Name: 高分辨率呼吸测定法，使用基于腔室和板式呼吸计评估细胞和组织中的生物能量学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 了解高分辨率呼吸测定法，使用腔室和板式呼吸计评估HEK293细胞及小鼠组织的线粒体生物能量学。该方法可实时测量氧消耗，为线粒体疾病诊断提供关键依据。

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本工作获得了芬兰科学院（C.B.J）、马格努斯·埃伦罗特基金会（C.B.J）以及综合生命科学研究生院博士奖学金（R.A.）的资助。

无利益冲突需披露。

传统上，线粒体生物能量学&#160;研究主要采用克拉克型氧电极。然而，由于其分辨率和通量较低，亟需技术进步。迄今为止，O2k（称为cHRR）和Seahorse XF96细胞能量代谢分析仪（称为mHRR）已在细胞生物能量学领域得到广泛应用。本文提供了一套全面且易于理解的实验方案，用于通过cHRR或mHRR评估线粒体呼吸来分析细胞能量代谢，讨论了每种设备的主要优势，并提供了实用的操作指导。本文所述方案涵盖哺乳动物细胞、纤维状（坚硬）组织（如骨骼肌和心肌）以及非纤维状（柔软）组织（如脑和肝），并适用于类似类型的样品材料。
尽管两种高分辨率呼吸测定法（HRR）在具有多种氧化磷酸化缺陷的HEK293细胞中所得数据具有可比性，但其基本工作原理和设备技术配置使其适用于不同的应用场景。微孔板式高分辨率呼吸测定（mHRR）系统支持自动化数据采集，具备高通量能力，可采用24孔或96孔板设计，所需样品量极少。然而，由于实验体积小、孔表面积有限，并使用了透氧性聚合物（如聚苯乙烯），可能导致孔内变异度较高（尤其是在96孔板设置中），因此建议每种条件至少使用≥6个复孔以获得可重复的结果。与基于传统极谱氧传感器...

