Name: 一种基于报告基因的细胞检测，用于监测剪接效率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学习基于报告基因的细胞检测方法，用于监测HeLa细胞中的剪接效率，研究疾病相关突变对剪接位点的影响，并开发抑制性U1 snRNA以拯救剪接缺陷，为治疗剪接相关疾病提供潜在策略。

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本研究获得了美国国立卫生研究院（R21CA170786 和 R01GM127464）、美国癌症协会（机构研究基金 74-001-34-IRG）向 S.S. 提供的资金支持，以及 Valley Research Partnership Program 向 S.S. 和 W.M. 提供的资金支持（P1-4009 和 VRP77）。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

1. 试剂与缓冲液
注意：所有使用真空滤器的灭菌操作均应在生物安全柜中使用0.2 µm聚醚砜（PES）膜进行。
<ol>
	<li>通过向 1.0 L 去离子水中加入 1.0 mL 二乙基焦碳酸酯（DEPC），在室温（RT）下混合至少 1 小时，高压灭菌两次，然后冷却至室温后使用，制备无 RNase 水。</li>
	<li>通过将一包 DMEM 粉末（13.4 g）、3.7 g 碳酸氢钠、100 mL 胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素加入约 800 mL 无菌去离子水中来制备 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）。DMEM 中青霉素和链霉素的终浓度应分别为 50 U/mL 和 50 µg/mL。调节 pH 至 7.4，然后用无菌去离子水定容至 1.0 L。过滤除菌后，于 4 °C 保存。</li>
	<li>通过将 25.6 g 七水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）、2 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）、2 g 氯化钾（KCl）和 80 g 氯化钠（NaCl）加入 800 mL 去离子水中来制备 10× 磷酸盐缓冲液（10× PBS）。搅拌溶解后定容至 1.0 L。过滤除菌后，于 4 °C 保存。</li>
	<li>通过将 186.1 g Na2•EDTA•2H2O 溶解于约 800 mL 去离子水中来制备 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）。调节 pH 至 8.0，然后用无菌去离子水定容至 1.0 L。过滤除菌后，于 4 °C 保存。</li>
	<li>通过将 100 mL 10× 胰蛋白酶（2.5%）、2 mL 0.5 M EDTA 混合，并用 1× PBS 定容至 1.0 L，制备 1× 胰蛋白酶-EDTA 溶液。过滤除菌后分装至 50 mL 锥形管中。于 4 °C 保存 1–2 周，或于 -20 °C 冻存以长期使用。</li>
	<li>通过将 14.4 mL 甲酰胺与 0.6 mL 0.5 M EDTA 混合，终体积为 15 mL，制备 2× 甲酰胺 DNA/RNA 上样染料。加入溴酚蓝和二甲苯蓝染料粉末至终浓度 0.02%，并于 4 °C 保存。 
	注意：甲酰胺具有毒性且具腐蚀性。请查阅材料安全数据表以获取额外的安全建议。</li>
	<li>通过将 54.0 g Tris 碱、27.5 g 硼酸和 20 mL 0.5 M EDTA 混合于约 800 mL 去离子水中，制备 5× Tris/硼酸/EDTA（5× TBE）缓冲液。搅拌至溶解后，用去离子水定容至 1.0 L。</li>
	<li>通过将 200 mL 5× TBE、250 mL 40% 19:1 双丙烯酰胺/丙烯酰胺和 450.5 g 尿素混合，制备尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（尿素-PAGE）溶液。然后加去离子水至 1.0 L。搅拌至成分完全溶解，过滤除菌后，于 4 °C 棕色玻璃瓶中保存。 
	注意：双丙烯酰胺/丙烯酰胺具有毒性。请查阅材料安全数据表以获取额外的安全操作规程。</li>
	<li>通过将 1 g 过硫酸铵（APS）溶解于 10 mL 去离子水中制备 10% 过硫酸铵（APS），并于 4 °C 保存。</li>
</ol>
2. 报告基因质粒与U1 snRNA质粒共转染HeLa细胞
注意：Hela 细胞的转染必须在生物安全柜内的无菌条件下进行。所有材料的外表面在放入生物安全柜之前，必须用 70% 乙醇喷洒处理。
<ol>
	<li>在37 °C、5% CO2的培养箱中，使用DMEM培养Hela细胞，当细胞融合度达到约80-90%时，每2-3天传代一次。</li>
	<li>传代Hela细胞时，吸除废弃培养基，加入3 mL含1 mM EDTA的0.25%胰蛋白酶，在37 °C下孵育3分钟。</li>
	<li>孵育后，加入7 mL新鲜DMEM，将细胞悬液转移至10 mL离心管中，以1,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>用10 mL新鲜DMEM重悬细胞沉淀，然后将细胞以20%融合度接种至新的组织培养皿中。</li>
	<li>进行瞬时转染时，使用洁净的血细胞计数板对Hela细胞进行计数，并制备密度为2.5 × 105 个细胞/mL的细胞悬液。</li>
	<li>将1.0 mL浓度为2.5 × 105 个细胞/mL的Hela细胞悬液接种至12孔板的每孔中，于37 °C孵育过夜。</li>
	<li>次日，吸除废弃培养基，向每孔加入0.8 mL含血清的新鲜DMEM。</li>
	<li>在新的1.5 mL微量离心管中，加入0.2 µg Dup51或Dup51p报告质粒、1.8 µg pcDNA、pNS6U1或pNS6U1-5a质粒以及100 µL转染培养基，配制溶液I。</li>
	<li>为所有待转染样品配制溶液II的主混合液：每份样品加入100 µL转染培养基和4.0 µL转染试剂。</li>
	<li>将100 µL溶液II加入各含有溶液I的微量离心管中，制备转染混合液。</li>
	<li>将转染混合液涡旋振荡15秒，在台式微量离心机中以3,000 × g、室温离心10秒，随后在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>将全部200 µL转染混合液加入12孔板Hela细胞培养板的某一孔中，使每孔终体积为1.0 mL，并将培养板置于37 °C孵育48小时。</li>
	<li>孵育结束后，使用市售的硫氰酸胍-苯酚溶液从转染的Hela细胞中提取RNA。 
	注：该试剂含有苯酚，此步骤应在通风橱中操作。建议使用DEPC处理水重悬提取的RNA。
	<ol>
		<li>吸除废弃培养基，向每孔加入500 µL试剂，在室温下孵育5分钟。</li>
		<li>通过移液上下吹打进行匀浆，然后将溶液转移至新的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>加入100 µL氯仿，涡旋振荡15秒。</li>
