Name: 使用微流体装置生产siRNA负载的脂质纳米颗粒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 学习使用iLiNP微流体装置生产siRNA负载的脂质纳米颗粒，精确控制粒径在20至100纳米之间。该方法可实现95%的包封效率和有效的基因沉默，为RNA递送系统的标准化生产提供可靠方案。

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本工作得到了日本科学技术振兴机构（JST）创造研究推进项目（CREST）资助号 JPMJCR17H1、日本科学技术振兴机构（JST）先驱性研究项目（PRESTO）资助号 JPMJPR19K8、日本科学技术振兴机构（JST）SCORE 项目、日本文部科学省专项教育与研究经费、日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金资助号 JP19KK0140，以及池谷科学技术振兴财团的支持。

1. iLiNP 装置的制备
注意：iLiNP 装置采用标准的软光刻方法制备18。详细的制备方案此前已有报道10,13。
<ol>
	<li>SU-8模具制备
	<ol>
		<li>将SU-8 3050倾倒至3英寸硅片上，通过旋涂获得厚度为100 µm的SU-8层。</li>
		<li>将硅片置于热板上，在65 °C下预烘5分钟，随后在95 °C下烘烤45分钟。</li>
		<li>烘烤后，将硅片放置于台式无掩模光刻系统的载物台上。</li>
		<li>在微通道的每个分段照射区域（一个位置）使用365 nm紫外光照射1.5秒。 
		注：本实验采用台式无掩模光刻系统，该系统可自动对微通道的分段照射区域（一个位置）进行紫外曝光。</li>
		<li>紫外曝光后，将硅片置于热板上，在65 °C下烘烤1分钟，随后在95 °C下烘烤5分钟。</li>
		<li>冷却硅片，然后将其浸入SU-8显影液中15分钟，以去除未曝光的SU-8材料。</li>
		<li>使用干燥器和真空泵，对SU-8模具进行三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷蒸气处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>iLiNP器件的制备
	<ol>
		<li>按10:1（质量比）混合硅胶基质与聚二甲基硅氧烷（PDMS）固化剂。</li>
		<li>使用真空泵和干燥器对混合物进行脱气处理。 
		​注：PDMS在室温下使用真空泵脱气10分钟。</li>
		<li>将脱气后的PDMS倒入盛有SU-8模具的100 mm培养皿中，厚度控制在0.5至1 cm，随后在80 °C烘箱中烘烤1小时。</li>
		<li>冷却模具后，使用镊子将PDMS基底从SU-8模具上剥离。</li>
		<li>在PDMS基底上打三个孔（直径0.5 mm），并通过氧等离子体清洗仪将PDMS基底与玻璃载片键合，构建iLiNP器件（见图1）13。</li>
		<li>将三根PEEK毛细管（内径0.3 mm，外径0.5 mm）连接至iLiNP器件的进样口和出样口，并用瞬干胶固定。 
		​注：PEEK毛细管的长度可根据实验需求调整。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脂质溶液的制备
<ol>
	<li>配制脂质/乙醇溶液：13.4 mM 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（POPC）、10 mM 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DSPC）、20 mM 1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）、5 mM 1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2k）和 20 mM 胆固醇。实验前将储备液储存于 -20 °C。</li>
	<li>为制备载有 siRNA 的脂质纳米颗粒（LNP），按 50/10/38.5/1.5 的摩尔比混合 DOTAP、DSPC、胆固醇和 DMG-PEG2k 溶液。总脂质浓度调整至 8 mM。</li>
</ol>
3. 水溶液的配制
<ol>
	<li>配制水溶液：使用无 DNase/RNase 的蒸馏水配制 154 mM NaCl（生理盐水）和 pH 4.0 的 25 mM 乙酸盐缓冲液。</li>
	<li>使用 0.2 µm 孔径的膜滤器或注射器滤器过滤上述溶液。</li>
</ol>
4. siRNA/缓冲液溶液的制备
<ol>
	<li>将70 µg siGL4溶解于1 mL 25 mM乙酸盐缓冲液（pH 4.0）中。 
	注意：siGL4用于敲低荧光素酶基因。</li>
</ol>
iLiNP 装置的设置与脂质纳米颗粒（LNPs）的制备
注意：示意图参见图1。
<ol>
	<li>分别用1 mL玻璃注射器吸取脂质溶液和水相溶液（来自步骤3.1和4.1，分别装入不同的注射器）。 
	注意：根据LNP评价实验所需用量，调整脂质溶液和水相溶液的体积。</li>
	<li>使用注射器连接器将玻璃注射器与PEEK毛细管连接。</li>
	<li>设定脂质溶液和水相溶液的流速。 
	注意：水相与脂质相的流速比（FRR）范围为3:1至9:1。</li>
	<li>通过注射泵将脂质溶液和水相溶液分别引入iLiNP装置中。</li>
	<li>从iLiNP装置的出口处收集LNP悬浮液至微量离心管中（图1）。</li>
</ol>
6. LNP 悬液的透析及 LNP 粒径测定
<ol>
	<li>将LNP悬浮液在4 °C条件下，分别使用透析膜（12−14 kDa分子量截断值）对生理盐水（用于POPC LNP）或D-PBS（用于siRNA负载的LNP）透析过夜。 
	注意：POPC不溶于生理盐水（详见2.1节）。POPC/乙醇溶液在iLiNP装置中用生理盐水稀释。</li>
	<li>将透析后的LNP悬浮液收集至微量离心管中。</li>
