自动化聚集体定量分析 秀丽隐杆线虫
2021年10月14日
以下方案描述了一种高通量工作流程的建立与优化，用于线虫培养、荧光成像及自动图像处理，以定量多聚谷氨酰胺聚集物，从而评估蛋白质稳态的变化。
通过评估多聚谷氨酰胺聚集并建立可用于高通量应用的框架，采用了一种简单的方法来监测蛋白质稳态的变化。对诸如聚集体数量等表型进行人工计分（I）可能具有主观性。自动化聚集体计数可帮助我们消除此类偏差，提高通量和可重复性。
该方法有助于鉴定导致宿主蛋白质稳态紊乱的细菌基因。了解单个细菌基因的作用将有助于我们理解其在阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等疾病发病机制中的意义。首先从冰箱中取出含有线虫的培养板，在室温下使其解冻。
成像前擦去多余的冷凝液，并取下盖子。使用显微镜设置，曝光时间为500毫秒，放大倍数为40倍，配备0.63倍相机适配器，图像采集时GFP强度设为100%。然后调节透射光控制，使线虫相对于暗背景明亮清晰，避免过度曝光。
使用10微升移液器吸头轻轻推动线虫至所需位置，以调整孔内线虫的分布，防止过度聚集。将通道设置为GFP滤光片，以确定两幅图像的焦平面。采集明场图像。
在不移动培养板或改变显微镜焦距的情况下，拍摄相应的荧光图像。接下来进行图像分析时，首先下载 CellProfiler 软件。打开该软件后，将感兴趣的图像拖放到图像框中。
单击文件列表中的图像以打开。选择放大镜工具以高亮显示感兴趣区域，选择箭头图标以测量线虫和聚集物的长度。将鼠标悬停在目标物体上，可在屏幕底部查看其强度值。
为了使用 CellProfiler 图像分析流程，请在从 CellProfiler 官方网站下载后，按照文稿中的说明正确命名图像对。下载该流程后，通过选择“文件”、“导入”和“从文件导入流程”将其上传至 CellProfiler。选择“untangled worms”模块以打开其设置，加载用于在“untangled worms”模块中识别线虫的训练集。
然后确定训练集文件名。选择上传文件图标，同时上传补充文件。通过点击左上角的图像模块来上传图片。
然后正确命名图像并将其拖放至指定区域。在分析图像之前，点击程序左下角附近的输出设置按钮，选择用于存储结果的期望输出文件夹。接着点击默认输出路径右侧的文件夹图标，以选择所需的输出位置。
单击“分析图像”图标以开始图像分析。如果分析耗时过长，并且在处理某单张图像时停滞，则中止运行，并通过检查输出文件夹来确定未处理的图像，注意哪个图像名称缺失。分析完成后，软件会将结果整理到一个 Excel 表格中，其中第 N 列包含各个线虫，第 K 列包含相应的聚集体数量。下载元数据整理工具，以便便捷地整理来自 CellProfiler 输出 CSV 文件的数据。
对于 Windows 操作系统，找到下载的文件并将其解压到目标位置。找到并打开名为 gui_Windowsos_64x 的解压文件夹，然后通过点击 GUI 应用程序图标来启动该应用程序。
可能会弹出提示，要求允许运行。选择“更多信息”，然后点击“仍然运行”。此时，元数据整理器已准备就绪，可拖放 CellProfiler 输出的 CSV 文件。
对于 Mac OS，找到下载的文件并解压文件元数据管理器应用程序文件。打开下载文件夹中解压出的文件夹。右键单击图形用户界面应用程序，然后选择打开。
由于缺少正式许可证，系统将弹出提示请求打开权限。请选择打开。在您的元数据整理应用程序于相应操作系统中启动后，点击“在此上传您的文件”，或直接将所需的 CellProfiler CSV 文件拖放至此处。
单击“组织”按钮，系统将引导用户进入一个新界面，其中包含一个“下载文件”按钮。单击该按钮并选择保存输出文件的目标位置。输出文件的名称将显示为原始文件名后附加 _organized 扩展名。
在存在FUDR的情况下，喂食不同细菌的线虫体形更为一致，从而实现了更均匀和准确的线虫检测，解决了过度拥挤的问题。冷冻线虫可消除背景荧光，提高polyQ聚集体的检测效果，同时使自动计数的准确性与手动计数相当。采用倒置明场照明检测完整的秀丽隐杆线虫（C. elegans），并利用GFP通道对polyQ YFP聚集体进行成像。
通过应用优化的CellProfiler图像处理流程，对每条线虫进行虫体检测、解缠绕及聚集体定量，从而获得每条个体线虫中的聚集体数量。自动聚集体定量方法与使用CellProfiler流程的结果差异极小，表明该自动化方法可适用于大规模筛选。在测试的90种细菌菌株中，其中一种候选菌株定植秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道后，显著减少了聚集体的数量。
通过人工计数进行的验证实验表明，所有突变体（包括显著减少聚集体数量的突变体）均未影响polyQ的聚集。决定使用该框架的研究人员应明确，所列出的步骤并非绝对不变。成功应用的关键在于对CellProfiler的操作进行适当修改，并具备对其操控的基本理解。
其他生化方法，例如蛋白质印迹（western blotting），可用于验证多聚谷氨酰胺（polyQ）的聚集。