		<li>在室温下以12,000 × g离心15分钟。</li>
		<li>将含RNA的上层水相200 µL转移至新的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>向每个RNA样品中加入2 µg糖原和200 µL异丙醇，通过翻转混匀。</li>
		<li>在4 °C下以12,000 × g离心10分钟，收集RNA沉淀。</li>
		<li>小心移除并弃去上清液，避免扰动RNA沉淀。</li>
		<li>用1.0 mL 70%乙醇洗涤沉淀两次：加入乙醇后翻转混匀，按步骤2.13.7所述条件离心。</li>
		<li>在室温下晾干沉淀约10-20分钟，用10-20 µL无RNase的水重悬RNA。</li>
		<li>通过测定260 nm处的吸光度确定RNA浓度，方法参照Desjardins和Conklin9的描述。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可继续进行引物延伸实验，或将RNA样品储存于-20 °C。分离的RNA可在-20 °C下保存6-12个月。</li>
</ol>
3. 寡核苷酸的32P标记
注意：涉及使用 32P-ATP 和 32P 标记寡核苷酸的操作必须由经过培训的人员在获得授权机构批准后于丙烯酸防护罩后进行。以下所述方案可用于寡核苷酸 Dup3r 和 U17-26-R 的标记，以及尿素-PAGE 的分子量标记物制备。建议使用经 DEPC 处理的水重悬寡核苷酸和凝胶过滤珠。
<ol>
	<li>向一个1.5 mL微量离心管中加入寡核苷酸、T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）、T4 PNK缓冲液以及32P-ATP，具体如表1所述。请最后加入32P-ATP；此步骤至关重要。 
	注意：添加放射性溶液时，建议使用滤芯吸头。</li>
	<li>在37 °C水浴中孵育30分钟。</li>
	<li>在标记反应孵育的同时，通过轻轻涡旋约10秒，重悬分子量截断值为25 kDa的凝胶过滤珠。 
	注意：凝胶过滤珠应按照生产商说明书进行制备，并以50%悬浮液形式保存于含25%乙醇的溶液中，置于4 °C储存。</li>
	<li>将重悬后的凝胶珠600 μL转移至置于1.5 mL收集管中的一次性微型层析柱中，以制备层析柱，并将剩余凝胶珠原液放回4 °C保存。</li>
	<li>在室温下以2,000 × g离心1分钟，弃去穿流液。</li>
	<li>向层析柱中加入300 µL无RNase水，洗涤凝胶珠。</li>
	<li>重复步骤3.5和3.6两次，然后将微型层析柱转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>将激酶反应混合物加入凝胶过滤珠层析柱中，在室温下以5000 × g离心1分钟。</li>
	<li>收集并保存含有32P标记寡核苷酸的穿流液，将所有吸头和离心管弃入丙烯酸废液盒中。</li>
	<li>加入20 µL无RNase水，将32P标记的寡核苷酸稀释至终浓度为2.5 µM。 
	注意：根据需要稀释标记探针，以便上样至尿素-PAGE凝胶。</li>
	<li>将标记的寡核苷酸储存于丙烯酸微量离心管盒中，置于-20 °C保存，或直接进行引物延伸分析。</li>
</ol>
4. 通过引物延伸分析剪接后的报告基因转录本
注意：建议在使用前用RNase失活试剂清洁表面和设备。
<ol>
	<li>取2.0 µg从Hela细胞中提取的RNA，分别加入到200 μL微量离心管中，并加入无RNase的水，使总体积补至6.55 µL。</li>
	<li>按照表2所示，用稀释的32P-Dup3r和dNTPs配制主混合液I，并向每个含有RNA样品的PCR管中加入0.9 µL该混合液。</li>
	<li>将离心管先在65 °C孵育5分钟，然后置于冰上1分钟。</li>
	<li>按照表2所示，用5×第一链缓冲液、二硫苏糖醇（DTT）、RNase抑制剂和逆转录酶配制主混合液II。</li>
	<li>向每个含有RNA和主混合液I的离心管中加入2.55 µL上述混合液，使反应总体积为10 µL。室温下放置10分钟。</li>
	<li>将离心管转移至干式恒温仪或PCR仪中，先在50 °C孵育60分钟，然后在70 °C孵育15分钟。</li>
	<li>孵育结束后，向每个样品中加入10 µL 2×变性甲醛RNA上样染料，置于丙烯酸盒中于-20 °C保存，或按照下文第8步所述，使用14 cm长的凝胶进行尿素-PAGE分离并成像。</li>
	<li>使用图像分析软件对凝胶图像进行密度扫描，并根据包含型与跳过型产物的条带强度计算外显子2的包含百分比，如下所示。 
	<img alt="基因表达研究中用于强度比分析的外显子2包含公式。" src="/files/ftp_upload/63014/63014eq01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
5. 通过荧光RT-PCR分析剪接后的报告基因转录本
注意：下述 RT-PCR 分析采用随机六聚体进行 cDNA 合成，并使用未标记的 Dup8f 与 Cy5 标记的 Dup3r 寡核苷酸组合扩增剪接产物。
<ol>
	<li>进行 cDNA 合成时，将从转染的 Hela 细胞中提取的 2.0 µg RNA 分别加入到多个 200 μL 微离心管中，并加入无 RNase 的水，使总体积补足至 11.0 µL。</li>
	<li>按 Table 3 所示配制包含随机六聚体和 dNTP 的主混合液 I（Master Mix I），并向每个样品中加入 2.0 μL 该混合液。先在 65 °C 孵育 5 分钟，然后置于冰上 1 分钟。</li>
	<li>按 Table 3 所示配制包含第一链缓冲液（First Strand Buffer）、RNase 抑制剂、DTT 和逆转录酶的主混合液 II（Master Mix II），并向含有 RNA 和主混合液 I 的各管中加入 7.0 μL 该混合液。</li>
	<li>将各管在室温（RT）下放置 10 分钟，随后在 50 °C 孵育 60 分钟，再在 70 °C 孵育 15 分钟。 
	注意：完成的 cDNA 反应产物可保存于 -20 °C。</li>
	<li>进行 PCR 时，将每种 cDNA 样品各取 1.0 μL（100 ng/μL）转移至新的 PCR 管中。</li>
	<li>按 Table 4 所述配制包含 Dup8f、Cy5-Dup3r、dNTPs、Taq 缓冲液、Taq 聚合酶和水的主混合液，并向每管含有 cDNA 的样品中加入 11.5 μL 该混合液。</li>
	<li>使用 PCR 仪进行扩增，程序包括：94 °C 预变性 3 分钟；随后进行 20 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 30 秒、65 °C 退火 30 秒、72 °C 延伸 15 秒；最后在 72 °C 终止反应 5 分钟。</li>
	<li>向每管中加入 12.5 µL 的 2× 甲酰胺 DNA 上样染料，并在 95 °C 加热 5 分钟。</li>
	<li>PCR 反应产物可保存于 -20 °C，或按以下步骤 8.1–8.4 进行尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（urea-PAGE）。</li>