线粒体承担着关键的能量供应功能，是一种区室化的细胞器，参与多种重要的细胞生物能量学和代谢过程，如核苷酸、脂质和氨基酸的合成、铁硫簇的生成，并涉及细胞信号传导，例如调控细胞程序性死亡1,2,3。通过氧化磷酸化实现的线粒体生物能量学过程几乎参与细胞内所有生命活动，因此，原发性或继发性线粒体功能障碍与多种疾病状态密切相关4,5。线粒体功能障碍不仅涉及线粒体结构或密度的改变，还包括呼吸系统的质量及其调控的异常6。这种定性层面的异常涵盖底物调控、偶联特性、翻译后修饰、嵴结构动态变化以及呼吸链超复合体的形成与功能7,8。因此，在健康与疾病状态下，对线粒体生物能量学进行准确分析，对于实验研究和临床诊断中评估细胞能量代谢具有重要意义。
线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）是呼吸系统或电子传递系统（ETS）内一系列反应，通过三磷酸腺苷（ATP）生成细胞能量9。该多酶促步骤通过电子从复合物I和复合物II流向复合物IV，从而在线粒体内膜上建立电化学质子梯度，此梯度随后被复合物V（F1FO ATP合酶）用于将二磷酸腺苷（ADP）磷酸化为ATP（图1A）。
首先，在三羧酸循环（TCA）、糖酵解和丙酮酸氧化过程中会产生双电子载体：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和二氢黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH2）。NADH 在复合体 I（NADH 脱氢酶）处被氧化，期间两个电子被传递给辅酶 Q（醌被还原为氢醌），同时质子被泵入膜间隙（IMS）。其次，复合体 II（琥珀酸脱氢酶）氧化 FADH2，并将电子传递给辅酶 Q，此过程不伴随质子泵出。第三，在复合体 III（细胞色素 c 氧化还原酶）中，来自辅酶 Q 的电子被传递给细胞色素 c，同时质子被泵入膜间隙。第四，细胞色素 c 将电子传递至复合体 IV（细胞色素 c 氧化酶），这是最后一个泵出质子的复合体，氧气在此作为电子受体结合质子，最终形成水。线粒体所消耗的正是这部分氧气，可通过氧电极仪进行测量。最后，由复合体 I、复合体 III 和复合体 IV 产生的质子驱动复合体 V 旋转，从而生成 ATP9。
重要的是，电子传递不仅以线性方式进行，即通常所说的电子传递链。相反，电子可以通过多种呼吸途径传递至辅酶Q池，从而实现电子流的汇聚。例如，NADH底物和琥珀酸可分别通过复合物I和复合物II进入传递链。来自脂肪酸氧化的电子则可通过电子转移黄素蛋白复合物进行传递。因此，对氧化磷酸化（OXPHOS）进行全面分析时，需要采用整体性方法，并使用适当的燃料底物（图1A）。
<img alt="线粒体氧化磷酸化示意图及细胞实验中的氧气消耗图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：线粒体氧化磷酸化及特异性底物与抑制剂实验方案。（A）线粒体结构及电子传递系统（CI-CIV）和线粒体F1F0 ATP合酶（CV）示意图。所有结构均来源于PDB。图中仅展示本研究中描述的底物和抑制剂。（B）使用标准方案在mHRR设备中测定完整HEK293细胞的氧通量示例轨迹。（C）使用标准方案在cHRR设备中测定完整HEK293细胞的氧通量示例轨迹。（D）使用相应SUIT方案测定来自健康供体的透化人成纤维细胞的氧通量示例轨迹。缩写：1 = 完整细胞的常规呼吸；2 = 状态2；3 = 状态3(I)；4 = 加入细胞色素c后的状态3(I)；5 = 状态3(I+II)；6 = 寡霉素敏感性漏呼吸（Leak(OM)）；7 = 电子传递系统（ETS）容量；8 = S(ROT)；9 = 非线粒体呼吸（ROX）；10 = TMPD；11 = 叠氮化物（Az）。ROT = 鱼藤酮，AM = 抗霉素，ATP = 三磷酸腺苷，Az = 叠氮化物，OM = 寡霉素，FCCP = 羰基氰化对三氟甲氧基苯腙；Asc = 抗坏血酸，TMPD = N,N,N′,N′-四甲基对苯二胺，Succ = 琥珀酸，M = 苹果酸，P = 丙酮酸，ADP = 二磷酸腺苷，NAD = 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，IMS = 膜间隙，FAD = 黄素腺嘌呤二核苷酸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
利用高分辨率呼吸测定法（HRR）分析线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）能力已成为一种具有诊断价值的关键生化方法，不仅适用于原发性线粒体缺陷10,11，还广泛应用于癌症和衰老等生物学其他领域12。HRR可通过评估线粒体OXPHOS能力来测定细胞呼吸，该能力直接反映单个或复合线粒体呼吸链复合物的功能缺陷，并间接关联细胞功能障碍及能量代谢异常9。在方法学上，呼吸测定可使用细胞、组织或分离的线粒体进行11,13,14，而冷冻样本仅部分适用15,16。研究表明，冷冻组织中的电子传递系统（ETS）仍保持完整，且超复合物稳定性得以维持15。因此，与传统的三羧酸（TCA）循环中间产物不同，相应的底物可直接进入ETS。然而，由于冷冻损伤（冰晶形成）破坏了膜完整性，ETS与ATP合成之间的偶联作用会丧失。
呼吸实验通常在37 °C的生理温度下进行，适用于恒温动物的非透化细胞或透化细胞及组织。前者考虑了胞质代谢环境，而后者通过添加特定底物（和抑制剂）来评估各个OXPHOS复合物及ATP酶的能量贡献。底物与抑制剂的添加顺序和变化促使了多种SUIT方案17和检测方法18的发展，以解决有关OXPHOS功能的各种科学问题（综述见12）。细胞呼吸的基本方案评估四种不同的状态：i) 常规呼吸——在未添加任何外源底物或抑制剂的情况下，仅依赖内源性底物进行的呼吸。该状态可揭示由代谢物谱改变等因素引起的普遍性OXPHOS功能障碍或继发性呼吸缺陷。接下来，加入ATP酶抑制剂寡霉素，可揭示线粒体内膜对质子的通透性，定义为ii) 质子漏呼吸。随后逐步滴加质子载体（如解偶联剂羰基氰化对三氟甲氧基苯腙，FCCP），可确定电子传递系统（ETS）在跨膜质子通路完全开放模式下的最大容量，定义为iii) 解偶联呼吸。值得注意的是，实验过程中若对线粒体膜造成过度机械损伤，也可能导致解偶联状态。相反，“非偶联状态”指的是由内在生理机制调控的生理性呼吸解偶联。最后，通过加入复合体III抑制剂抗霉素A和复合体I抑制剂鱼藤酮，完全抑制电子传递系统，从而测定来自非线粒体耗氧过程的残余氧消耗（ROX）（图1A-C）。
