焦磷酸测序：一种用于精确基因分型的简单方法

基因组研究因人类基因组序列的发布而获益巨大。焦磷酸测序是一种独特的系统，可实现对遗传变异、RNA等位基因失衡、DNA甲基化状态以及基因拷贝数的分析。在本视频中，我们将演示用于遗传分析的基本焦磷酸测序反应。

您好，我是来自华盛顿大学医学院内科系 Eby 博士和 Gage 博士实验室的 Kristy King。今天我们将向您展示焦磷酸测序（pyro sequencing）的操作流程。该方法在分析单核苷酸多态性（SNPs）时非常有用，因为它是最全面且操作简便的方法之一。

焦磷酸测序基于合成测序原理，利用每次核苷酸掺入到开放的3'端DNA链时释放焦磷酸盐的特性。当加载完反应板后，核苷酸会根据软件提供的序列依次掺入。一旦核苷酸掺入并释放焦磷酸盐，后者即参与一个反应，生成三磷酸腺苷（ATP），该ATP被荧光素酶用于将荧光素转化为氧化型荧光素，从而产生光信号。所发射的光由CCD相机采集，并以峰形记录下来，这些峰也被称为焦磷酸测序峰（pyros）。

未掺入DNA链的任何核苷酸均被AP pyra降解，以防止背景噪音。该程序包括以下步骤：引物设计、用于质量控制的PCR凝胶电泳以及焦磷酸测序。

下面我们开始介绍焦磷酸测序。为了进行焦磷酸测序，首先必须制备PCR产物。焦磷酸测序所用的PCR需要比大多数常规PCR更多的循环次数，以确保引物基本耗尽，通常约为50个循环。

焦磷酸测序还需要其中一条PCR引物带有生物素标记。最后，需要注意的是，还需要一条内部引物。可使用焦磷酸测序提供的软件进行高效的实验设计，以确保不存在污染。

为确认PCR产物的存在，应对部分样本以及阴性对照进行凝胶电泳检测。制备焦磷酸测序板时，向96孔焦磷酸测序板中每孔加入12微升焦磷酸测序引物混合物。该混合物由43.2微升内引物与1396.8微升退火缓冲液组成，配制后用粘性封膜覆盖焦磷酸测序板。

如果操作耗时超过50分钟，则向96孔PCR产物板的每个孔中加入70微升SRO快速混合液，其中包含240微升链霉亲和素包被的Sero Speeds、4,560微升结合缓冲液（由Tris氯化钠、EDTA和Tween 20配制而成）以及3,600微升水，并牢固盖上盖子。将含有珠子混合液的96孔PCR产物板置于板式振荡器中，在室温下振荡5分钟。

确保盖子已固定，以防止各孔之间发生交叉污染。此步骤将使链霉亲和素包被的磁珠充分结合至位于PCR引物上的生物素标签。设置一个用于准备酶标板的工作站。

包括试剂槽、PCR产物与磁珠混合板以及焦磷酸测序引物板。确保PCR产物与磁珠混合板以及焦磷酸测序引物板正确对齐，使凹槽朝向一致。在转移样品前，将处于关闭状态的真空工具在洁净水中轻轻摇晃，以去除可能附着在上面的磁珠或碎屑。

弃去剩余的水，重新注满水槽，然后打开真空泵。将真空工具留在水槽中，直至所有水分被抽干，大约需要30秒。将真空工具的滤芯吸头插入PCR微珠混合板的孔中，并保持至板内所有液体被完全抽干。

可采用轻柔振荡以防止表面张力。当液体开始流经管路时，将真空装置放入70%乙醇槽中。让滤芯吸头吸取乙醇持续五秒钟。

对 0.2 摩尔的氢氧化钠重复上述操作，以使 DNA 变性为单链 PCR 产物，并对洗涤缓冲液进行同样处理，以清洗和中和 PCR 产物。断开真空管与真空工具的连接，并将真空工具放入含有焦磷酸测序引物的焦磷酸测序板中，该板内已加入缓冲液混合物。