	<li>用移液器将20–30 µL的LNP悬浮液转移至微量石英比色皿中。</li>
	<li>通过动态光散射（DLS）测定LNP的粒径、粒径分布及多分散系数。</li>
</ol>
7. LNP Z电位的测定
注意：测量Z电位时，按照制造商说明书使用粒径分析仪（见材料表）。
<ol>
	<li>用10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）将步骤6.1中获得的LNP悬浮液稀释35倍。</li>
	<li>用移液器将700至1000 µL稀释后的LNP悬浮液转移至毛细管池中。</li>
	<li>按照制造商的说明测量Z电位。</li>
</ol>
8. 利用RiboGreen法检测siRNA包封效率
注意：采用RiboGreen检测法评估siRNA在脂质纳米颗粒（LNP）中的包封情况19。RiboGreen检测法可在有或无表面活性剂（如Triton X-100）的条件下，测定LNP内外RNA的含量。
<ol>
	<li>用 10 mM HEPES 缓冲液（pH 7.4）将 2 mg/mL 的 siGL4 稀释至 500 ng/mL 的 siGL4 溶液。</li>
	<li>制备 siGL4 溶液的系列稀释液（0、12.5、25、50、100、200 ng/mL），用于绘制 Triton (+) 和 Triton (-) 样品的标准曲线。</li>
	<li>用 10 mM HEPES 缓冲液（pH 7.4）将 LNP 悬液稀释 100 倍。</li>
	<li>配制 Triton (+) 溶液：每 10 个 96 孔微孔板孔，混合 980 µL 的 10 mM HEPES（pH 7.4）、20 µL 的 10% w/v TritonX-100 和 1.25 µL RiboGreen。</li>
	<li>配制 Triton (-) 溶液：每 10 个 96 孔微孔板孔，混合 1000 µL 的 10 mM HEPES（pH 7.4）和 1.25 µL RiboGreen。</li>
	<li>将 siGL4 溶液的系列稀释液和稀释后的 LNP 悬液各取 100 µL 加入黑色 96 孔微孔板的孔中。 
	注：每种条件下，siGL4 溶液的系列稀释液和稀释后的 LNP 悬液分别加入四个微孔。</li>
	<li>向各孔中加入 100 µL 检测溶液（TritonX-100 (+) 或 Triton (-)）。 
	注：每种样品条件下的每个样本，TritonX-100 (+) 溶液加入两个孔，TritonX-100 (-) 溶液加入剩余的两个孔。</li>
	<li>将微孔板在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>使用微孔板读数仪在 475 nm 波长下测定荧光强度。</li>
	<li>根据以下公式计算 siRNA 包封效率19。 
	<img alt="siRNA 包封效率公式；使用 Triton 分析 siRNA 浓度用于研究。" src="/files/ftp_upload/62999/62999eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"></li>
</ol>
9. 细胞培养
<ol>
	<li>配制含有DMEM、10%热灭活胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和400 µg/mL G418的生长培养基。</li>
	<li>将稳定表达萤火虫和海肾荧光素酶（HeLa-dluc）的HeLa细胞在含有上述生长培养基的100 mm组织培养处理过的细胞培养皿中，于37 °C、5% CO2培养箱中进行培养。</li>
</ol>
10. 细胞活力检测
<ol>
	<li>在96孔微孔板中接种100 µL HeLa细胞悬液（含6 x 103 个细胞/孔），使用生长培养基。 
	注：细胞计数采用细胞计数板和显微镜进行。</li>
	<li>将微孔板置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>用不含胎牛血清的DMEM培养基将载有siRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）稀释至siRNA终浓度为10和100 nM。</li>
	<li>每孔加入100 µL稀释后的载siRNA LNPs悬液。</li>
	<li>将微孔板置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育4小时。</li>
	<li>移除LNPs悬液，每孔加入100 µL含胎牛血清的DMEM培养基（FBS (+)）。</li>
	<li>将微孔板置于37 °C、5% CO2 培养箱中继续孵育20小时。</li>
	<li>根据试剂盒生产商提供的操作说明，使用市售试剂盒检测细胞活力。 
	注：以不含钙镁离子的D-PBS缓冲液（D-PBS (-)）作为阴性对照。</li>
</ol>
11. 荧光素酶基因敲低实验
<ol>
	<li>在96孔微孔板中接种75 µL HeLa细胞悬液（含4.5 × 103 个细胞/孔），使用生长培养基。</li>
	<li>将微孔板置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>用不含胎牛血清的DMEM将载有siRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）稀释至siRNA终浓度为10和100 nM。</li>
	<li>每孔加入75 µL稀释后的载siRNA LNPs悬液。</li>
	<li>将微孔板置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育4小时。</li>
	<li>移除LNPs悬液，并每孔加入75 µL含胎牛血清的DMEM（FBS (+)）。</li>
	<li>将微孔板置于37 °C、5% CO2 培养箱中继续孵育20小时。</li>
	<li>根据试剂盒生产商提供的操作说明，使用市售试剂盒检测荧光素酶表达水平。 
	注意：本实验使用D-PBS (-) 作为阴性对照。</li>
</ol>