线粒体生物能量学包含五种不同的呼吸状态19,20。状态1呼吸指除内源性存在的物质外，未添加任何额外底物或ADP的情况。加入ADP后但仍未添加底物时，进入状态2呼吸。当添加底物后，电子传递和ATP合成得以进行，此时达到状态3呼吸。在此状态下，氧化磷酸化（OXPHOS）能力可在ADP、无机磷酸盐、氧气、NADH和琥珀酸相关底物达到饱和浓度时进行定义。状态4呼吸，即漏呼吸（LEAK respiration），是指在缺乏ADP或ATP合酶被化学抑制的情况下，但底物充足的呼吸状态。最后，在密闭体系中所有氧气被耗尽（无氧）时，可观察到状态5呼吸。
目前存在多种方法用于评估细胞能量状态14，其中两种设备通过分析封闭腔室系统中随时间变化的氧气消耗量，主导了当前对氧化磷酸化（OXPHOS）的实时评估。这两种设备分别是Oroboros 2k高分辨率呼吸测定仪和Seahorse XF细胞外通量分析仪，其适用性因实验模型和研究问题而异。两种设备均以腔室或微孔板孔内每秒氧气（O2）皮摩尔（pmol）的减少量作为绝对值，记录氧气消耗速率。通过将特定缓冲液配方中的氧气消耗量归一化为细胞数量（百万个）、组织重量（mg）或蛋白含量，可获得单位质量的特异性氧气消耗量。
O2k（Oroboros Instruments）是一种封闭式双腔系统，配备有极谱氧传感器（简称基于腔室的高分辨率呼吸测定仪：cHRR）。每个实验腔室可容纳2 mL液体，并通过磁力搅拌器保持均一。该极谱氧传感器采用安培法测量氧气：其包含一个金制阴极、一个银/氯化银阳极，以及两者之间的KCI溶液，构成一个电化学电池，并施加0.8 V电压。检测介质中的氧气通过一层25 µm厚的氟化乙烯丙烯膜（允许O2透过）扩散进入传感器，在阴极被还原生成过氧化氢。在阳极，银被过氧化氢氧化，从而产生电流。该电流（安培）与氧分压呈线性关系。利用氧分压以及检测介质的氧溶解度因子可计算出氧浓度。由于氧分压依赖于实验温度，且极谱测量对温度敏感，因此需要通过帕尔贴加热模块对温度进行精确调控（±0.002 °C）。温度控制范围为4 °C至47 °C。
Seahorse XF 细胞外通量分析仪（Agilent）是一种基于微孔板的系统，采用 24 孔或 96 孔微孔板格式，其中三个荧光电极可随时间测量每个孔中的耗氧量（简称微孔板式高分辨率呼吸仪：mHRR）。检测过程中，检测卡盒最多可提供四个端口用于自动加样。一次检测包含多个循环，每个循环分为三个阶段：1）混匀、2）等待和 3）测量。在测量阶段，传感器探针下降至微孔板中，形成一个临时封闭的腔室（体积为 7–10 µL），用于检测发射光。该光信号由传感器探针尖端嵌入聚合物中的荧光探针发出，其通过磷光猝灭效应感应 O2 浓度。荧光信号强度与 O2 浓度成正比，同时受传感器及检测介质温度的影响。因此，准确估算氧气浓度需采用相对法，即设置不含任何样品的背景孔作为对照。在混匀阶段，传感器上下移动，混合临时腔室上方的液体，从而恢复氧气浓度。每个循环计算出一个氧气消耗速率。温度可在 16 °C 至 42 °C 范围内精确控制。
高分辨率呼吸测定法（HRR）是评估原发性线粒体相关疾病及一般细胞代谢中细胞生物能量学的金标准。本研究提供了HRR的基本实验方案，用于评估细胞和组织中的氧化磷酸化（OXPHOS）功能。
<img alt="cHRR和mHRR示意图、哺乳动物细胞、组织步骤及培养板设置的实验流程图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：用于cHRR的细胞与组织制备，以及用于mHRR呼吸测定的细胞制备工作流程。（A）所提供的实验方案概览。（B）哺乳动物细胞（步骤1.2）：相当于3 × 106个细胞的HEK293细胞沉淀（左图）；非纤维性组织（步骤1.3）：在2 mL特氟龙玻璃匀浆器中制备小鼠小脑裂解物（中图）；皂苷诱导的骨骼肌通透化处理（步骤1.4，右图），用于cHRR呼吸测定。（C）用于mHRR呼吸测定的真核细胞（HEK293）的标准微孔板接种布局（步骤2.4）及汇合度检查。（D, E）mHRR呼吸测定中进样孔加样示意图（步骤2.4）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>2 mL Potter-Elvehjem 玻璃/聚四氟乙烯组织研磨器/匀浆器</td><td>Omni International</td><td>07-358029</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 医用气体混合物</td><td></td><td></td><td>用于组织研磨的 Potter 匀浆器</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td></td></tr><tr><td>抗霉素 A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Merck</td><td>PHR1279-1G</td><td>化学试剂，溶于乙醇</td></tr><tr><td>BSA（无脂肪酸）</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C 4830</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>细胞色素 c</td><td>Sigma</td><td>C 7752</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma</td><td>D 5628</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma</td><td>D 0632</td><td>化学试剂，溶于 DMSO</td></tr><tr><td>D-蔗糖</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基（高葡萄糖）</td><td>Fisher Scientific</td><td>41965-039</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基&amp;nbsp;（无葡萄糖）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E 