Name: 焦磷酸测序:一个准确的基因分型的简单方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-08T13:47:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 了解焦磷酸测序技术用于遗传学中单核苷酸多态性分析的完整流程。本方法通过合成测序原理实现基因分型，适用于DNA甲基化和等位基因不平衡研究。

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该实验方法的完整文字方案可在 <a href="http://www.springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1385/1-59745-377-3:39">Springer Protocols</a> 中获取。

作者无任何利益冲突需要披露。

焦磷酸测序：一种用于精确基因分型的简单方法

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

药物遗传学研究直接受益于人类基因组计划完成所提供的海量信息。随着大量数据的可获得性，基因分型方法也迅速涌现。焦磷酸测序（Pyrosequencing®）是迄今为止最为全面且简便的分析多态性的方法之一。该方法还能够鉴定三等位基因、插入缺失（indels）、短重复序列多态性，并可用于评估甲基化位点的等位基因比例或混合样本的等位基因频率。此外，该技术包含一段标准化的对照序列，可提供内部质量控制。该方法已实现快速高效的单核苷酸多态性分析，涵盖许多具有临床意义的多态性位点。本文详细阐述了焦磷酸测序的技术原理与实验方法。

焦磷酸测序（Pyrosequencing®）是迄今为止用于分析多态性最全面且简便的方法之一。该方法已实现快速高效的单核苷酸多态性分析，涵盖许多具有临床意义的多态性位点。本文详细阐述了焦磷酸测序的技术原理与实验方法。