如果真空管仍保持连接，当放入焦磷酸测序板时，引物混合物会被吸走，导致您丢失PCR产物。请轻轻摇动或晃动真空管在焦磷酸测序板孔中的管尖，以分散您的PCR产物。

完成振荡或摇动后，将真空工具从焦磷酸测序板上取下，并重新连接至软管，然后将工具放入清水中清洗，以备用于下一块板。将焦磷酸测序板置于80摄氏度的加热块上加热两分钟。两分钟后，将板从加热块上取出，并放置于冷却表面。

冷却后，除非在15分钟内进行检测，否则应使用粘性封膜覆盖板子以防止蒸发。现在可以开始焦磷酸测序了。焦磷酸测序的第一步是将检测相关信息输入计算机。

在单个样本检测条目下，选择新条目并输入检测信息，包括检测名称（ID）和待分析的序列。该序列由检测设计软件提供，可用于质量控制。选择加样顺序，以提供SNP位点周围的序列及对照碱基。最后，选择直方图以显示您预期的峰图形态。现在可以开始输入SNP检测运行信息了。

在“剪切”运行和“常规”选项卡下，输入运行名称并选择运行的仪器参数。在“设置”选项卡下，选择检测项目，然后在板上点击并拖动。将选定的检测项目填入微孔板时，需要注意的是，并非必须使用整块板，您可以使不同的孔失活以排除其参与分析，同时也可以在同一块板上运行多种不同的检测。

单击“查看”选项卡，然后选择“运行”。此页面列出了运行所需的核苷酸、酶和底物的适当体积。使用前请清洁核苷酸或毛细管以及试剂吸头。

用水填充枪头，并在枪头顶部施加压力，检查是否存在堵塞。如果水无法从枪头底部喷出，可反复排空并重新吸水，尝试强行使水通过。若枪头仍然堵塞，可对其进行超声处理。

弃去并更换新的吸头。酶和底物在使用前应用水重新溶解。若震荡可能产生气泡，导致吸头堵塞或加样不一致；未使用的已重新溶解的酶和底物可于-20°C保存。

若将来在微量离心管中用于毛细管分配吸头，请用核苷酸与P八TE缓冲液进行1:1稀释。使用前充分混匀。根据软件建议的用量，向核苷酸和试剂吸头中加入相应体积的溶液。

轻轻将液体沿加样头内壁释放，以避免将气泡吸入加样头中，造成堵塞。务必检查核苷酸加样头中是否存在气泡。若发现气泡，可轻敲加样头侧壁，直至气泡上浮逸出，或使用洁净的移液枪头将气泡清除。

填充 cartridge 后运行测试板。将 cartridge 放入焦磷酸测序仪中，将测试板放入 96 孔板平台。在板上覆盖一层粘性膜，可便于观察试剂和核苷酸的 dispensation 过程。

在屏幕左侧选择仪器选项卡，然后点击管理。从下拉菜单中选择仪器。点击测试，此时将出现警告。

请确认测试板已放入仪器中。点击“确定”。完成后，取出测试板，此时在板的中央位置，应可见六个孔上有液滴，分别代表四种核苷酸、酶和底物。

如果小点少于六个，则表明发生了堵塞，应检查吸头并清除任何堵塞物。将反应板放入焦磷酸测序96孔板平台中。合上所有杠杆，然后点击单个反应板上的“运行”按钮。

运行设置后，酶、底物和核苷酸将按预设顺序加入。当焦测序仪完成对运行的分析后，即可开始检查结果。蓝色孔位表示基因型和焦测序结果通过。

橙色孔位需要人工干预，可通过点击目标孔位并打开预测的直方图进行编辑。可对基因型进行通过、失败或复核判定，也可相应地修改基因型本身。一旦孔位被编辑，板图上将显示一个实心圆点。

阴性对照应判读为阴性结果。阴性孔中可能会出现非特异性峰，但这通常是由于内引物形成环状结构所致。至此，我们已向您演示了如何对人类基因组中的多态性进行焦磷酸测序。

与其他测序方法相比，DNA焦磷酸测序具有更广泛的适用性，因此具有重要应用价值。该方法具有较强的适应性，可处理来自任何来源的DNA，包括浓度较低或已降解的DNA。进行该实验时，务必注意起始材料应为纯净且质量良好的PCR产物。

每项检测均需设置阴性对照，并确保所有试剂状态良好。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。