	<li>电泳完成后，从电泳装置中取出玻璃板，使用荧光成像仪扫描以观察凝胶。</li>
	<li>对凝胶图像进行密度扫描，利用包含产物和跳跃产物的条带强度，按步骤 4.8 所述方法计算外显子 2 的包含百分比。</li>
</ol>
6. 通过引物延伸分析变异型 U1 snRNA 的表达
<ol>
	<li>添加 2.0 µg 从Hela细胞中提取的RNA分别放入 200 μL 微型离心管中加入无RN酶水，补足体积至 4.325 µL 然后加入 dATP，如表 5 所示。</li>
	<li>加入10,000 CPM的 32P-U17-26向每支试管中加入 R 寡核苷酸。 
	注意：要制备 10,000 cpm/μL 溶液 32P-U17-26- R（来自步骤3），将标记的寡核苷酸稀释（1:20稀释），测定cpm 1.0 μL 使用闪烁计数器测定，并用去离子水进一步稀释，制备成 10,000 cpm/ 的溶液μL 在新的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>孵育于 65 °C 5 分钟，然后冰上放置 1 分钟。</li>
	<li>按照所示，用5x第一链缓冲液、RNase抑制剂、DTT和逆转录酶配制主混合液 表5 并添加 1.8 µL 将混合液分别加入各样品中。</li>
	<li>孵育，先在室温下孵育10分钟，然后在 42 °C 10分钟</li>
	<li>孵育后，加入 10 µL 将2x甲酰胺RNA上样染料加入各样品中，置于丙烯酸盒中于-20 °C 或使用38 cm长的胶进行尿素-PAGE分离片段（参见步骤8）。</li>
</ol>
7. 通过RT-qPCR分析U1 snRNA变异体的表达
<ol>
	<li>将按照上述步骤 5.1 - 5.4 所制备的 cDNA 原液稀释至浓度为 0.2 ng/µL。</li>
	<li>取 5.0 µL 稀释后的 cDNA，分别以三复孔加入 96 孔 qPCR 板的各个孔中。以去离子水替代 cDNA 作为无模板对照（NTC）。</li>
	<li>分别配制两种独立的引物混合液，包含针对 U1 和 U2 snRNA 的正向与反向引物以及水，具体如 表 6 所示。 
	注意：U1 和 U2 snRNA 特异性引物的序列见 表 7。</li>
	<li>向样品孔和 NTC 孔中各加入 5.0 µL 的 U1 和 U2 snRNA 引物混合液。</li>
	<li>向每孔中加入 10.0 µL 实时 PCR 混合液。</li>
	<li>用光学膜密封反应板，然后在室温下以 1,000 × g 离心 2 分钟，使反应液收集至孔底。</li>
	<li>进行 qPCR 扩增，程序包括：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 40 个循环的两步法扩增（95 °C 变性 15 秒，62 °C 退火/延伸 60 秒），同时采集目标扩增子的阈值循环（Cq）值。</li>
	<li>通过检测 U1 和 U2 snRNA 反应的熔解曲线是否呈现单一峰，确认 qPCR 反应的特异性。</li>
	<li>根据 Cq 值，计算 U1 和 U2 snRNA 相对于 pcDNA 对照的 ΔCq 值。</li>
	<li>利用 ΔΔCq 值，根据下述公式计算所有样品中 U1 snRNA 相对于 U2 的变异表达量（相对表达量，RQ）。 
	<img alt="ΔCq 方程；比较定量；基因表达；公式；科学研究。" src="/files/ftp_upload/63014/63014eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 2"> 
	<img alt="基因表达分析，ΔΔCq=ΔCqU1−ΔCqU2，qPCR 结果，比较法。" src="/files/ftp_upload/63014/63014eq03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 3"> 
	<img alt="qPCR 结果公式，RQU1=2^-ΔΔCq 方程，基因表达分析。" src="/files/ftp_upload/63014/63014eq04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 4"></li>
</ol>
8. 尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Urea-PAGE）凝胶的制备与运行
注意：玻璃板和凝胶电泳装置的组装应按照制造商的说明进行。10% 尿素-PAGE 凝胶的制备可依据 Summer 等人先前描述的方案10进行。以下描述了标记物和样品的制备、凝胶电泳及凝胶显影的步骤。可选步骤：为防止凝胶粘附在玻璃板上，可在内表面涂覆硅化溶液，方法是加入 1 mL 该溶液，并用纸巾将其均匀涂布至整个表面。待其干燥后，应使用去离子水清洗玻璃板并再次干燥。
警告：未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，必须按照材料安全数据表中推荐的防护措施进行操作。
<ol>
	<li>将引物延伸样品和标记物在95 °C加热5分钟，然后在室温下于台式微量离心机中以3,000 x g离心5秒，进行准备。</li>
	<li>在上样前，用1x TBE缓冲液冲洗加样孔，以去除沉淀的尿素。</li>
	<li>每孔上样10 μL，以300–500 V电泳2–3小时，或直至二甲苯青染料迁移至凝胶底部。 
	注意：可上样约1,000 cpm的32P标记物。</li>
	<li>电泳结束后，从电泳装置中取出玻璃板。</li>
	<li>小心分开两块玻璃板，使凝胶平整地附着在任一玻璃表面，将凝胶转移至滤纸上，并用塑料膜覆盖。</li>
	<li>使用凝胶干燥仪在80 °C下真空干燥凝胶30分钟。</li>
	<li>将干燥后的凝胶放入磷屏成像暗盒中，室温避光放置过夜。 
	注意：使用前应通过光源箱擦除磷屏上的信号。</li>
	<li>为观察凝胶图像，取出磷屏并使用磷屏成像仪进行扫描。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该检测方法可适用于HeLa以外的细胞系中的剪接分析，但可能需要优化影响转染效率的因素，例如细胞融合度和DNA用量。报告基因与U1构建体的比例是另一个关键参数，可能需要根据在其他细胞类型中观察到的表达水平来确定。提取RNA的质量对剪接分析至关重要；因此，强烈建议使用无RNase的水，并用RNase失活剂对实验表面进行去污染处理。
通过引物延伸或荧光RT-PCR分析报告基因转录本可获得相似的结果，因此这两种技术均可用于监测成熟转录本中外显子2包含情况的变化。荧光PCR反应必须在扩增的指数期停止并进行定量，该阶段依赖于初始RNA浓度。因此，对于与本文所述不同的转染条件，可能需要确定扩增循环次数。RT-PCR检测由于无需使用放射性物质，操作简便，具有明显优势。尽管使用放射性标记引物的引物延伸法需要额外的安全防护措施，但其能够检测到极少量RNA产生的信号。引物延伸和RT-PCR的通量较低，是本检测方法的局限性。
U1 snRNP互补实验已被用于多种目的。除了逆转5′剪接位点突变的影响外，对U1 snRNA的5′区域进行改造后还可用于基因...