<ol><li>Schoenmaker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-lipid+nanoparticle+COVID-19+vaccines%3A+Structure+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability.</a> International Journal of Pharmaceutics. 601, 120586(2021).</li>
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<li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237(2020).</li>
<li>Cabral, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+sub-100+nm+polymeric+micelles+in+poorly+permeable+tumours+depends+on+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size.</a> Nature Nanotechnology. 6 (12), 815-823 (2011).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+physicochemical+properties+and+potency+of+siRNA-loaded+small-sized+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the physicochemical properties and potency of siRNA-loaded small-sized lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Journal of Controlled Release. 229, 48-57 (2016).</li>
<li>Kimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional%2C+symmetrically+assembled+microfluidic+device+for+lipid+nanoparticle+production%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional, symmetrically assembled microfluidic device for lipid nanoparticle production.</a> RSC Advances. 11 (3), 1430-1439 (2021).</li>
<li>Maeki, M., Kimura, N., Sato, Y., Harashima, H., Tokeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+microfluidics+for+lipid+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+and+applications+in+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in microfluidics for lipid nanoparticles and extracellular vesicles and applications in drug delivery systems.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 128, 84-100 (2018).</li>
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<li>Maeki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+formation+mechanism+of+lipid+nanoparticles+in+microfluidic+devices+with+chaotic+micromixers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Understanding the formation mechanism of lipid nanoparticles in microfluidic devices with chaotic micromixers.</a> PLoS One. 12 (11), 0187962(2017).</li>
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<li>Kimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+iLiNP+Device%3A+Fine+Tuning+the+Lipid+Nanoparticle+Size+within+10+nm+for+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Development of the iLiNP Device: Fine Tuning the Lipid Nanoparticle Size within 10 nm for Drug Delivery.</a> ACS Omega. 3 (5), 5044-5051 (2018).</li>
<li>Kimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microfluidic-based+post-treatment+process+for+size-controlled+lipid+nanoparticles+and+application+to+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Development of a microfluidic-based post-treatment process for size-controlled lipid nanoparticles and application to siRNA delivery.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (30), 34011-34020 (2020).</li>
<li>Hashiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+design+of+experiments+with+multiple+responses+to+determine+optimal+formulations+for+in+vivo+hepatic+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">The use of design of experiments with multiple responses to determine optimal formulations for in vivo hepatic mRNA delivery.</a> Journal of Controlled Release. 327, 467-476 (2020).</li>
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<li>Kimura, N., Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Tokeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+production+using+a+microfluidic+device+of+highly+biocompatible+size-controlled+noncationic+exosome-like+nanoparticles+for+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">One-step production using a microfluidic device of highly biocompatible size-controlled noncationic exosome-like nanoparticles for RNA delivery.</a> ACS Applied Bio Materials. 4 (2), 1783-1793 (2021).</li>
<li>Deng, T., Wu, H., Brittain, S. T., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+masks%2C+masters%2C+and+stamps%2Fmolds+for+soft+lithography+using+an+office+printer+and+photographic+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Prototyping of masks, masters, and stamps/molds for soft lithography using an office printer and photographic reduction.</a> Analytical Chemistry. 72 (14), 3176-3180 (2000).</li>
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<li>Mijajlovic, M., Wright, D., Zivkovic, V., Bi, J. X., Biggs, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+hydrodynamic+focusing+based+synthesis+of+POPC+liposomes+for+model+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Microfluidic hydrodynamic focusing based synthesis of POPC liposomes for model biological systems.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 104, 276-281 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

