Name: 室温下的片上结晶和大规模连续衍射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学习片上结晶技术，利用晶体-晶体装置在室温下进行蛋白质结晶和X射线衍射数据采集。该方法无需接触晶体即可自动收集数千张衍射图像，有助于研究蛋白质的动态构象变化和功能机制。

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本研究使用了由阿贡国家实验室为美国能源部科学办公室用户设施运营的先进光子源，相关使用受合同 DE-AC02-06CH11357 支持。BioCARS 的使用得到了美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所通过资助号 R24GM111072 的支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。LS-CAT 第21区的使用得到了密歇根经济发展公司和密歇根技术三角区资助 085P1000817 的支持。本工作还获得了来自伊利诺伊大学芝加哥分校、美国国立卫生研究院（R01EY024363）和美国国家科学基金会（MCB 2017274）向 XY 提供的资助支持。

1. 设备预组装
<ol>
	<li>在外部环（直径 30 mm）上标记样品编号。如有需要，可包括项目名称、设备编号、结晶条件和日期（图 1A）。将外部环倒置放在洁净的表面上（图 1B），然后小心地将一片石英晶片放入环内（图 1C）。此第一片石英晶片作为入射X射线的入口窗口。</li>
	<li>取少量显微镜浸油（黏度为 150 cSt）倒入培养皿中。将垫片浸入油中，确保其两面均均匀涂覆浸油（图 1D）。通过将垫片轻触洁净表面以去除多余油分。</li>
	<li>将涂油的垫片放置在第一片石英晶片上方（图 1E）。 
	&#8203;注意：浸油是一种优良的密封剂，可防止结晶腔室发生潜在的溶剂挥发。正确组装的芯片通常可保持数周而不出现明显干燥。此预组装步骤在普通光照条件下进行。对于光敏感样品，所有后续步骤（包括样品加载、设备储存和观察）均须在安全光照条件下进行。</li>
</ol>
2. 样品加载与装置组装
<ol>
	<li>使用移液器在第一片石英晶片上充分混合蛋白质溶液和结晶缓冲液。蛋白质样品与缓冲液的体积比通常在 2:1 至 1:2 之间（图 1F）。确保结晶溶液的总体积不超过由垫片尺寸和厚度决定的结晶腔室的最大容量。混合过程中避免产生气泡。 
	注意：结晶缓冲液的组成因实验而异。结晶条件请参见 Table 1。</li>
	<li>当混合溶液开始铺展时，将第二片石英晶片覆盖在溶液上（图 1G）。该第二片石英晶片作为衍射 X 射线的&#160;出射窗口。</li>
	<li>轻轻敲击第二片石英晶片的边缘，以帮助油层铺展并排出空气。通过将固定环旋入外环来固定装置（图 1H）。必要时可使用紧固工具（图 1I）。注意过度拧紧可能导致脆弱的石英晶片变形甚至破裂。</li>
</ol>
3. 设备储存与结晶优化
<ol>
	<li>将组装好的装置（图1J）存放于室温下的盒子中，或置于具有温度控制的培养箱内。 
	注意：蛋白质晶体可能在组装结晶装置后的数小时至数天内出现。图2（图2）展示了数个代表性蛋白质样品在芯片上结晶的典型结果。</li>
	<li>通过显微镜观察结晶装置，监测晶体生长情况。如有必要，可通过重复第1-3节的操作迭代优化结晶条件。</li>
</ol>
4. 校准
注意：下文各节中提到的程序和命令均在 inSituX 软件中运行。
<ol>
	<li>将一块掺杂的钇铝石榴石薄晶体安装在芯片支架上（图3）。安装光束挡板。通过运行以下程序获取直射X射线的X射线荧光图像： 
	burnmark.py &#60;device&#62;.param 
	其中 &#60;device&#62; 是用户为结晶装置选定的名称。&#60;device&#62;.param 是一个包含装置特定控制参数的文件名。默认值将在本实验方案中逐步被具体值替代。一个示例 &#60;device&#62;.param 文件见于补充文件1。</li>
	<li>通过运行光束轮廓拟合程序，确定直射X射线束的精确位置： 
	beam.py &#60;burn image&#62; -d &#60;device&#62; 
	其中 &#60;burn image&#62; 是X射线荧光图像的文件名（图4）。 
	注：该程序可计算出精确的直射光束位置以及光束尺寸。光束位置将作为来自同一装置的所有晶体的平移目标位置。光束尺寸也用于靶区规划。</li>
</ol>
5. 光学扫描
<ol>
	<li>将结晶装置放入芯片架中，并使用拇指螺丝固定装置（图3A）。</li>
	<li>通过运动学机构将芯片架安装到衍射仪的平移台上（图3B）。</li>
	<li>为从装置的光学窗口拍摄显微图像，安装合适的光源。可根据蛋白质样品的光敏感性及实验目的，选择使用白光、红外光或其他光源。</li>
	<li>运行扫描程序： 
	scan.py &#60;device&#62;.param 
	该程序会采集一组显微图像，并自动传输至指定的用户计算机。</li>
	<li>在用户计算机上运行拼接程序： 
	tile.py &#60;device&#62; -x &#60;x&#62; -y &#60;y&#62; 
	其中 &#60;x&#62; 和 &#60;y&#62; 分别为显微图像列位移和行位移的初始值。该程序将所有显微图像拼接成一幅分辨率为1–3 μm/像素的全景图（图5）。 
	注意：步骤5.4和5.5通常需要几分钟。显微图像的总数根据扫描区域和放大倍数的不同，范围从几十到数百张不等。</li>
	<li>运行晶体识别程序： 
	findX.py &#60;montage&#62; -c &#60;length&#62; &#60;width&#62; -w &#60;wedge&#62; -x &#60;beam size&#62; 
	其中 &#60;montage&#62; 为拼接后的图像。该程序执行晶体识别与打靶规划。&#60;length&#62; 和 &#60;width&#62; 表示待识别晶体的尺寸。若用户希望排除较小的晶体，可将 &#60;width&#62; 设为截断值，即设定一个大于不希望检测的小晶体尺寸的数值。&#60;wedge&#62; 为角度值，用于设定不规则形状晶体的容差范围。&#60;beam size&#62; 指的是通过前述轮廓拟合获得的直射光束尺寸（步骤4.2；图4）。此外，用户也可设置一个标称值，以进一步增大目标打靶点之间的间距。这些关键参数可实现特定晶体的选择与靶点规划（图6）。</li>
</ol>
6. X射线衍射
<ol>
	<li>移除光源并安装光束挡板。设置合适的探测器距离。遵循光束线安全规程进入X射线屏蔽室。打开X射线快门，如有需要，同时打开激光快门。</li>
	<li>运行用于序列衍射数据采集的程序： 
	collect.py &#60;device&#62;.param -l &#60;light duration&#62; 
	该命令将启动数据采集，按照预设程序依次访问所有计划的照射点。每个目标晶体将被移至光束位置（步骤4.2）。在每个停留点，按预定的时间延迟进行X射线曝光，可选择是否同时进行激光激发。视频1展示了以1 Hz频率运行的自动化数据采集序列。通常情况下，单个结晶化装置可采集数十至数百张衍射图像（视频2）。 
	注意：第4节的校准和第5节的光学扫描在inSituX平台中是独立完整的模块，因此可完全迁移至其他光束线。第6节X射线衍射部分则需结合具体光束线的操作细节。</li>
</ol>