前体mRNA剪接是一个关键的加工步骤，可去除非编码的内含子，并精确连接编码的外显子以形成成熟的mRNA。剪接机器的组分通过识别外显子-内含子交界处的保守序列——即5′-剪接位点和3′-剪接位点——来启动剪接过程。U1小核核糖核蛋白（snRNP）通过U1 snRNA与前体mRNA的碱基配对识别5′-剪接位点1。遗传性突变若改变了5′-剪接位点序列，已知与多种疾病相关2,3。据预测，U1 snRNA与突变型5′-剪接位点之间碱基配对的丧失&#160;会导致异常剪接，从而影响受影响转录本的翻译。一种潜在的治疗策略是利用经过修饰的U1 snRNA来抑制突变效应，该U1 snRNA在其5′-区域携带补偿性核苷酸改变，可与突变的5′-剪接位点重新形成碱基配对。这类修饰后的U1 snRNA也被称为外显子特异性U1 snRNA，已被证实可有效逆转剪接缺陷，从而提高 rescued mRNA 所介导的蛋白表达水平4,5,6,7,8。
在此，我们介绍U1 snRNP互补化检测，这是一种基于报告基因的细胞剪接检测方法，可用于评估5'剪接位点突变对剪接功能的影响′-ss突变对某个外显子剪接的影响，并可用于开发修饰型U1 snRNA，以实现外显子包含的挽救。我们还提供了通过引物延伸和RT-PCR检测剪接报告转录本的实验方案，以及通过引物延伸和RT-qPCR测定修饰型U1 snRNA表达水平的方法。