4378</td><td></td></tr><tr><td>依托莫西尔</td><td>Sigma</td><td>E1905</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12500</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12501</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C 2920</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>化学试剂，溶于乙醇</td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma</td><td>G 1626</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>GlutaMax&amp;nbsp;(100x)&amp;nbsp;(200 nM&amp;nbsp;L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽)</td><td>Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>HEK293 细胞</td><td>ATTC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td>细胞计数仪器</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Fluka</td><td>56750</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>L-肉碱</td><td>Sigma</td><td>C0283</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>苹果酸</td><td>Sigma</td><td>M 1000</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>MES 水合物</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ATP</td><td>Sigma</td><td>A 2383</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;磷酸肌酸</td><td>Sigma</td><td>P 7936</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Na-丙酮酸盐&amp;nbsp;(100 mM)&amp;nbsp;(100x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>NEAA&amp;nbsp;（非必需氨基酸）100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>正常 FBS&amp;nbsp;(10x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;k-Core：Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>高分辨率呼吸测定仪</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;k-滴定装置</td><td>Oroboros Instruments</td><td>20820-03</td><td>用于化学试剂注射的汉密尔顿注射器</td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma</td><td>O 4876</td><td>化学试剂，溶于乙醇</td></tr><tr><td>棕榈酰肉碱</td><td>Sigma</td><td>P 4509</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸</td><td>Sigma</td><td>P 2256</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>RIPA 缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>89900</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>化学试剂，溶于乙醇</td></tr><tr><td>皂素</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Seahorse XF DMEM 检测培养基套装，pH 7.4</td><td>&lt;br/&gt; Agilent, Santa Clara, CA</td><td>103680-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪</td><td>&lt;br/&gt; Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td>高通量呼吸测定仪</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>&lt;br/&gt; Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td>&lt;br/&gt; 包含检测板、检测盒、化合物转移至检测盒的加载引导工具以及校准液。</td></tr><tr><td>小型剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Merck</td><td>72-57-1</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>0.25% EDTA 胰蛋白酶</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>两把细刃镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>尿苷储备液 (500x)</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>化学试剂</td></tr></tbody></table>

