利用高分辨率熔解分析在蚊子Aedes aegypti中检测CRISPR/Cas9诱变后的插入缺失
2021年9月10日
本文详细介绍了一种利用高分辨率熔解分析对埃及伊蚊（Aedes aegypti）中由CRISPR/Cas9诱导的插入缺失（indel）进行快速鉴定并筛选突变品系的实验方案。
该方案是一种非常简单且高效的方法，可用于从大量个体中检测由CRISPR/Cas9技术产生的突变体。该技术的两个主要优势在于可在数小时内完成，且适用于多种生物体。针对某些基因的引物设计可能具有挑战性，为实现高效高分辨率熔解曲线分析（HRMA），可能需要进行多轮引物设计与验证。
进行梯度PCR时，首先制备主混合液。然后从主混合液中取出19微升，加入96孔板中作为无模板对照（NTC）。接着，将模板加入剩余的主混合液中。
将20 µL样品混合物分装至96孔板中。按照循环参数进行PCR扩增，然后根据论文中所述参数生成熔解曲线。在收集所有所需材料后，为每个待基因分型个体配制含有0.5 µL DNA释放试剂和20 µL稀释缓冲液的主混合液。
使用多通道移液器，将20微升混合液分装至PCR板中，并将PCR板置于冰上。接着，将麻醉后的G1代蚊子放入玻璃培养皿中以保持其镇静状态，并将八只野生型蚊子放入第二个培养皿中。用70%乙醇擦拭一对镊子，使用消毒后的镊子去除其中一只蚊子的后肢。
然后，将蚊虫的腿浸入DNA释放试剂溶液中。将蚊虫放入对应的离心管中，并用海绵塞紧管口。操作完成后，在处理下一只蚊虫的腿之前，先用70%乙醇擦拭镊子，直至完成整个96孔板的操作。
随后，使用光学PCR板密封膜密封反应板，将含有腿部样本的PCR板在室温下孵育2至5分钟，接着在98摄氏度孵育2分钟。待反应板冷却至室温。进行PCR时，配制含有所需组分的预混液，然后使用多通道移液器将19 µL预混液加入96孔板的每个孔中。
将含有先前制备的蚊子 DNA 的 DNA 释放溶液 1 微升转移至孔板后，使用光学 PCR 孔板密封膜密封孔板。采用适当的扩增循环参数进行 PCR，以生成热熔曲线图谱，具体参数参见论文中的描述；随后通过将野生型对照指定为参考簇来分析熔解曲线图谱。在 96 孔模板上用相应的颜色标记不同的簇。
接下来，选择具有目标表型的个体，并将选中的个体从试管中取出进行回交。对这些雌性个体进行血液饲喂，随后收集G2代成虫。在代表性分析中，展示了埃及伊蚊ZIP11突变体的序列分析结果。
埃及伊蚊 ZIP11 杂合突变体的电泳图谱显示了插入缺失（indel）发生的核苷酸位置。插入缺失表现为由单峰转变为双峰，因为多态性位点同时显示两种核苷酸。在测序结束时，通过计数单峰的数量来计算被删除或插入的碱基对数目。
通过高分辨率熔解分析（HRMA）对含有埃及伊蚊 ZIP11 和 myo-fem 基因突变的蚊子进行基因分型，并通过测序验证。将样品的荧光信号归一化为 0 到 1 的相对值。此外，每条曲线均减去野生型参考曲线，并标注相应的放大倍数。
在代表性结果中显示了一个自动聚类分配失败的示例，其中各组之间未能正确区分。此外，每个样本均被单独分析，并根据其与杂合子、纯合子及反式杂合子参考样本的相似性被分配至正确的组别。在完成高分辨率熔解曲线分析（HRMAs）后，必须对突变个体的DNA进行测序，以分析插入缺失突变（indels）并鉴定靶向序列中的其他突变。
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概述
本文详细介绍了一种利用高分辨率熔解曲线分析快速鉴定CRISPR/Cas9在埃及伊蚊（Aedes aegypti）中诱导的插入缺失突变并筛选突变品系的实验方案。该方法高效且适用于多种生物体，可实现对突变体的快速检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 遗传学
- 分子生物学
- 昆虫学
背景
- CRISPR/Cas9 技术被广泛用于基因编辑。
- 高效鉴定突变对于遗传学研究至关重要。
- 高分辨率熔解曲线分析（HRMA）提供了一种快速检测方法。
- 引物设计中的挑战可能影响 HRMA 的效率。
研究目的
- 提供一种用于鉴定CRISPR诱导突变的实验方案。