<table><tbody><tr><td>试剂级去离子水</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-751628</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-25ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基粉末（Dulbecco改良Eagle培养基）</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），澳洲来源，经热灭活</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-22</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（P/S）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠标准溶液 1.0N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2567-16A</td><td></td></tr><tr><td>盐酸，ACS Plus认证，36.5%至38.0%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>一次性PES瓶顶滤器</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB12566510</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）</td><td>Amresco</td><td>0105-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>2.5%胰蛋白酶（10倍浓度），无酚红</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠七水合物</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>转染培养基 - Opti-MEM&amp;trade; I 低血清培养基，无酚红</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂 - Lipofectamine&amp;trade; 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&amp;trade; 试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>氯仿（约含0.75%乙醇作为防腐剂，分子生物学级）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，无水（200 proof），分子生物学级，Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇，分子生物学级，Fisher BioReagents</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2618-212</td><td></td></tr><tr><td>糖原（5 mg/ml）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R2052</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&amp;gamma;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml 铅屏蔽，1 mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG035C001MC</td><td></td></tr><tr><td>T4多核苷酸激酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>凝胶过滤填料 - Sephadex&amp;reg; G-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2580-10G</td><td></td></tr><tr><td>凝胶过滤微型柱</td><td>USA Scientific</td><td>1415-0600</td><td></td></tr><tr><td>pBR322 DNA-MspI 消化产物</td><td>New England Biolabs</td><td>N3032S</td><td></td></tr><tr><td>低分子量标记物，10-100 nt</td><td>Affymetrix</td><td>76410 100 UL</td><td></td></tr><tr><td>RNase失活试剂 - RNaseZAP&amp;trade;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP混合液（每种10 mM）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT&amp;trade; 重组核糖核酸酶抑制剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>逆转录酶 - M-MLV 逆转录酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28025013</td><td>用于引物延伸</td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>随机六聚体（50 &amp;micro;M）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>实时PCR预混液 - SYBR&amp;trade; Select Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;trade; III 逆转录酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td>用于cDNA制备</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>5X第一链缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺（&amp;ge;99.5%）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td>查阅材料安全数据表</td></tr><tr><td>溴酚蓝钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-5G</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯青FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱（白色晶体或结晶性粉末，分子生物学级）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>硼酸（结晶性，电泳级）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺:双丙烯酰胺 19:1（40%溶液，电泳级）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1406-1</td><td>查阅材料安全数据表</td></tr><tr><td>尿素（无色至白色晶体或结晶性粉末，分子生物学级）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）&amp;ge;98%，Pro-Pure，蛋白质组学级</td><td>VWR</td><td>M133-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）&amp;ge;99%，超纯</td><td>VWR</td><td>0761-25ML</td><td>查阅材料安全数据表</td></tr><tr><td>可调式平板凝胶系统，Expedeon</td><td>VWR</td><td>ASG-400</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&amp;trade; 玻璃板组，16.5 x 14.5 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-125NR</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&amp;trade; 玻璃板组，16.5 x 22.0 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-200NR</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap&amp;trade; 玻璃板组，16.5 x 38.7 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-400NR</td><td></td></tr><tr><td>GE储存式磷屏</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE28-9564</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon&amp;trade; FLA 7000 生物分子成像仪</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9610-73 AB</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter LS6500 液体闪烁计数器</td><td>GMI</td><td>8043-30-1194</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch 梯度PCR仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量PCR系统</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于报告基因的细胞检测法用于监测剪接效率

