚集、细胞死亡和组织退化1。尽管蛋白质错误折叠被认为是致病原因，但这些疾病的病因尚不明确。因此，由于对导致疾病发生和进展的因素与条件缺乏了解，有效疗法的开发受到阻碍。近期研究表明，微生物组的变化会影响PCD的发生、进展和严重程度2,3,4。然而，人类甚至小鼠微生物组的复杂性使得开展揭示微生物对宿主确切影响的研究变得困难。因此，常采用更简单的生物体（如Caenorhabditis elegans）作为发现工具5,6,7,8。最近的研究利用C. elegans探讨了细菌对宿主蛋白质稳态及疾病发病机制的影响9,10。细菌定植、毒物兴奋效应和基因组变化是影响多聚谷氨酰胺（polyQ）序列聚集的典型条件示例9,11,12。此外，这些错误折叠的蛋白质聚集体在宿主体内的积累表现出polyQ长度依赖性和年龄依赖性，并与运动能力受损相关9,13。通过相对简单的方法定量荧光标记的点状结构，即可获得有关影响蛋白质折叠与聚集的条件、因素或药物的重要数据。
尽管荧光斑点的定量分析已被证明是一种可靠且相对简单的实验方法，但目前仍面临挑战，即如何建立一种能够促进对影响蛋白质聚集的化合物、细菌或条件进行大规模筛选的实验方案。自动化的C. elegans图像处理与斑点定量分析这一概念并非完全新颖，已有多种实用的辅助工具被开发出来14,15。然而，将培养、图像采集与数据处理流程整合为一体，对于消除实验结果的变异性并实现高通量筛选至关重要。
因此，本论文旨在标准化利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）中多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集的定量方法，作为检测蛋白质稳态（proteostasis）变化的替代指标。该目标通过使用CellProfiler——一种开源图像分析软件16，能够自动识别线虫及蛋白聚集物——来实现，并已整合到一个完整的实验流程中，涵盖线虫培养、图像采集和数据处理。