- 展示高分辨率熔解曲线分析（HRMA）在多种生物中的适用性。
- 简化突变品系筛选的流程。
使用的方法
- PCR主混合液的配制。
- 在96孔板中使用无模板对照（NTC）。
- 梯度PCR以优化反应条件。
- 高分辨率熔解曲线分析用于检测插入缺失突变（indels）。
主要结果
- 该方案可实现对突变体的快速鉴定。
- 高分辨率熔解曲线分析（HRMA）可在数小时内完成。
- 为提高效率，可能需要进行多轮引物设计。
- 该方法适用于不同物种，具有良好的通用性。
结论
- 该方案提高了突变检测的效率。
- 它为蚊子的遗传学研究提供了有价值的工具。
- 未来的研究可在此方法基础上拓展更广泛的应用。
常见问题
行业重要性概述
快速检测 CRISPR/Cas9 诱导的插入缺失突变（indels）可实现媒介生物防控研究中高效的靶点验证，缩短功能基因研究的时间周期。高分辨率熔解曲线分析能够在不牺牲生物体的前提下支持大规模基因分型，便于后续表型分析和遗传杂交实验。该方法通过微量组织样本即可实现突变的定量检测，从而在早期发现阶段提高预测的可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过CRISPR诱变后快速检测插入缺失突变（indel），实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：在不牺牲生物体的情况下识别突变等位基因，保留样本用于后续实验，支持生物学风险评估。
- 项目影响：加速靶点验证工作流程，推动在与疾病相关的系统中更快地优先筛选基因靶点。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成标准化的荧光熔解曲线，可实现对野生型和突变型基因型的定量比较。
- 操作价值：兼容96孔板格式，支持对基因编辑个体进行中等通量筛选。
- 检测就绪性：可为杂合子、纯合子和反式杂合子生成可区分的熔解曲线图谱，从而实现可靠的聚类分析。
转化与临床前研究
- 转化连续性：可在基因分型后进行表型分析或血液饲喂，将遗传修饰与疾病模型中的功能结果相联系。
- 机制性风险降低：通过下游测序实现插入缺失（indel）的表征，确认靶向效应并识别潜在的脱靶修饰。
- 临床前模型支持：可在埃及伊蚊（Aedes aegypti）中建立突变品系，该蚊种是虫媒病毒传播研究的关键媒介。
流程与工作流整合
该方法适用于从CRISPR诱变到先导物鉴定的发现连续过程，在功能验证之前提供基因分型检查点。
- 发现生物学：通过快速鉴定破坏靶向通路中基因功能的插入缺失突变（indels），支持假设验证。
- 筛选：通过标准化熔解曲线分析和基于参考的聚类，实现检测方法的标准化。
- 分析：生成与插入缺失突变大小相关的定量熔解曲线偏移，支持样本间的比较分析。
- 转化研究：通过在基因分型后允许使用活体生物，将遗传修饰与表型评估相连接。
- 企业级复用：可在不同生物体和基因间重复使用，引物设计的可适应性支持广泛的靶标适用性。
运营与企业影响
- 科学价值：通过提供基因编辑结果的直接证据，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化的PCR和熔解分析流程并内置对照，增强实验的可重复性。
- 战略价值：减少突变体筛选所需的时间和资源，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：在投入表型分析之前确认突变的存在，实现基于风险评估的项目推进。
实施注意事项
- 需要具备引物设计与优化的专业知识，因为某些基因可能需要多次设计迭代才能实现高效的高分辨率熔解分析（HRMA）。
- 依赖于具备精确温度 ramp 控制和荧光检测功能的仪器，以进行高分辨率熔解分析。
- 需要采用腿部组织和DNA释放试剂进行标准化的样本制备，以确保输入材料的一致性质量。
- 需要野生型参考样本，以实现准确的聚类分配和熔解曲线图谱的标准化。
- 受限于在HRMA之后仍需进行测序，以全面表征插入缺失突变（indels）并检测目标序列中的其他突变。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