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

在基因表达过程中，前体mRNA剪接这一关键步骤涉及对剪接位点的精确识别以及剪接体复合物的有效组装，从而在成熟mRNA转运至细胞质之前连接外显子并去除内含子。剪接效率可能受到剪接位点突变、反式作用剪接因子的影响或治疗药物活性的调控。本文介绍了一种可用于监测任意给定外显子剪接效率的细胞实验方案。该实验采用一种可灵活设计的质粒载体，编码包含3个外显子和2个内含子的微型基因报告系统，可通过瞬时转染在哺乳动物细胞中表达。转染后提取全细胞RNA，通过引物延伸法或半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测报告mRNA中外显子剪接的效率。我们阐述了如何通过在报告系统中引入与疾病相关的5′剪接位点突变以评估其影响，以及如何通过共转染携带补偿性突变的U1小核RNA（snRNA）构建体来实现对这些突变的校正——该U1 snRNA的5′区发生突变后可与前体mRNA中外显子-内含子交界处的5′剪接位点形成碱基配对。因此，该报告系统可用于设计治疗性U1颗粒，以增强对突变5′剪接位点的识别。插入 顺式-作用&#160;调控位点，例如剪接增强子或沉默子序列，也可插入报告基因中，以研究U1 snRNP在特定选择性剪接因子介导的调控中的作用。最后，可将表达报告基因的细胞与小分子共同孵育，以确定潜在治疗药物对组成型pre-mRNA剪接或携带突变5′剪接位点外显子的剪接影响。总体而言，该报告基因检测可用于多种条件下剪接效率的监测，从而研究基本的剪接机制及与剪接相关的疾病。

剪接报告基因Dup51是一种源自人类β-珠蛋白基因的三外显子-两内含子微型基因，此前已有描述（图1A)11,12 我们通过引入与Usher综合征相关的原钙黏蛋白15（protocadherin 15）第3外显子中的5′剪接位点突变，构建了一种突变报告基因Dup51p。PCDH15) 基因13. 外显子2-内含子2连接处的5´剪接位点序列由CAG/GUUGGUAUC改为AUG/GUGUGUAUC（/表示外显子-内含子边界）图1B)14这些序列变化改变了5´-剪接位点与内源性U1 snRNA碱基配对的预测模式，并导致成熟转录本中第2外显子的缺失。图2）。这些突变的影响可通过U1 snRNA 5´区的补偿性改变而被抑制。将5´端尿嘧啶替换...