<table><tbody><tr><td>1.7 mL 微管</td><td>奥林巴斯塑料</td><td>货号#24-282</td><td>微量离心管</td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>GenClone</td><td>货号#12-104</td><td>塑料移液管</td></tr><tr><td>15 mL 离心管，带架</td><td>奥林巴斯塑料</td><td>货号 28-101</td><td>锥形管</td></tr><tr><td>5-氟-2&amp;prime;-脱氧尿苷</td><td>Fisher Scientific</td><td>D2235100MG</td><td>FUDR</td></tr><tr><td>Accu-jet Pro 移液器控制器</td><td>Genesee Scientific</td><td>91-600RB</td><td>移液枪</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号 BP1423-2</td><td>颗粒状琼脂</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>BioRender</td><td></td><td>图形图表生成器</td></tr><tr><td>漂白剂（常规）</td><td>Clorox</td><td>条码# 044600324111，无飞溅漂白剂</td><td>4.5% 次氯酸钠</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;AM140： &lt;em&gt;rmIs132&lt;/em&gt; [&lt;em&gt;unc-54p::q35::yfp&lt;/em&gt;]</td><td>莫里莫托实验室（西北大学）</td><td>AM140，Q35::YFP</td><td>肌肉 polyQ</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;AM738: &lt;em&gt;rmIs297&lt;/em&gt;[&lt;em&gt;vha-6&lt;/em&gt;p::&lt;em&gt;q44&lt;/em&gt;::&lt;em&gt;yfp&lt;/em&gt;; &lt;em&gt;rol-6&lt;/em&gt;(&lt;em&gt;su1006&lt;/em&gt;)]</td><td>莫里莫托实验室（西北大学）</td><td>AM738，Q44::YFP</td><td>肠道多聚谷氨酰胺</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sub&gt;&amp;middot;&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号#C79-500</td><td>二水合氯化钙</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>布罗德研究所</td><td></td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号#ICN10138201</td><td>胆固醇</td></tr><tr><td>循环水浴头</td><td>Lauda</td><td>26LE</td><td>Lauda E 100</td></tr><tr><td>CoolLED pE300lite 365 直接安装件 STEREO</td><td>CoolLED</td><td>8114931</td><td>荧光光源控制与发射器</td></tr><tr><td>16 mL 培养管</td><td>奥林巴斯塑料</td><td>21-129</td><td>培养管，17 mm × 100 mm</td></tr><tr><td>大肠杆菌 OP50</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心</td><td>OP50</td><td>&lt;em&gt;大肠杆菌 &lt;/em&gt;对照菌株</td></tr><tr><td>乙醇，200 证明</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>目镜 10x/23B，可调，3 代</td><td>徕卡显微系统</td><td>10450910</td><td>目镜组</td></tr><tr><td>滤光片组 ET GFP - MZ10F</td><td>徕卡显微系统</td><td>10450588</td><td>滤光片组</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v9.2.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>统计分析工具</td></tr><tr><td>Heratherm 培养箱 IMP180</td><td>热</td><td>51031562</td><td>冷藏培养箱</td></tr><tr><td>Innova 4000</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>M1192-0000</td><td>摇床培养箱</td></tr><tr><td>K5 相机</td><td>徕卡显微系统</td><td>11547112</td><td>体视显微镜相机</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;P0&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号 P285-3</td><td>磷酸二氢钾</td></tr><tr><td>LAS X 成像软件</td><td>徕卡显微系统</td><td></td><td>显微镜成像软件</td></tr><tr><td>徕卡 MZ10 F 光学载具</td><td>徕卡显微系统</td><td>10450103</td><td>体视显微镜</td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号#0215522805</td><td>盐酸左旋咪唑</td></tr><tr><td>Luria肉汤（Lennox）</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>货号#11-125</td><td>LB</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-49S</td><td>磁力搅拌器</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&amp;middot;&lt;/sub&gt;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14491</td><td>七水合硫酸镁</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>首映</td><td>8205</td><td>单面磨砂载玻片</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&amp;middot;&lt;/sub&gt;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号 S373-500</td><td>磷酸氢二钠七水合物</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号 S671-500</td><td>氯化钠</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号 S318-3</td><td>氢氧化钠颗粒</td></tr><tr><td>平场消色差物镜，f = 100 mm</td><td>徕卡显微系统</td><td>10411597</td><td>物镜镜头</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat#32-107G</td><td>100 mm × 15 mm</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; 突变体文库</td><td>马诺伊尔实验室（华盛顿大学）</td><td></td><td>&lt;em&gt;P. aeruginosa&lt;/em&gt; 突变体文库</td></tr><tr><td>24孔平底悬浮培养板</td><td>奥林巴斯塑料</td><td>25-102</td><td>用于线虫培养与成像</td></tr><tr><td>三目镜筒 100% M系列</td><td>徕卡显微系统</td><td>10450043</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>ThermoFisher，Difco</td><td>货号#211921</td><td></td></tr><tr><td>TX-400 转子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号#75003181</td><td>摆桶式转子</td></tr><tr><td>真空驱动滤膜系统</td><td>GenClone</td><td>货号#25-227</td><td>500 mL，PES 膜，0.22 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>C-Mount 视频物镜</td><td>徕卡显微系统</td><td>10447367</td><td>0.63倍相机适配接头</td></tr></tbody></table>