LNP 的尺寸会影响其在体内的分布、抗肿瘤效果以及基因沉默效率。因此，LNP 尺寸控制技术是制备包括RNA递送系统在内的DDS纳米药物的重要方法。本文旨在介绍利用iLiNP装置实现LNP尺寸的精确调控，并将其应用于载siRNA的LNP的制备。iLiNP装置能够将LNP的尺寸控制在20至100 nm范围内（图2）13。当通过改变总流速和流速比（FRR）等流动条件来调控LNP尺寸时，应在流动状态稳定约5至10秒后开始收集LNP悬液。从iLiNP装置出口收集的LNP悬液需立即进行透析处理，以缓冲液置换除去乙醇，防止LNP发生聚集。
LNP 尺寸控制是药物递送系统（DDS）领域的主要挑战之一。通常，传统的 LNP 制备方法（如脂质膜水化法）在 LNP 制备完成后需要进行尺寸调节步骤20另一方面，基于微流控的LNP制备方法可通过将脂质溶液和水相溶液引入微流控装置，实现对LNP粒径的控制。6,11,13尽管透析过程是去除LNP悬浮液中乙醇所必需的，但通过微流控装置与切向流系统联用的连续化工艺有望实现LNP制备过程的自动化。14根据文献报道，使用聚焦流动微流控装置制备的POPC脂质纳米粒（LNP）尺寸分别为50–60 nm和30–60 nm21 以及混沌混合装置10与其他微流控装置相比，iLiNP 装置能够将 POPC LNP 的粒径控制在 20 至 100 nm 的较宽范围内。
本研究中采用的iLiNP装置的制备工艺为标准的软光刻技术。因此，iLiNP装置可通过快速成型技术实现大规模生产，并通过使用一次性装置避免溶液间的交叉污染。iLiNP装置可像POPC脂质纳米颗粒（LNP）制备方法一样，用于制备载有siRNA的LNPs。利用iLiNP装置进行LNP制备时，操作者无需任何复杂的操作步骤。基于上述原因，包括iLiNP装置在内的基于微流控的LNP制备方法有望成为标准的LNP制备方法。本文所述的实验方案也可适用于其他用于LNP制备的微流控装置。此外，通过将siRNA/缓冲液替换为含有mRNA的缓冲液，同样可实现载有mRNA的LNPs的制备。