本方案描述了一种微型基因报告基因检测方法，用于监测5´剪接位点突变对剪接的影响，并开发了用于挽救突变所致剪接抑制的抑制性U1 snRNA。将报告基因和抑制性U1 snRNA构建体在HeLa细胞中表达，通过引物延伸或RT-PCR分析剪接情况。

在基因表达过程中，前体mRNA剪接的关键步骤包括对剪接位点的精确识别以及剪接体复合物的高效组装……

本方案描述了一种利用可调节管理报告系统监测剪接效率的细胞检测方法。该报告系统检测可用于研究外显子或剪接位点中与疾病相关的突变的影响，并设计用于增强突变体对5'剪接位点识别的治疗方法，特别是特定颗粒。在Hela细胞中，吸除培养基后，将细胞与3毫升含1毫摩尔EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液在37摄氏度下孵育3分钟。孵育后，加入7毫升新鲜DMEM，将细胞悬液转移至10毫升离心管中。离心收集细胞。然后用10毫升新鲜DMEM重悬细胞沉淀，并将细胞以20%融合度接种至新的组织培养皿中，用于瞬时转染。使用洁净的血细胞计数板对HeLa细胞进行计数，制备细胞密度为2.5 × 10⁵ 个细胞/毫升的细胞悬液，每孔加入1毫升细胞悬液至12孔板中，于37°C培养过夜。次日吸除旧培养基，每孔加入800 µL含血清的新鲜DMEM培养基。配制转染混合物，并涡旋震荡15秒。然后将混合物离心，并在室温下孵育5分钟。孵育结束后，将全部200微升转染混合物加入12孔HeLa细胞板的一个孔中，使每孔终体积达到1毫升，并将培养板在37摄氏度孵育48小时。已制备的标记反应正在进行孵育。轻轻涡旋振荡10秒，重悬25千道尔顿分子量截断的凝胶过滤珠。随后将600微升重悬的凝胶珠转移至置于1.5毫升收集管中的一次性小柱中，并将凝胶珠储备液放回4摄氏度保存。离心小柱并弃去流出液。然后用300微升无RNA水将柱子中的珠子洗涤两次。第二次洗涤后，将微型柱转移至一个新的1.5毫升离心管中，并将激酶反应混合物加入柱中。离心柱子，收集流出液，其中含有P32标记的寡核苷酸。取2微克从heli细胞中提取的RNA，加入200微升微量离心管中，再加入无RNA酶的水，使总体积达到6.55微升。随后，向每支含有RNA样本的PCR管中加入0.9微升的主混合液一，先在65摄氏度孵育5分钟，然后置于冰上1分钟。接着，向每支含有RNA和主混合液一的管中加入2.55微升的主混合液二，并在室温下孵育10分钟。孵育结束后，将试管转移至热循环仪中，先在50摄氏度孵育60分钟，然后在70摄氏度孵育15分钟。孵育完成后，向每个样品中加入10 µL 2×甲酰胺RNA上样染料，随后通过UIA凝胶电泳分离片段。Percy DNA合成。取两微克从截断的 HeLa 细胞中提取的 RNA，加入到 200 微升微量离心管中，并加入无 RNA 酶的水，使总体积达到 11 微升。接着，向每个样品中加入两微升的主混合液一，先在 65 摄氏度孵育 5 分钟，然后置于冰上 1 分钟。随后，向每根试管中加入七微升的主混合液二，将试管在室温下孵育 10 分钟，接着在 50 摄氏度孵育 60 分钟，最后在 70 摄氏度孵育 15 分钟。接下来，进行 PCR 时，将 cDNA 反应产物稀释至浓度为 100 纳克/微升，并将每种 cDNA 样品各取 1 微升转移至新的 PCR 管中。向含有 cDNA 的每根 PCR 管中加入 10.5 微升的预混液，然后进行 PCR 扩增。使用热循环仪完成 PCR 反应后。向每个离心管中加入 12.5 µL 的 2X 甲酰胺 DNA 上样缓冲液。将样品在 95 °C 下加热 5 分钟，随后进行 UIA 测序。用移液器将 5 µL 稀释后的 cDNA 加入 96 孔 qPCR 板的各个孔中，每样设三个复孔。接着向每个孔中加入10 µL实时PCR反应液，用光学膜密封反应板，并离心使反应液全部收集至孔底，然后进行qPCR，同时采集目标扩增子的阈值循环数（Cq值）。在上样前，用TBE缓冲液冲洗孔道以去除沉淀的尿素。随后每孔加入10 µL样品，以300至500伏电压电泳运行2至3小时，或直至二甲苯染料迁移至凝胶底部。电泳结束后，从电泳装置中取出玻璃板，小心分离两块玻璃板，使凝胶平整地附着在任一玻璃表面上，随后将凝胶转移至滤纸上，并用塑料膜覆盖，使用凝胶干燥仪在80°C下真空干燥30分钟，然后将干燥后的凝胶放入磷屏成像匣中，室温孵育过夜。当在HeLa细胞中表达时，剪接报告基因dup 51 minnijean会表达出成熟的全长转录本，其中外显子2被高效剪接。5'剪接位点突变以及dup 51 P可使外显子2的包含率从95%降低至30%，从而导致形成较短的转录本。dup 51 P 与 U15A SNRNA 共表达可挽救外显子二的剪接，并恢复全长转录本的形成。相比之下，与野生型 U1 或 U15G 变体共表达则对 dup 51P 的剪接无类似作用。通过引物延伸检测 U15A 变体转录本时，使用 U1 七至 26 寡核苷酸，该寡核苷酸长 20 个核苷酸，与 U1 SNRNA 第五个位置的腺嘌呤附近区域碱基配对。仅存在 DATP 时，内源性野生型 U1 snRNA 在 U1 第 7 至 26 位允许掺入两到三个核苷酸，产生长度为 22 或 23 个核苷酸的产物。对于 U15A 和 U15G 变体，延伸在加入单个腺苷酸后即终止，产生长度为 21 个核苷酸的产物。在对 U2 snRNA 表达量进行归一化后，转染的野生型 U1、U1 5g 以及 U15A 变体的表达量为内源性 snRNA 的三到五倍。提取RNA的质量对于剪接分析至关重要。因此，强烈建议使用无RNA酶的水，并利用RNAs失活剂对实验器具进行去污染处理。本文所述的报告系统可用于研究U1 snRNA在剪接调控中的作用，以逆转剪接位点突变导致的效应，并利用修饰的U1snRNA实现基因沉默。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