使用腔室型和板式呼吸仪通过高分辨率呼吸测定法评估细胞和组织的生物能量学

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

高分辨率呼吸测定法（HRR）可实时监测氧化磷酸化过程，用于分析单个细胞的能量状态，并通过多样化的底物-解偶联剂-抑制剂滴定（SUIT）方案评估呼吸链复合物。本文展示了两种高分辨率呼吸测定仪的使用方法，并提供了一系列适用于培养细胞、骨骼肌和心肌纤维以及脑、肝等软组织分析的基础实验方案。针对培养细胞和组织的方案分别适用于基于腔室的呼吸测定仪，而培养细胞的方案也适用于基于微孔板的呼吸测定仪，两者均包含标准呼吸测定流程。为便于比较，本研究使用CRISPR基因编辑技术构建的线粒体翻译缺陷型HEK293细胞（导致多种呼吸系统缺陷），在两种设备上进行实验，以展示细胞呼吸功能的缺陷。两种呼吸测定仪均可对细胞呼吸进行全面测量，其各自的技术优势和适用性取决于具体的研究问题和研究模型。

本文提供了用于测定真核细胞、非纤维组织（例如小脑）和纤维组织（例如骨骼肌）中线粒体生物能量的实验方案。对于真核细胞，我们检测了通过CRISPR技术敲除两种与线粒体翻译相关蛋白的HEK293细胞，这些细胞分别表现出多种（CRISPRKO1）和严重/完全的氧化磷酸化缺陷（CRISPRKO2），检测方法采用细胞高分辨率呼吸测定（cHRR）（图3A-C）或线粒体高分辨率呼吸测定（mHRR）（图3A-D）。
对于细胞全高分辨率呼吸（cHRR），HEK293细胞经皂苷透化处理后，按照标准方案（步骤1.5–1.6）进行呼吸实验，并成功记录结果（图3A）。与野生型（WT）相比，在归一化至细胞输入量后，CRISPRKO1表现...

利用高分辨率呼吸测量仪评估氧化磷酸化已成为线粒体功能及细胞能量代谢分析的重要组成部分。本文介绍了使用腔室型和微孔板型高分辨率呼吸测量仪分析细胞能量代谢的实验方案，并讨论了每种设备的主要优势。