脂质纳米颗粒（LNP）是RNA递送系统中最常用的纳米载体之一。最近，装载mRNA的LNP已被批准作为预防新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的疫苗1,2,3。通常情况下，LNP的尺寸在其生物分布和药物递送系统（DDS）性能中起着关键作用，包括基因沉默或蛋白表达4,5,6。因此，在LNP的生产过程中需要一种精确的尺寸控制方法。
多年来，为了制备尺寸可控的脂质纳米颗粒（LNPs），微流控装置受到了广泛关注7。2018年，首个经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的载有siRNA的LNPs（例如Onpattro）即采用微流控装置开发而成8,9。在基于微流控的LNPs制备方法中，脂质溶液与水相溶液分别被引入微流控装置，随后在微通道内混合。为了提高混合效率，已采用混沌混合器装置用于LNPs的制备10,11,12。该混沌混合器装置可实现特定尺寸LNPs的制备。
一种名为侵入式脂质纳米颗粒制备（invasive lipid nanoparticle production, iLiNP）的简单微流控装置，配备挡板结构，已被开发用于精确控制脂质纳米颗粒（LNP）的粒径13,14。与混沌混合器装置相比，iLiNP 装置能够在 10 nm 间隔下将 LNP 粒径控制在 20 至 100 nm 范围内。此外，iLiNP 装置可制备载有 siRNA 的 LNPs6、载有 mRNA 的 LNPs15、载有核糖核蛋白的 LNPs16以及类似外泌体的 LNPs17。本文旨在介绍 iLiNP 装置的 fabrication（制备）及其载 siRNA 的 LNP 制备流程，并描述由该装置所制备的 LNP 的评价过程。

<table><tbody><tr><td>1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）</td><td>NOF Corp.</td><td>MC-6081</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2K）</td><td>NOF Corp.</td><td>GM-020</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）</td><td>NOF Corp.</td><td>CL-8181TA</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DSPC）</td><td>NOF Corp.</td><td>MC-8080</td><td></td></tr><tr><td>10 × D-PBS（-）</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>048-29805</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Blue 细胞活力检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667-5G</td><td></td></tr><tr><td>桌面无掩模光刻系统</td><td>NEOARK CORPORATION</td><td>DDB-701-DL4</td><td></td></tr><tr><td>透析膜</td><td>Repligen</td><td>132697</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Glo 荧光素酶检测试剂系统</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>批号：42G6587K</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08973-14</td><td></td></tr><tr><td>玻璃基板</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>玻璃注射器</td><td>Hamilton</td><td>GASSTIGHT 1002</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td></td><td></td><td>HeLa-dluc 细胞由北海道大学的 Yusuke Sato 博士提供</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>低糖 Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td></td></tr><tr><td>氧气等离子体清洗仪</td><td>Femto Science</td><td>CUTE-1MP/R</td><td></td></tr><tr><td>青霉素&amp;ndash;链霉素，胰蛋白酶（2.5%）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen RNA 定量试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R11491</td><td></td></tr><tr><td>siGL4</td><td>北海道系统科学有限公司</td><td>siGL4 的正义链和反义链序列分别为 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT&lt;br/&gt; -3' 和 5'-UUGCUCACGAAUACGACGGTsT&lt;br/&gt; -3'。</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>GTC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SILPOT 184 W/C（PDMS）</td><td>Dow Corning Toray Co., Ltd.</td><td></td><td>包含硅胶基料和固化剂</td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>192-01075</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>日本化药株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器连接头</td><td>微化学技术研究所有限公司</td><td>ISC-011</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Chemyx</td><td>CX07200</td><td></td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&amp;nbsp; 无 DNase/RNase 蒸馏水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>&amp;nbsp;Malvern Instruments</td><td>ZEN3600</td><td></td></tr></tbody></table>

