焦磷酸测序:一个准确的基因分型的简单方法
January 8th, 2008
焦磷酸测序（R）是其中一个最彻底而又简单的方法用于分析基因多态性。此方法具有快速，高效的单核苷酸多态性的评价，包括很多临床相关基因多态性。焦磷酸测序的技术和方法进行了解释。
遗传学研究从人类基因组序列的发布中受益匪浅。Pyro 测序是一种独特的系统，可以分析遗传变异以及 RNA 等位基因失衡、DNA、甲基化状态和基因拷贝数。在本视频中，我们演示了用于基因分析的基本焦释测序反应。
大家好，我是来自华盛顿大学医学院内科 Charles Eby 博士和 Brian Gage 博士实验室的 Kristy King。今天我们将向你展示一个热释电测序的程序。该程序很有用，因为它是用于分析 SNP 的最彻底而简单的方法之一。
Pyro 测序基于边合成边测序，每当核苷酸掺入开放的三引物 DNA 链中时，就会利用焦磷酸盐的释放。加载板后，根据软件提供的序列掺入核苷酸一旦释放，焦磷酸盐就用于反应中，导致释放 TP，荧光素酶使用TP将荧光素转化为氧荧光素，从而发射光。入射光由 CCD 相机收集并记录为峰，也称为 pyros。
任何未掺入 DNA 链的核苷酸都会被 AP pyra 降解，以防止背景噪音。此过程包括以下步骤。分析设计、用于质量控制的 PCR 凝胶电泳和焦磷酸测序。
那么让我们开始进行 pyro 测序。为了进行焦磷酸测序，必须首先制备 A PCR 产物。用于焦磷酸测序的 PCR 比大多数 PCR 需要更多的循环，以确保所有引物都用完大约 50 个循环。
焦磷酸测序还要求其中一个 PCR 引物被生物素化。最后，重要的是要注意还需要内部底漆。可以使用通过热释测序提供的软件进行高效的分析设计，以确保不存在污染。
为了确认存在 PCR 产物，应在一些样品和阴性对照上进行凝胶电泳。要制备焦磷酸测序板，请将 12 微升焦磷酸测序引物混合物添加到 96 孔焦磷酸测序板中。这需要 43.2 μL 内部引物和 1396.8 μL 跪姿缓冲液的混合物，并用粘合膜覆盖热释测序板。
如果 96 孔 PCR 产物的每个孔的设置时间超过 50 分钟，则添加 70 微升 SRO 快速混合物，其中包含 240 微升链霉亲和素包被的血清速度。4、560 微升结合缓冲液，由 triss 氯化钠、EDTA 和吐温 20 和 3、600 微升水制成，并牢固地盖上盖子。将含磁珠混合物的 96 孔 PCR 产物板在室温下放入板振荡器中 5 分钟。
确保盖子已固定，以防止孔之间出现任何交叉污染。此步骤将允许将链球菌 ENC、包被的球状微珠彻底跪在位于 PCR 引物上的生物素标签上。设置用于制备板的工作站。
这包括试剂槽、PCR 产物和磁珠混合物托盘以及热磷酸测序引物托盘。确保 PCR 产物和磁珠混合板以及焦磷酸测序引物托盘正确对齐，以便阴性物处于相同的方向。在转移样品之前，摇晃真空工具，该工具在清水中关闭，以释放其上可能存在的任何珠子或碎屑。
丢弃剩余的水，重新装满水槽，然后打开真空吸尘器。将真空工具留在槽中，直到去除所有水，这大约需要 30 秒。将真空工具的过滤头放入 PCR 微珠混合板的孔中，并保留它，直到从板中去除所有液体。
可以使用轻柔的摇摆来防止表面张力。当液体开始流过管道时，将真空置于 70% 乙醇槽中。让过滤嘴吸干乙醇 5 秒钟。
对 0.2 摩尔氢氧化钠重复此作，该钠将 DNA 变性为单链 PCR，并对洗涤缓冲液重复此作。清洁和中和 PCR 产物。断开真空软管与真空工具的连接，然后将真空工具放入热释测序板中，该板含有跪姿缓冲液混合物中的热释测序引物。
如果真空软管仍然连接着，当放入热释电测序板时，引物混合物将被吸入。导致您丢失 PCR 产物的提示。轻轻摇晃或摇动 pyro 测序板孔中的真空尖端，以分散 PCR 产物。
摇晃或摇晃完成后，从 pyro 测序板上取下真空工具，将真空工具重新连接到软管上，然后将工具放入清水中清洗，用于下一个板。将热释测序板放在 80 摄氏度的加热块上 2 分钟。两分钟后，从加热块中取出板子，放在凉爽的表面上。
冷却后，可以使用胶膜覆盖板，除非板将在 15 分钟内运行以防止蒸发。现在是时候开始 pyro 测序了。焦磷酸测序的第一步是将检测详细信息输入计算机。
在单纯形输入下，选择新条目并输入检测信息，包括 ID 名称和要分析的序列，这些信息由检测设计软件提供，并允许质量控制选择分配顺序，该顺序提供围绕 SNP 和对照碱基的序列。最后，选择直方图以提供 pigram 的可视化外观。现在是时候进入 snip 运行了。
在 snip runs （截图运行） 和 general （常规） 选项卡下，输入运行名称并选择运行的仪器参数。在设置选项卡下，选择检测条目，然后单击并拖动板。要将所选检测试剂盒输入您的检测板，请务必注意，不必使用整个检测板，您可以在其中灭活不同的孔进行分析，并且可以在同一板上运行许多不同的检测。
单击 view 选项卡，然后选择。跑。本页列出了运行所需的适当体积的核苷酸、酶和底物。使用前清洁核苷酸或毛细管和试剂吸头。
将吸头装满水，并在吸头顶部施加压力，以检查是否有任何吸头堵塞。如果水没有从吸头底部喷出，请清空并重新装满几次，以尝试迫使水通过。或者，如果吸头仍然堵塞，您可以对吸头进行超声处理。
丢弃并获得新的提示。酶和底物在使用前应用水重悬。如果摇晃的气泡可能导致吸头堵塞或分配不一致，则未使用的重悬酶和底物可以储存在零下 20 摄氏度。
为了将来在微量离心管中用于毛细管分液吸头，请用核苷酸和 te 缓冲液 P 8 进行一对一稀释。使用前请充分混合。根据软件建议的量，用适当的体积填充核苷酸和试剂吸头。
沿吸头侧面轻轻分配液体，以防止气泡吹入吸头并导致堵塞。请务必检查核苷酸分液吸头中是否有任何气泡。如果存在气泡，只需轻敲吸头的侧面，直到气泡浮出水面，或者用干净的移液器吸头将其移开。
填充小柱后运行测试板。将小柱放入热释测序仪中，将测试板置于 96 孔板平台中。在板上放置一层封膜，可以很容易地看到试剂和核苷酸的分配。
选择屏幕左侧的仪器选项卡，然后单击 manage（管理）。从下拉菜单中选择检测。单击 test，将出现警告。
要求您检查测试板是否已放入仪器中。单击 确定。完成后，取下测试板，在测试板的中间，六个孔上应有液点，代表四个核苷酸、酶和底物。
如果少于 6 个小点，则表示发生了堵塞，应检查尖端并清除任何堵塞。将板放入 pyro 测序 96 孔板平台中。关闭所有杠杆，然后单击单个板上的 run（运行）。
运行设置酶底物，核苷酸将按预定顺序分配。一旦 pyro sequencer 分析了运行，就该检查运行了。蓝色孔代表传递的基因型和 pyro。
橙色孔需要人工干预，可以通过单击感兴趣的孔并打开预测的直方图进行编辑。基因型可以通过、失败或检查，基因型本身也可以适当地改变。编辑孔后，板图上将显示一个黑圈。
阴性对照应评分为阴性。负孔中可能存在非特异性峰，但是，这通常是由内部引物的环引起的。所以我们刚刚向你展示了如何在人类基因组中对多态性进行 py 测序。
DNA Pyro 测序比其他测序程序有用，因为它适用于广泛的应用。它还足够稳定，可以处理来自任何来源的 DNA，包括低浓度和降解的 DNA。执行此程序时，请务必记住从优质干净的 PCR 产物开始。
每次检测都包括一个阴性对照，并确保所有试剂都良好。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本文讨论了焦磷酸测序，这是一种用于分析遗传多态性的方法。它突出了该技术在评估单核苷酸多态性（SNP）方面的效率及其在遗传分析中的应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 遗传学
- 基因组分析
- 生物技术
背景
- 人类基因组序列推进了遗传学研究。