高分辨率呼吸测定法（HRR）可实时监测氧化磷酸化过程，用于分析单个细胞的能量状态及……

线粒体通过氧化磷酸化为细胞提供能量，几乎参与细胞内的所有生命活动。因此，线粒体功能障碍与多种疾病密切相关。该技术的主要优势在于可通过氧气消耗实时测量线粒体生物能量状态，从而准确评估细胞整体能量代谢水平。高分辨率呼吸测定法可直接评估氧化磷酸化系统中出现功能障碍的环节，可能为原发性线粒体疾病以及多种疾病相关的继发性线粒体功能障碍提供诊断线索。演示该实验操作的是本实验室的博士研究生 Ryan Awadhpersad。首先，在37摄氏度条件下，使用2.1毫升线粒体呼吸介质对呼吸仪进行氧气校准，运行时间超过45分钟，若基线波动在每秒4皮摩尔以内，则可继续后续操作。在含10%热灭活胎牛血清、GlutaMAX、非必需氨基酸、丙酮酸钠和尿苷的高糖DMEM培养基中，于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养HEK293细胞。实验当天，收集并计数细胞，将250万个细胞重悬于2.5毫升呼吸介质中。为评估常规呼吸，向检测室中加入2.3毫升温热的细胞悬液呼吸介质。将反应室置于37摄氏度、搅拌速度为700 RPM的条件下运行。等待至少三分钟，使培养基充分脱气，然后通过旋转拧紧塞子来封闭反应室。接着，吸除塞子上方的多余液体。10分钟后，获取稳定的氧通量信号，以记录常规呼吸或状态I呼吸。在完整细胞中进行OXPHOS分析时，加入2微升浓度为0.01毫摩尔的寡霉素，使终浓度达到10纳摩尔。使用2毫摩尔储备液滴定FCCP，每次加入0.2微升，累计添加至0.6微升，直至观察不到呼吸速率增加，且呼吸达到最大解偶联状态。接下来，加入1 µL浓度为1毫摩尔的鱼藤酮，使终浓度为0.5 µmol。然后，加入2 µL浓度为1毫克/毫升的抗霉素母液，使终浓度为1微克/毫升。通过提起活塞，将反应室重新充氧至相同的氧浓度水平，约为150 µmol。随后，加入 5 µL 的 0.8 M 抗坏血酸盐，使其终浓度为 2 mM。然后立即加入 5 µL 的 0.2 M TMPD，使其终浓度为 0.5 mM，并测定复合体 IV 活性。当 TMPD 达到峰值氧通量时，加入 5 µL 的 4 M 叠氮化钠，使其终浓度为 10 mM。然后，继续运行至少五分钟，以检测TMPD的自氧化反应，用于计算复合体IV的基础水平。运行结束后，从每个腔室中收集一毫升样品悬液，对于透化细胞在1,000 G条件下离心，对于组织裂解液则在20,000 G条件下离心。随后，弃去上清液，将沉淀物在-80摄氏度下冷冻，用于后续分析。首先，根据各细胞系的生长速率接种细胞。将寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素用3微升检测培养基分别稀释至终浓度为1.5 µM、1.125 µM和1 µM。随后，将它们分别加入不同的加样孔中。观察进样口，确保样品加载均匀。打开基于微孔板的系统和计算机，并在37摄氏度下平衡至少三小时。在进行微孔板检测的当天，确认细胞培养板的汇合度、细胞形态，并确保背景孔为空。然后，从每个孔中除去培养基，仅保留20微升。接着，用90微升检测培养基洗涤每个孔，并加入100微升检测培养基，使最终体积达到120微升。接下来，将培养板置于37摄氏度、无二氧化碳的培养箱中孵育60分钟。从培养箱中取出培养板后，移去盖子，将微孔板放入插槽中。点击“继续”以开始运行。运行结束后，取出培养板，并在不扰动细胞的情况下移除残留的检测培养基。然后，将整个培养板在-80摄氏度下冷冻。在完成皂苷透化及呼吸实验后，记录了野生型HEK293细胞以及通过CRISPR介导的基因敲除导致多种OXPHOS缺陷的HEK293细胞的原始耗氧轨迹。获得了经细胞数量归一化的叠加耗氧轨迹。与野生型细胞相比，在归一化到细胞数量后，CRISPR敲除1表现出呼吸功能受损，而CRISPR敲除2则无呼吸活性。通过定量蛋白质含量，并将呼吸值归一化到蛋白量，以确定呼吸状态的绝对值及相应的通量控制比率。CRISPR敲除2中氧化磷酸化缺陷导致胞外酸化率升高，表明HEK293细胞通过增强糖酵解来补偿线粒体氧化磷酸化的缺陷。此外，在存在寡霉素、FCCP 和鱼藤酮的情况下测定了呼吸值，并将获得的数值归一化至蛋白含量。研究了野生型 HEK293 细胞以及通过 CRISPR 介导的线粒体翻译缺陷导致多种氧化磷酸化缺陷的 HEK293 细胞的蛋白归一化耗氧轨迹。获得了小鼠小脑和小鼠比目鱼肌组织湿重归一化的耗氧轨迹。比目鱼肌的氧化磷酸化（OXPHOS）和呼吸能力比小脑高出三倍。使用腔室式呼吸测定法时，操作需迅速，因为一旦采集样本，线粒体功能便会开始下降；而使用微孔板式呼吸测定法时，关键在于获得最佳的接种密度，以尽量减少实验变异性。此外，还可进行蛋白质定量或免疫印迹分析以进一步研究。这可以确定线粒体呼吸功能的改变是由于OXPHOS复合物的丰度变化，还是线粒体数量变化所致。早在一个世纪前，就发现癌细胞除了进行线粒体OXPHOS外，还会进行无氧糖酵解。这凸显了检测线粒体生物能量学的必要性。在此，我们展示了两种目前被视为金标准的呼吸计。