使用微流控装置制备装载sirna的脂质纳米颗粒

Production of siRNA-Loaded Lipid Nanoparticles using a Microfluidic Device

功能性脂质纳米颗粒（LNPs）的开发是药物递送系统（DDS）领域的主要挑战之一。近年来，基于LNPs的RNA递送系统，即RNA负载型LNPs，因其在RNA治疗中的潜力而受到广泛关注。特别是，mRNA负载型LNP疫苗已获批准用于预防新型冠状病毒肺炎（COVID-19），推动了下一代纳米药物研发的范式转变。对于基于LNPs的纳米药物而言，LNP的粒径是调控其体内分布及性能表现的关键因素。因此，在LNP的制备过程中，精确的粒径控制技术至关重要。本文报道了一种利用名为iLiNP的微流控装置实现粒径可控的LNP制备方案。同时，也采用iLiNP装置制备了siRNA负载型LNPs，并对其进行了评估 体外 实验。展示了LNP粒径的代表性结果，包括载有siRNA的LNPs、Zeta电位、siRNA包封效率、细胞毒性及靶基因沉默活性。

图2A、B展示了在不同流体条件下制备的POPC脂质纳米颗粒（LNP）的粒径分布。基于微流控技术的LNP制备方法可通过总流速（TFR）和流速比（FRR）等流体条件来调控LNP的粒径。与典型的微流控装置（包括混沌混合器装置和流动聚焦式微流控装置）相比，iLiNP装置能够实现对LNP粒径的精确调控，粒径范围可控制在20至100 nm之间（图2）。在较高的总流速条件下会形成较小粒径的LNP。此外，无论总流速如何，在FRR为5时形成的LNP粒径均小于FRR为3时的粒径13。
使用iLiNP装置制备了载有siRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）（图3A）。在制备载siRNA的LNPs时，采用了阳离子脂质DOTAP，以有效将siRNA包封入LNPs中。iLiNP装置生成了粒径为90 nm、分布均一的载siRNA阳离子LNPs（图3A、B）。由于阳离子脂质与带负电荷的siRNA之间存在静电相互作用，siRNA的包封效率达到95%（图3C）。
如图4和图5所示，评估了90 nm大小的载siRNA脂质纳米颗粒（LNPs）的细胞毒性和基因沉默活性。载siRNA的LNPs在10和100 nM siRNA剂量下表现出一定的细胞毒性。我们还证实，荧光素酶的表达水平随siRNA浓度的增加而降低。在100 nM siRNA剂量下，载siRNA的LNPs可抑制80%的荧光素酶表达。关于LNP粒径对基因沉默活性的影响，已有文献报道6,13,17。
<img alt="通过脂质-乙醇和siRNA-缓冲液快速稀释制备脂质纳米颗粒悬浮液的微流控芯片示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：（A）iLiNP装置的示意图和（B）实物照片。 iLiNP装置由聚二甲基硅氧烷（PDMS）和玻璃基底构成。该装置通过瞬干胶与PEEK毛细管连接。使用注射泵将脂质溶液与siRNA/缓冲液溶液分别引入iLiNP装置中。脂质纳米颗粒（LNP）悬浮液被收集于微量离心管中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="LNP粒径分布，FRR 3和5；图表显示TFR变化对强度和粒径的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：iLiNP装置在不同流速比（FRR）下生成的POPC LNP粒径分布。 采用动态光散射（DLS）测量POPC LNP的粒径。通过改变总流速和FRR制备POPC LNP：（A）FRR为3，（B）FRR为5。在较高的总流速条件下形成较小粒径的LNP。此外，在FRR为5时形成的LNP粒径小于FRR为3时的粒径。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="LNP表征图表：粒径分布、Zeta电位和siRNA包封效率结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：siRNA负载型LNPs的表征。（A）siRNA负载型LNPs的粒径分布。siRNA（siGL4）通过阳离子脂质（DOTAP）与带负电荷的siRNA之间的静电相互作用被包封到LNPs中。（B）siRNA负载型LNPs的Zeta电位。测量前将LNP悬浮液用10 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）稀释。数据以均值±标准差（SD）表示。n = 3。（C）基于DOTAP的LNPs的siRNA包封效率。包封效率通过RiboGreen法测定。数据以均值±标准差表示。n = 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞活力分析；柱状图；siGL4浓度与对照组比较；测量细胞反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：载siRNA脂质纳米颗粒（LNPs）的细胞毒性。将载siRNA的LNPs用DMEM（不含FBS）稀释，得到siGL4浓度为10和100 nM。将LNP悬液加入HeLa-dLuc细胞中，在37 °C、5% CO2培养箱中孵育4小时。N.T.：未处理组（D-PBS(-)）。数据以均值±标准差表示，n = 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光素酶表达柱状图；siGL4 在 10、100 nM 的剂量反应，与对照 N.T. 比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：经 siRNA 负载的脂质纳米颗粒（LNP）处理后的荧光素酶基因敲低活性。 siRNA 负载的脂质纳米颗粒（LNP）的制备方法与细胞活力检测相同。使用 Dual-Glo 荧光素酶检测试剂系统测定荧光素酶表达水平。N.T.：未处理组（D-PBS(-)）。数据以均值 ± 标准差表示。n = 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

