检测叶蝉媒介及其植物寄主中的病毒与唾液蛋白

本方案提供了一种检测叶蝉及其植物寄主中唾液蛋白的技术，以进一步研究这些蛋白在植物寄主中的功能。该技术操作简便，系统稳定且可重复。此方法也可用于其他半翅目昆虫及其植物寄主唾液蛋白的检测。

首先，将成年叶蝉饲养在40厘米×35厘米×20厘米的立方体笼中水稻幼苗上。笼子的一侧用防虫网覆盖以保持通风。将装有叶蝉的笼子置于带有内置湿度控制器的培养箱中，在26摄氏度、相对湿度60%至75%、光照周期为16小时光照和8小时黑暗的条件下培养。

每周一次，使用吸虫器将成虫从原饲养笼中轻柔转移至含有新鲜水稻幼苗的新饲养笼中。让超过200只成虫在水稻中交配并产卵。保留原有的水稻幼苗，供若虫孵化，并将新孵化的非传毒若虫饲养至二龄阶段。

使用吸虫器将二龄非传毒若虫小心转移到玻璃培养管中，饥饿处理一至两小时。随后将若虫释放到一个饲养笼中，笼内放置一株种植在花盆中且感染水稻矮缩病毒的水稻植株，让若虫在感染的水稻植株上取食两天。两天后，将这些若虫小心转移到另一个含有健康无病毒水稻幼苗的新饲养笼中，让若虫在无病毒水稻幼苗上取食12天，以完成水稻矮缩病毒的循回传播期。

为收集唾液蛋白，准备五个小型管状饲喂笼，一端覆盖防虫网。将15至20只叶蝉分别 confinement 于每个饲喂笼后，用一块薄泡沫垫封住笼子的另一端。用胶带将一株水稻幼苗固定在笼端与泡沫垫之间，确保饲喂笼内的叶蝉能够取食暴露在笼内空间的水稻幼苗。

将幼苗根部浸入水中，以保持水稻植株存活，并让叶蝉取食两天。两天后，从取食笼中移除叶蝉，并收集叶蝉取食过的水稻幼苗。在笼外剪下幼苗，并获取幼苗的取食区域。

通过将200毫升已配制的5x缓冲液与800毫升无菌水混合，配制1x Tris-甘氨酸缓冲液。然后配制10x TBS缓冲液，并在121摄氏度下高压灭菌15分钟。接着配制4x蛋白质样品缓冲液。

然后，通过将800毫升Tris-甘氨酸缓冲液与200毫升甲醇混合，配制转膜缓冲液。最后，将100毫升10x TBS和3毫升Tween 20加入900毫升无菌水中，配制TBST溶液。为检测唾液和病毒蛋白，取0.1克水稻样品与液氮研磨，直至组织成为粉末状。

然后向样品中加入 200 µL 的 4x 蛋白上样缓冲液，煮沸 10 分钟。离心样品后，将上清液转移至新的离心管中。取 10 µL 样品加入 SDS-PAGE 凝胶中，在 Tris-甘氨酸缓冲液中以 150 伏电压电泳 45 至 60 分钟。

在凝胶电泳进行的同时，将0.45微米硝酸纤维素膜及其他转膜夹心材料放入转移缓冲液中浸泡30分钟。电泳结束后，将凝胶与膜组装成夹心结构，在转移缓冲液中以100伏电压转膜90至120分钟。转膜完成后，将膜放入含7%脱脂奶粉的TBST封闭液中，孵育20分钟。

随后，加入针对水稻矮缩病毒P8或卵黄原蛋白的抗体，室温孵育膜2小时或4°C过夜。孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次间隔5分钟。然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作为二抗，室温孵育膜60至90分钟。

使用ECL Western试剂盒中的化学发光检测，将试剂盒中的混合检测试剂一和试剂二按1:1比例混合。将膜置于混合试剂中，孵育5分钟。去除多余试剂，对膜进行化学发光和比色成像。

将图片合并以观察蛋白条带。检测卵黄原蛋白的蛋白质印迹分析显示，在取食水稻植株和昆虫唾液腺中出现了大小约为220千道尔顿的特异性和预期条带。相比之下，在未取食的植株中未观察到条带，表明卵黄原蛋白作为唾液蛋白被释放到植物寄主中。

通过蛋白质印迹分析检测水稻矮缩病毒P8蛋白，在取食植株和带毒昆虫体内均观察到一条大小约为46千道尔顿的特异性预期条带。相比之下，在未取食植株和非带毒叶蝉体内未观察到条带，证明该病毒蛋白也可在取食植株中被检测到。在执行本实验方案时，应考虑叶蝉体内的病毒载量、检测时间点以及重复次数等因素。

该方法也可用于研究传播虫媒病毒的蚊子。