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科研

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生物学

高分辨率呼吸测定法，使用基于腔室和板式呼吸计评估细胞和组织中的生物能量学

高分辨率呼吸测定法用于测定线粒体的耗氧量。该方法是一种简单直接的技术，可用于测定线粒体呼吸链复合物（I-IV）的呼吸速率、线粒体电子传递系统最大容量以及线粒体外膜的完整性。...

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人视网膜色素上皮细胞（H-RPE）的代谢状态反映了其健康状况和功能。本文介绍了一种利用高分辨率呼吸测定法检测H-RPE实时代谢通量的优化方案。...

利用高分辨率呼吸测定法对原代人视网膜色素上皮细胞中的生物能量学进行实时分析

通过高分辨率呼吸测定法分析精子线粒体功能，可在封闭式反应室系统中测量自由运动精子的耗氧量。该技术可用于测定人类精子的呼吸作用，从而提供有关精子线粒体特征及其完整性的信息。...

高分辨率呼吸测定法评估人类精子线粒体功能

分离的外周血单个核细胞可用于免疫功能和免疫相关疾病、代谢性疾病或线粒体功能的研究分析。本文中，我们描述了一种从全血中制备外周血单个核细胞（PBMCs）并进行后续冷冻保存的标准方法。冷冻保存使得实验在时间和空间上具有独立性。...

人外周血单个核细胞的冷冻保存与生物能量学评估

本文表明，如果进行了适当的仪器O2 背景校正，0.5 mL高分辨率呼吸测量室所获得的结果与2.0...

小体积腔室中的高分辨率呼吸测定法

本文介绍了一种利用灭活细菌在秀丽隐杆线虫（C.

基于固体平板的饮食限制方法 秀丽隐杆线虫

聚合酶链式反应（PCR）结合高分辨率熔解分析（HRMA）被证明是一种快速高效鉴定斑马鱼基因型的方法。...

利用高分辨率熔解分析结合PCR进行斑马鱼快速高效基因分型

代谢紊乱是人类最常见的疾病之一。利用遗传操作简便的模式生物 D. melanogaster 可用于鉴定调控代谢的新型基因。本文描述了一种相对简单的方法，通过测量果蝇的 CO2...

使用呼吸测定法测量 Drosophila 的代谢率

了解高分辨率呼吸测定法，使用腔室和板式呼吸计评估HEK293细胞及小鼠组织的线粒体生物能量学。该方法可实时测量氧消耗，为线粒体疾病诊断提供关键依据。

使用腔室型和板式呼吸仪通过高分辨率呼吸测定法评估细胞和组织的生物能量学

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