基于微流控技术的脂质纳米颗粒（LNP）制备方法在药物递送系统（DDS）中受到关注，包括RNA递送。本方案描述了使用我们自主研发的名为iLiNP的微流控装置进行LNP（负载siRNA的LNP）的制备、生产及评价过程。

使用微流控装置制备装载siRNA的脂质纳米颗粒

功能性脂质纳米颗粒（LNPs）的开发是药物递送系统（DDS）领域的主要挑战之一。近年来，基于LNP的……

脂质纳米颗粒的大小会影响其在体内的分布、抗肿瘤效果以及基因沉默效率。因此，脂质纳米颗粒尺寸控制方法是制备包括RNA递送系统在内的纳米药物的有效技术。这种名为iLiNP装置的原创微流控设备，能够在10纳米间隔下精确调控脂质纳米颗粒的尺寸，范围从20至100纳米。iLiNP 装置不仅可以制备载有 siRNA 的脂质纳米颗粒（LNP），还可以制备载有 mRNA 的 LNP 以及载有核糖核蛋白的 LNP。首先，取脂质乙醇溶液，通过将 DOTAP、DSPC、胆固醇和 DMG-PEG2k 溶液以 50:10:38.5:1.5 的摩尔比混合，制备载有 siRNA 的 LNP。将总脂质浓度调整至 8 毫摩尔。然后取154毫摩尔的氯化钠水溶液和pH为4的25毫摩尔醋酸盐缓冲液，通过0.2微米的膜滤器或注射器滤器过滤。将70微克siGL4溶解于1毫升25毫摩尔醋酸盐缓冲液中，配制siRNA缓冲液。分别用玻璃注射器吸取1毫升脂质溶液和水相溶液。使用注射器连接器将玻璃注射器连接至峰毛细管，然后设定脂质和水相溶液的流速，利用注射泵将脂质溶液和水相溶液分别引入iLiNP装置。从iLiNP装置的出口处收集LNP悬浮液至微量离心管中。对于POPC脂质纳米颗粒（LNPs）和负载siRNA的LNPs，分别使用截留分子量为12至14千道尔顿的透析膜，在4°C条件下对生理盐水或DPBS缓冲液透析过夜。将透析后的脂质纳米颗粒（LNP）悬浮液收集至微量离心管中，然后用移液器吸取20至30微升LNP悬浮液至微量石英比色皿中。最后，通过动态光散射法测定LNP的粒径、粒径分布及多分散指数。此处展示了在不同流速条件（如总流速和流速比）下制备的POPC LNP的粒径分布。使用该iLiNP装置可精确控制脂质纳米颗粒（LNP）的尺寸，范围为20至100纳米。在总流速较高的条件下可形成较小尺寸的LNP。此外，无论总流速如何，当流速比（FRR）为5时所形成的LNP尺寸均小于FRR为3时所形成的LNP尺寸。此处展示了载有siRNA的脂质纳米颗粒（LNP）的粒径分布。siRNA通过带正电荷的脂质DOTAP与带负电荷的siRNA之间的静电相互作用被包封到LNP中。iLiNP装置制备出粒径约为90纳米、分布狭窄的载siRNA阳离子LNP。由于阳离子脂质与带负电荷的siRNA之间的静电相互作用，siRNA的包封效率达到95%。对载有siRNA的19纳米脂质纳米颗粒（LNPs）的细胞毒性和基因沉默活性进行了评估。载有siRNA的LNPs在10至100纳摩尔siRNA剂量下表现出细胞毒性。荧光素酶的表达水平随siRNA浓度的增加而降低。在100纳摩尔siRNA剂量下，载有siRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）抑制了80%的荧光素酶表达。优化流体条件是本方案中获得理想尺寸脂质纳米颗粒（LNPs）最关键的步骤。基于微流控的LNP制备方法，包括iLiNP装置，无需任何复杂操作步骤，有望成为标准的LNP制备方法。

