使用微流控装置制备装载siRNA的脂质纳米颗粒

脂质纳米颗粒的大小会影响其在体内的分布、抗肿瘤效果以及基因沉默效率。因此，脂质纳米颗粒尺寸控制方法是制备包括RNA递送系统在内的纳米药物的有效技术。这种名为iLiNP装置的原创微流控设备，能够在10纳米间隔下精确调控脂质纳米颗粒的尺寸，范围从20至100纳米。

iLiNP 装置不仅可以制备载有 siRNA 的脂质纳米颗粒（LNP），还可以制备载有 mRNA 的 LNP 以及载有核糖核蛋白的 LNP。首先，取脂质乙醇溶液，通过将 DOTAP、DSPC、胆固醇和 DMG-PEG2k 溶液以 50:10:38.5:1.5 的摩尔比混合，制备载有 siRNA 的 LNP。将总脂质浓度调整至 8 毫摩尔。

然后取154毫摩尔的氯化钠水溶液和pH为4的25毫摩尔醋酸盐缓冲液，通过0.2微米的膜滤器或注射器滤器过滤。将70微克siGL4溶解于1毫升25毫摩尔醋酸盐缓冲液中，配制siRNA缓冲液。分别用玻璃注射器吸取1毫升脂质溶液和水相溶液。

使用注射器连接器将玻璃注射器连接至峰毛细管，然后设定脂质和水相溶液的流速，利用注射泵将脂质溶液和水相溶液分别引入iLiNP装置。从iLiNP装置的出口处收集LNP悬浮液至微量离心管中。对于POPC脂质纳米颗粒（LNPs）和负载siRNA的LNPs，分别使用截留分子量为12至14千道尔顿的透析膜，在4°C条件下对生理盐水或DPBS缓冲液透析过夜。

将透析后的脂质纳米颗粒（LNP）悬浮液收集至微量离心管中，然后用移液器吸取20至30微升LNP悬浮液至微量石英比色皿中。最后，通过动态光散射法测定LNP的粒径、粒径分布及多分散指数。此处展示了在不同流速条件（如总流速和流速比）下制备的POPC LNP的粒径分布。

使用该iLiNP装置可精确控制脂质纳米颗粒（LNP）的尺寸，范围为20至100纳米。在总流速较高的条件下可形成较小尺寸的LNP。此外，无论总流速如何，当流速比（FRR）为5时所形成的LNP尺寸均小于FRR为3时所形成的LNP尺寸。

此处展示了载有siRNA的脂质纳米颗粒（LNP）的粒径分布。siRNA通过带正电荷的脂质DOTAP与带负电荷的siRNA之间的静电相互作用被包封到LNP中。iLiNP装置制备出粒径约为90纳米、分布狭窄的载siRNA阳离子LNP。

由于阳离子脂质与带负电荷的siRNA之间的静电相互作用，siRNA的包封效率达到95%。对载有siRNA的19纳米脂质纳米颗粒（LNPs）的细胞毒性和基因沉默活性进行了评估。载有siRNA的LNPs在10至100纳摩尔siRNA剂量下表现出细胞毒性。

荧光素酶的表达水平随siRNA浓度的增加而降低。在100纳摩尔siRNA剂量下，载有siRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）抑制了80%的荧光素酶表达。优化流体条件是本方案中获得理想尺寸脂质纳米颗粒（LNPs）最关键的步骤。

基于微流控的LNP制备方法，包括iLiNP装置，无需任何复杂操作步骤，有望成为标准的LNP制备方法。