药物遗传学研究直接得益于人类基因组计划完成所提供的海量信息。随着此类……

基因组研究因人类基因组序列的发布而获益巨大。焦磷酸测序是一种独特的系统，可实现对遗传变异、RNA等位基因失衡、DNA甲基化状态以及基因拷贝数的分析。在本视频中，我们将演示用于遗传分析的基本焦磷酸测序反应。您好，我是来自华盛顿大学医学院内科系 Eby 博士和 Gage 博士实验室的 Kristy King。今天我们将向您展示焦磷酸测序（pyro sequencing）的操作流程。该方法在分析单核苷酸多态性（SNPs）时非常有用，因为它是最全面且操作简便的方法之一。焦磷酸测序基于合成测序原理，利用每次核苷酸掺入到开放的3'端DNA链时释放焦磷酸盐的特性。当加载完反应板后，核苷酸会根据软件提供的序列依次掺入。一旦核苷酸掺入并释放焦磷酸盐，后者即参与一个反应，生成三磷酸腺苷（ATP），该ATP被荧光素酶用于将荧光素转化为氧化型荧光素，从而产生光信号。所发射的光由CCD相机采集，并以峰形记录下来，这些峰也被称为焦磷酸测序峰（pyros）。未掺入DNA链的任何核苷酸均被AP pyra降解，以防止背景噪音。该程序包括以下步骤：引物设计、用于质量控制的PCR凝胶电泳以及焦磷酸测序。下面我们开始介绍焦磷酸测序。为了进行焦磷酸测序，首先必须制备PCR产物。焦磷酸测序所用的PCR需要比大多数常规PCR更多的循环次数，以确保引物基本耗尽，通常约为50个循环。焦磷酸测序还需要其中一条PCR引物带有生物素标记。最后，需要注意的是，还需要一条内部引物。可使用焦磷酸测序提供的软件进行高效的实验设计，以确保不存在污染。为确认PCR产物的存在，应对部分样本以及阴性对照进行凝胶电泳检测。制备焦磷酸测序板时，向96孔焦磷酸测序板中每孔加入12微升焦磷酸测序引物混合物。该混合物由43.2微升内引物与1396.8微升退火缓冲液组成，配制后用粘性封膜覆盖焦磷酸测序板。如果操作耗时超过50分钟，则向96孔PCR产物板的每个孔中加入70微升SRO快速混合液，其中包含240微升链霉亲和素包被的Sero Speeds、4,560微升结合缓冲液（由Tris氯化钠、EDTA和Tween 20配制而成）以及3,600微升水，并牢固盖上盖子。将含有珠子混合液的96孔PCR产物板置于板式振荡器中，在室温下振荡5分钟。确保盖子已固定，以防止各孔之间发生交叉污染。此步骤将使链霉亲和素包被的磁珠充分结合至位于PCR引物上的生物素标签。设置一个用于准备酶标板的工作站。包括试剂槽、PCR产物与磁珠混合板以及焦磷酸测序引物板。确保PCR产物与磁珠混合板以及焦磷酸测序引物板正确对齐，使凹槽朝向一致。在转移样品前，将处于关闭状态的真空工具在洁净水中轻轻摇晃，以去除可能附着在上面的磁珠或碎屑。弃去剩余的水，重新注满水槽，然后打开真空泵。将真空工具留在水槽中，直至所有水分被抽干，大约需要30秒。将真空工具的滤芯吸头插入PCR微珠混合板的孔中，并保持至板内所有液体被完全抽干。可采用轻柔振荡以防止表面张力。当液体开始流经管路时，将真空装置放入70%乙醇槽中。让滤芯吸头吸取乙醇持续五秒钟。对 0.2 摩尔的氢氧化钠重复上述操作，以使 DNA 变性为单链 PCR 产物，并对洗涤缓冲液进行同样处理，以清洗和中和 PCR 产物。断开真空管与真空工具的连接，并将真空工具放入含有焦磷酸测序引物的焦磷酸测序板中，该板内已加入缓冲液混合物。如果真空管仍保持连接，当放入焦磷酸测序板时，引物混合物会被吸走，导致您丢失PCR产物。请轻轻摇动或晃动真空管在焦磷酸测序板孔中的管尖，以分散您的PCR产物。完成振荡或摇动后，将真空工具从焦磷酸测序板上取下，并重新连接至软管，然后将工具放入清水中清洗，以备用于下一块板。将焦磷酸测序板置于80摄氏度的加热块上加热两分钟。两分钟后，将板从加热块上取出，并放置于冷却表面。冷却后，除非在15分钟内进行检测，否则应使用粘性封膜覆盖板子以防止蒸发。现在可以开始焦磷酸测序了。焦磷酸测序的第一步是将检测相关信息输入计算机。在单个样本检测条目下，选择新条目并输入检测信息，包括检测名称（ID）和待分析的序列。该序列由检测设计软件提供，可用于质量控制。选择加样顺序，以提供SNP位点周围的序列及对照碱基。最后，选择直方图以显示您预期的峰图形态。现在可以开始输入SNP检测运行信息了。在“剪切”运行和“常规”选项卡下，输入运行名称并选择运行的仪器参数。在“设置”选项卡下，选择检测项目，然后在板上点击并拖动。将选定的检测项目填入微孔板时，需要注意的是，并非必须使用整块板，您可以使不同的孔失活以排除其参与分析，同时也可以在同一块板上运行多种不同的检测。单击“查看”选项卡，然后选择“运行”。此页面列出了运行所需的核苷酸、酶和底物的适当体积。使用前请清洁核苷酸或毛细管以及试剂吸头。用水填充枪头，并在枪头顶部施加压力，检查是否存在堵塞。如果水无法从枪头底部喷出，可反复排空并重新吸水，尝试强行使水通过。若枪头仍然堵塞，可对其进行超声处理。弃去并更换新的吸头。酶和底物在使用前应用水重新溶解。若震荡可能产生气泡，导致吸头堵塞或加样不一致；未使用的已重新溶解的酶和底物可于-20°C保存。若将来在微量离心管中用于毛细管分配吸头，请用核苷酸与P八TE缓冲液进行1:1稀释。使用前充分混匀。根据软件建议的用量，向核苷酸和试剂吸头中加入相应体积的溶液。轻轻将液体沿加样头内壁释放，以避免将气泡吸入加样头中，造成堵塞。务必检查核苷酸加样头中是否存在气泡。若发现气泡，可轻敲加样头侧壁，直至气泡上浮逸出，或使用洁净的移液枪头将气泡清除。填充 cartridge 后运行测试板。将 cartridge 放入焦磷酸测序仪中，将测试板放入 96 孔板平台。在板上覆盖一层粘性膜，可便于观察试剂和核苷酸的 dispensation 过程。在屏幕左侧选择仪器选项卡，然后点击管理。从下拉菜单中选择仪器。点击测试，此时将出现警告。请确认测试板已放入仪器中。点击“确定”。完成后，取出测试板，此时在板的中央位置，应可见六个孔上有液滴，分别代表四种核苷酸、酶和底物。如果小点少于六个，则表明发生了堵塞，应检查吸头并清除任何堵塞物。将反应板放入焦磷酸测序96孔板平台中。合上所有杠杆，然后点击单个反应板上的“运行”按钮。运行设置后，酶、底物和核苷酸将按预设顺序加入。当焦测序仪完成对运行的分析后，即可开始检查结果。蓝色孔位表示基因型和焦测序结果通过。橙色孔位需要人工干预，可通过点击目标孔位并打开预测的直方图进行编辑。可对基因型进行通过、失败或复核判定，也可相应地修改基因型本身。一旦孔位被编辑，板图上将显示一个实心圆点。阴性对照应判读为阴性结果。阴性孔中可能会出现非特异性峰，但这通常是由于内引物形成环状结构所致。至此，我们已向您演示了如何对人类基因组中的多态性进行焦磷酸测序。与其他测序方法相比，DNA焦磷酸测序具有更广泛的适用性，因此具有重要应用价值。该方法具有较强的适应性，可处理来自任何来源的DNA，包括浓度较低或已降解的DNA。进行该实验时，务必注意起始材料应为纯净且质量良好的PCR产物。每项检测均需设置阴性对照，并确保所有试剂状态良好。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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焦磷酸测序:一个准确的基因分型的简单方法

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