production-sirna-loaded-lipid-nanoparticles-using-microfluidic

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用微流体装置生产siRNA负载的脂质纳米颗粒

在小鼠中每72小时重复进行眶后静脉注射阳离子脂质体/siRNA/ITSN-1s复合物，持续24天，可高效将siRNA双链递送至小鼠肺微血管系统，使ITSN-1s的mRNA和蛋白表达水平降低75%。该技术在动物模型中具有高度可重复性，无不良反应，且不会导致动物死亡。...

通过阳离子脂质体重复递送特异性siRNA实现小鼠肺组织中Intersectin-1s的长期沉默。利用电子显微镜评估基因敲低效果

关键词：Intersectin-1s，siRNA，阳离子脂质体，肺组织，基因沉默，电子显微镜，基因敲低

本研究描述了一种合成超小生物相容性纳米颗粒群体的方法，以及若干 体外 用于评估其细胞相互作用的方法。...

用于细胞内靶向应用的固体脂质纳米颗粒（SLNs）

本实验方案的目标是利用带有神经靶向肽的阳离子/阴离子脂质体作为中枢神经系统递送系统，使siRNA能够穿过血脑屏障。优化siRNA等治疗方法的递送系统，将为朊病毒病及其他神经退行性疾病提供更多治疗选择。...

使用阳离子和阴离子脂质体将治疗性siRNA递送至中枢神经系统

在此，我们介绍一种基于干膜法制备阳离子纳米脂质体的实验方案，该方法可用于安全高效地递送 体外...

用于高效递送的阳离子纳米脂质体的制备 体外 转录的信使RNA

我们展示了用于高效体外和体内寡核苷酸递送的融合性多孔硅纳米颗粒的合成方法。多孔硅纳米颗粒负载siRNA形成核心，通过挤出法包覆融合性脂质形成外壳。本方法包括靶向配体的功能化修饰及颗粒的表征。...

用于寡核苷酸递送的融合性多孔硅纳米颗粒的合成、功能化与表征

介绍了制备和表征中性电荷、pH响应性siRNA纳米颗粒的理化性质及生物活性的方法。讨论了siRNA纳米药物成功的关键指标，如粒径、形貌、表面电荷、siRNA载药量和基因沉默效果。...

中性电荷、pH响应性聚合物纳米颗粒的制备及其用于细胞质siRNA递送

本方案介绍了利用交错人字形微混合器微流控装置制备热敏脂质体的优化参数。该方法还可实现阿霉素和吲哚菁绿的共包封，并通过光热触发释放阿霉素，从而实现可控/触发式药物释放。...

含溶血磷脂的温度敏感脂质体的微流控制备

采用微流控混合平台方法开发用于mRNA和DNA包封的脂质纳米颗粒。...

利用微流控混合平台制备和表征用于基因递送的脂质纳米颗粒

此处介绍了一种制备包封编码萤火虫荧光素酶mRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）的方案。这些LNPs已用于检测其效能 体外 在 HepG2 细胞中 体内 在 C57BL/6...

测试 体外 和 在体 内 微流控混合法制备mRNA-脂质纳米颗粒的效率

本文演示了一种使用限域撞击射流（CIJ）混合器技术合成脂质纳米颗粒（LNPs）的详细方案，其中包括双射流CIJ和四射流多入口涡流混合器（µMIVM）。CIJ混合器可产生可重复的湍流微混合环境，从而制备出单一分散的LNPs。...

在受限撞击射流混合器中通过湍流合成脂质纳米颗粒

学习使用iLiNP微流体装置生产siRNA负载的脂质纳米颗粒，精确控制粒径在20至100纳米之间。该方法可实现95%的包封效率和有效的基因沉默，为RNA递送系统的标准化生产提供可靠方案。

使用微流控装置制备装载siRNA的脂质纳米颗粒

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