概述
本研究建立了一种高通量工作流程，用于线虫培养、荧光成像及自动图像处理，以定量多聚谷氨酰胺聚集物，作为蛋白质稳态变化的衡量指标。该方法提高了对这些聚集物的评估能力，尤其有助于探索其在神经退行性疾病中的作用。
关键研究组成部分
研究领域
- 蛋白质稳态
- 神经退行性疾病
- 高通量筛选
背景
- 多聚谷氨酰胺聚集与阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等疾病相关。
- 理解细菌基因在蛋白质稳态失调中的作用至关重要。
- 传统的聚集体评分方法可能具有主观性。
使用的方法
- 使用 CellProfiler 进行高通量成像与分析
- 以秀丽隐杆线虫（C. elegans）作为生物模型
- 多聚谷氨酰胺聚集物的自动化定量
主要结果
- 自动图像处理可消除偏差，并提高聚集体计数的可重复性。
- 鉴定出影响宿主蛋白质稳态的细菌基因，在线虫聚集体数量方面取得重要发现。
- 验证结果表明，自动化方法与人工计数相当，适用于大规模筛选。
结论
- 本研究为通过多聚谷氨酰胺聚集研究蛋白质稳态提供了可靠的框架。
- 通过该方法获得的见解有助于理解神经退行性疾病中的相关机制。
常见问题
行业重要性概述
在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中实现聚集体定量的自动化，满足了神经退行性疾病模型中对高通量、无偏倚的蛋白质稳态评估的需求。通过标准化图像采集和基于CellProfiler的分析，该方法能够对大规模化合物库或基因库进行可重复的筛选，从而支持蛋白质构象疾病发现流程中的早期靶点验证和机制性风险排除。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化多聚谷氨酰胺聚集作为蛋白质稳态紊乱的替代指标，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：减少表型评分中的主观性，提高靶点验证研究中数据的可靠性。
- 预测价值：提供基于机制的化合物优先排序所需的定量、可重复的读数，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成每条线虫标准化的定量聚集体计数，为筛选实验提供可靠的检测读数。
- 操作价值：通过自动化提高通量和可重复性，减少人工操作和操作者间的差异。
- 检测适用性：产生结构化输出结果（包含线虫和聚集体计数的 Excel 表格），可与下游数据分析流程兼容。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过保守的多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集通路，将秀丽隐杆线虫（C. elegans）的蛋白质稳态模型与人类神经退行性疾病机制相联系。
- 机制性风险降低：有助于鉴定影响聚集的细菌或遗传修饰因子，支持在疾病相关系统中进行靶点验证。
- 预测可信度：使跨职能团队能够利用标准化、自动化的聚集体定量方法比较不同实验条件。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物筛选的整个发现流程，可提供定量的蛋白质稳态读数，为决策提供依据。
- 发现生物学：通过实现客观、高含量的聚集表型分析，支持对蛋白质稳态机制的假设验证。
- 筛选：提供即用型、标准化的线虫成像与分析流程，适用于96孔板或更大通量的筛选实验。
- 分析：生成可量化的因变量测量结果（每条线虫的聚集物数量），从而实现不同实验条件间的统计学比较。
- 转化研究：通过保守的聚集生物学机制，将无脊椎动物模型的研究发现与人类疾病通路相联系。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像与分析流程，可适配多种蛋白质稳态靶点及多轮筛选项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过消除人工聚集体计数带来的偏倚，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化图像处理和自动化数据输出，增强实验的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过减少操作时间、提高数据质量，实现大规模筛选，从而提升资本使用效率。
- 项目组合影响：提供可靠且定量的蛋白质稳态生物标志物，支持基于风险评估的推进决策。
实施注意事项
- 需要熟悉用于多聚谷氨酰胺（polyQ）检测的荧光显微镜及GFP/YFP成像参数。
- 依赖于CellProfiler软件及其相关流程配置，以实现线虫及聚集体的自动分割。
- 需要标准化的图像命名规则和文件夹组织结构，以确保批量处理顺利进行。
- 采用FUDR处理有助于减少线虫大小的变异性，提高高密度孔板中检测的准确性。
- 需要用户接受培训，以针对不同线虫品系、表达模式或成像系统对分析流程进行调整。