自动化聚集体定量分析 秀丽隐杆线虫

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

神经退行性蛋白质构象病（PCD）患病率的上升多年来引发了人们对这一领域的极大关注。这种日益增长的关注促使人们需要开发并改进能够重现人类PCD疾病表型的动物模型。尽管小鼠模型已被证明具有重要价值，但其成本高昂，且相关实验方法繁琐、通量较低。利用线虫Caenorhabditis elegans研究PCD的优势在于其易于培养、成本低且繁殖周期短，适合高通量应用。此外，C. elegans与人类基因组之间高度保守，使该模型成为极具价值的发现工具。表达荧光标记的组织特异性多聚谷氨酰胺（polyQ）片段的线虫会表现出年龄依赖性和polyQ长度依赖性的蛋白聚集现象，表现为荧光焦点。这类报告系统常被用作监测不同组织中蛋白质稳态变化的替代指标。人工进行聚集体定量耗时较长，限制了实验通量；此外，由于聚集体识别具有高度主观性，人工焦点计数可能引入偏差。本文建立了一套标准化流程，包括线虫培养、图像采集和数据处理，以支持对表达肠道特异性polyQ的C. elegans进行高通量聚集体定量分析。通过采用基于C. elegans的图像处理流程（使用图像分析软件CellProfiler），该方法已优化为可分离并识别单个线虫，并统计其各自的聚集体数量。尽管自动化概念并非完全新颖，但为实现可重复性、消除人工计数带来的偏差以及提高通量，标准化此类操作流程的需求十分迫切。预计这些方法可显著简化利用C. elegans模型对大型细菌库、基因组文库或药物库的筛选过程。

以下方案描述了一种高通量工作流程的建立与优化，用于线虫培养、荧光成像及自动图像处理，以定量多聚谷氨酰胺聚集物，从而评估蛋白质稳态的变化。

神经退行性蛋白质构象病（PCDs）患病率的上升多年来引发了人们对这一领域的极大关注。这一……

通过评估多聚谷氨酰胺聚集并建立可用于高通量应用的框架，采用了一种简单的方法来监测蛋白质稳态的变化。对诸如聚集体数量等表型进行人工计分（I）可能具有主观性。自动化聚集体计数可帮助我们消除此类偏差，提高通量和可重复性。该方法有助于鉴定导致宿主蛋白质稳态紊乱的细菌基因。了解单个细菌基因的作用将有助于我们理解其在阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等疾病发病机制中的意义。首先从冰箱中取出含有线虫的培养板，在室温下使其解冻。成像前擦去多余的冷凝液，并取下盖子。使用显微镜设置，曝光时间为500毫秒，放大倍数为40倍，配备0.63倍相机适配器，图像采集时GFP强度设为100%。然后调节透射光控制，使线虫相对于暗背景明亮清晰，避免过度曝光。使用10微升移液器吸头轻轻推动线虫至所需位置，以调整孔内线虫的分布，防止过度聚集。将通道设置为GFP滤光片，以确定两幅图像的焦平面。采集明场图像。在不移动培养板或改变显微镜焦距的情况下，拍摄相应的荧光图像。接下来进行图像分析时，首先下载 CellProfiler 软件。打开该软件后，将感兴趣的图像拖放到图像框中。单击文件列表中的图像以打开。选择放大镜工具以高亮显示感兴趣区域，选择箭头图标以测量线虫和聚集物的长度。将鼠标悬停在目标物体上，可在屏幕底部查看其强度值。为了使用 CellProfiler 图像分析流程，请在从 CellProfiler 官方网站下载后，按照文稿中的说明正确命名图像对。下载该流程后，通过选择“文件”、“导入”和“从文件导入流程”将其上传至 CellProfiler。选择“untangled worms”模块以打开其设置，加载用于在“untangled worms”模块中识别线虫的训练集。然后确定训练集文件名。选择上传文件图标，同时上传补充文件。通过点击左上角的图像模块来上传图片。然后正确命名图像并将其拖放至指定区域。在分析图像之前，点击程序左下角附近的输出设置按钮，选择用于存储结果的期望输出文件夹。接着点击默认输出路径右侧的文件夹图标，以选择所需的输出位置。单击“分析图像”图标以开始图像分析。如果分析耗时过长，并且在处理某单张图像时停滞，则中止运行，并通过检查输出文件夹来确定未处理的图像，注意哪个图像名称缺失。分析完成后，软件会将结果整理到一个 Excel 表格中，其中第 N 列包含各个线虫，第 K 列包含相应的聚集体数量。下载元数据整理工具，以便便捷地整理来自 CellProfiler 输出 CSV 文件的数据。对于 Windows 操作系统，找到下载的文件并将其解压到目标位置。找到并打开名为 gui_Windowsos_64x 的解压文件夹，然后通过点击 GUI 应用程序图标来启动该应用程序。可能会弹出提示，要求允许运行。选择“更多信息”，然后点击“仍然运行”。此时，元数据整理器已准备就绪，可拖放 CellProfiler 输出的 CSV 文件。对于 Mac OS，找到下载的文件并解压文件元数据管理器应用程序文件。打开下载文件夹中解压出的文件夹。右键单击图形用户界面应用程序，然后选择打开。由于缺少正式许可证，系统将弹出提示请求打开权限。请选择打开。在您的元数据整理应用程序于相应操作系统中启动后，点击“在此上传您的文件”，或直接将所需的 CellProfiler CSV 文件拖放至此处。单击“组织”按钮，系统将引导用户进入一个新界面，其中包含一个“下载文件”按钮。单击该按钮并选择保存输出文件的目标位置。输出文件的名称将显示为原始文件名后附加 _organized 扩展名。在存在FUDR的情况下，喂食不同细菌的线虫体形更为一致，从而实现了更均匀和准确的线虫检测，解决了过度拥挤的问题。冷冻线虫可消除背景荧光，提高polyQ聚集体的检测效果，同时使自动计数的准确性与手动计数相当。采用倒置明场照明检测完整的秀丽隐杆线虫（C. elegans），并利用GFP通道对polyQ YFP聚集体进行成像。通过应用优化的CellProfiler图像处理流程，对每条线虫进行虫体检测、解缠绕及聚集体定量，从而获得每条个体线虫中的聚集体数量。自动聚集体定量方法与使用CellProfiler流程的结果差异极小，表明该自动化方法可适用于大规模筛选。在测试的90种细菌菌株中，其中一种候选菌株定植秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道后，显著减少了聚集体的数量。通过人工计数进行的验证实验表明，所有突变体（包括显著减少聚集体数量的突变体）均未影响polyQ的聚集。决定使用该框架的研究人员应明确，所列出的步骤并非绝对不变。成功应用的关键在于对CellProfiler的操作进行适当修改，并具备对其操控的基本理解。其他生化方法，例如蛋白质印迹（western blotting），可用于验证多聚谷氨酰胺（polyQ）的聚集。