- 焦磷酸测序允许对遗传变异进行详细分析。
- 它特别适用于评估RNA等位基因失衡和DNA甲基化。
- 该方法基于合成测序。
研究目的
- 展示焦磷酸测序的步骤。
- 解释分析SNP的方法。
- 提供有关测定设计和质量控制的见解。
所用方法
- 用生物素化引物准备PCR产物。
- 使用96孔板进行焦磷酸测序反应。
- 核苷酸的结合和发出光的检测。
- 通过凝胶电泳进行质量控制。
主要结果
- 成功展示了基本的焦磷酸测序反应。
- 通过软件工具确认了高效的测定设计。
- 质量控制措施确保了准确的结果。
- 光的发射与核苷酸的结合相关。
结论
- 焦磷酸测序是SNP分析的可靠方法。
- 该技术简化了遗传多态性的评估。
- 它在临床遗传学中有重要应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Pyrosequencing enables rapid, accurate genotyping and quantitative analysis of genetic polymorphisms, supporting high-confidence target validation and biomarker discovery in biopharma R&D. Its ability to resolve SNPs, indels, and methylation status with internal quality control enhances predictive confidence at critical discovery inflection points. This standardized, scalable method strengthens portfolio decision-making by reducing ambiguity in genetic variant assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of genetic variants relevant to therapeutic hypotheses.
- Supports functional target validation by quantifying allele-specific expression and methylation.
- Facilitates biological de-risking through robust detection of SNPs and indels.
- Improves predictive confidence for advancing genetic targets in the pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated genotyping assays for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for assay standardization.
- Supports high-throughput analysis using 96-well plate formats.
- Enables reliable evaluation of compound effects on genetic variants.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic variant analysis with disease-relevant biomarkers when supported by sample type.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by quantifying allele frequencies and methylation.
- Reduces translational risk by providing quantitative, reproducible genetic data.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust genotyping outputs.
Pipeline & Workflow Integration
Pyrosequencing integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, providing a standardized genotyping platform across the R&D continuum.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling accurate SNP and methylation analysis.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible genotyping data for compound screening and validation.
- Analytics: Provides quantitative readouts and internal controls for confident comparison of genetic conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and continuity when genetic variants are linked to disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized genotyping capability adaptable to diverse project needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic analyses.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of genotyping workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust genetic data early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of genetic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PCR assay design and genotyping analysis.
- Needs access to pyrosequencing instrumentation and analytical software.
- Demands rigorous cross-team standardization for assay setup and quality control.
- Adaptable to various DNA sources, including low-concentration or degraded samples.
- Dependent on high-quality PCR products and validated controls for reliable outputs.