一种基于报告基因的细胞检测，用于监测剪接效率

本文介绍了一种制备稳定且小规模 HeLa 细胞核提取物的实验方案。该方案适用于需要使用少量细胞群体的实验，例如经药物或 RNA...

用于基因表达机制功能检测的小规模核提取物

已证明可变剪接调控参与上皮-间质转化（EMT），EMT 是多种生理和病理过程中的重要细胞程序。本文介绍了一种利用可诱导 EMT 模型检测 EMT...

上皮-间质转化过程中可变剪接的检测

串联剪接事件发生在相距不到12个核苷酸的位点之间。利用绝对定量PCR方法可以实现对这类剪接变异体比例的定量分析。本文描述了如何对STAT3基因的剪接变异体进行定量，该基因存在两个剪接事件，导致丝氨酸-701的包含或缺失以及α/β型C末端的产生。...

融合绝对定量与相对定量PCR数据以定量STAT3剪接变异体转录本

本文描述了一种旨在研究异常剪接对实体瘤和血液系统恶性肿瘤耐药性影响的实验方案。为此，我们分析了亲本株和耐药株的转录组谱型 体外...

利用RNA测序检测与药物耐药性相关的新剪接变异体 体外 癌症模型

利用RNA对小鼠脑切片中pre-mRNA选择性剪接进行定量分析 原位 杂交实验

SINEUP 是一类合成的反义非编码 RNA，包含一个结合域（BD）和一个效应域（ED），可上调靶标 mRNA 的翻译。本文中，我们描述了在培养细胞系中检测 SINEUP 的方法，以及通过 Western...

基于细胞的SINEUP非编码RNA检测方法，可特异性增强mRNA翻译

本方案提供了一种快速且实用的工具，用于评估在化疗处理后功能尚未明确的蛋白质在选择性剪接调控中的作用。...

利用E1A微基因工具研究mRNA剪接变化

ACT1-CUP1检测确定芽殖酵母剪接体突变体对底物特异性的敏感性

我们开发了一种可用于细胞的内含子微小RNA（microRNA）生成报告检测方法 体外 使用四种质粒：一种携带内含子miRNA，一种携带靶序列，一种用于过表达调控蛋白，一种用于Renilla荧光素酶。miRNA被加工处理后，可通过结合靶序列来调控荧光素酶的表达。...

一种用于分析哺乳动物细胞中内含子microRNA成熟的报告基因检测方法

我们介绍了利用基于发光的染色体外报告底物体系来评估细胞中双链断裂修复通路功能完整性的实验方案。...

基于高通量定量发光报告系统的DNA双链断裂修复活性评估

学习基于报告基因的细胞检测方法，用于监测HeLa细胞中的剪接效率，研究疾病相关突变对剪接位点的影响，并开发抑制性U1 snRNA以拯救剪接缺陷，为治疗剪接相关疾病提供潜在策略。

基于报告基因的细胞检测法用于监测剪接效率

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