automating-aggregate-quantification-in-caenorhabditis-elegans

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

自动化秀丽隐杆线虫的聚集定量

突触处聚集的神经递质受体丰度显著影响突触强度。该方法可在单个突触分辨率下，对秀丽隐杆线虫（C.

C. elegans 中突触荧光的自动化定量分析

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大型动物自动化行为分析 秀丽隐杆线虫 使用宽视野追踪平台的群体研究

本研究概述了利用免费提供的图像处理工具，对C. elegans中的突触大小与定位、肌肉形态以及线粒体形态进行定量测量的方法。该方法可使未来在 C.

用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫

本文介绍了一种高通量、快速且可靠的基因表达水平检测方法，适用于单个或批量的 C. elegans...

利用纳米流体技术在单个及批量 C. elegans 样本中进行高通量定量 RT-PCR

本方案描述了检测和定量秀丽隐杆线虫（C. elegans）细胞以膜结合型胞外小体形式释放的大分子聚集体和/或细胞器外排物（约4...

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动物活动量测定实验方法的比较分析 秀丽隐杆线虫 线粒体疾病模型

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本方案可用于对自交型Caenorhabditis线虫进行大规模生态学调查。该方法的主要优势在于能够高效地整理和分析从自然界采集的线虫所关联的生态学与分子数据。...

一种可高度扩展的自交型 Caenorhabditis 线虫生态调查方法

学习使用CellProfiler自动化定量秀丽隐杆线虫中的多聚谷氨酰胺聚集体，以研究蛋白质稳态变化。该方法可高通量筛选影响宿主蛋白质稳态的细菌基因，为神经退行性疾病机制研究提供可靠框架。

自动化聚集体定量分析秀丽隐杆线虫

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自动化聚集体定量分析 秀丽隐杆线虫

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