<ol><li>Brändén, G., Neutze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+time-resolved+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography.</a> Science. 373, (2021).</li>
<li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+room+temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).</li>
<li>Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+X-rays%3A+an+overview+of+emerging+structural+biology+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).</li>
<li>Nogales, E., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).</li>
<li>Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+before+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Diffraction before destruction.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 369, 20130313(2014).</li>
<li>Kisselman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-CHIP%3A+an+integrated+platform+for+high-throughput+protein+crystallization+and+on-the-chip+X-ray+diffraction+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combined+crystallization+plate+for+high-throughput+crystal+screening+and+in+situ+data+collection+at+a+crystallography+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).</li>
<li>le Maire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-plate+protein+crystallization%2C+in+situ+ligand+soaking+and+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).</li>
<li>Perry, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+serial+Laue+diffraction+on+a+microfluidic+crystallization+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In situ serial Laue diffraction on a microfluidic crystallization device.</a> Journal of Applied Crystallography. 47, 1975-1982 (2014).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal-on-crystal+chips+for+in+situ+serial+diffraction+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature.</a> Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).</li>
<li>Ren, Z. Single crystal quartz chips for protein crystallization and X-ray diffraction data collection and related methods. US patent. , 9632042 (2017).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+platform+for+in+situ+serial+crystallography+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">An automated platform for in situ serial crystallography at room temperature.</a> IUCrJ. 7, 1009-1018 (2020).</li>
<li>Croes, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+solving+traveling+salesman+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Operations+Research%22%5BJournal%5D)">A method for solving traveling salesman problems.</a> Operations Research. 6, 791-812 (1958).</li>
<li>Bandara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+far-red-sensing+cyanobacteriochrome+reveals+an+atypical+bilin+conformation+and+spectral+tuning+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118(2021).</li>
<li>Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+molecular+logic+OR+in+a+dual-sensor+histidine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).</li>
<li>Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-scan+cryocrystallography+reveals+reaction+intermediates+in+bacteriophytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome.</a> Nature. 479, 428-432 (2011).</li>
<li>Zhang, F., Scheerer, P., Oberpichler, I., Lamparter, T., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+prokaryotic+%286-4%29+photolyase+with+an+Fe-S+cluster+and+a+6%2C7-dimethyl-8-ribityllumazine+antenna+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a prokaryotic (6-4) photolyase with an Fe-S cluster and a 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine antenna chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 7217-7222 (2013).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+crystallography+reveals+early+signaling+events+in+ultraviolet+photoreceptor+UVR8%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8.</a> Nature Plants. 1, 14006(2015).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+base+selectivity+from+the+1.8+%C3%85+resolution+structure+of+an+RB69+DNA+polymerase+ternary+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex.</a> Biochemistry. 50, 581-590 (2011).</li>
<li>Rodgrs, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Cryocrystallography.</a> Structure. 2, 1135-1140 (1994).</li>
<li>Zhao, F. -Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+sample+delivery+systems+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22TheFEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to sample delivery systems for serial crystallography.</a> TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).</li>
</ol>

ZR 是美国专利 9632042 中所述晶体-晶体芯片的发明人，该专利授予 Renz Research, Inc.。

在早期，室温下的蛋白质晶体学研究因难以克服X射线辐射损伤而面临巨大困难。因此，随着同步辐射X射线源的广泛应用，更为稳定的低温晶体学方法逐渐取代了室温方法20。近年来，随着X射线自由电子激光技术的出现，室温蛋白质晶体学重新受到关注，许多新进展均源于在生理相关温度下观测蛋白质结构动态变化的需求2,21。基于“晶体对晶体”装置开发的inSituX平台正是出于同样的目标，即建立常规且稳健的室温动态晶体学研究数据收集方法。这种自动化的序列X射线衍射方法同样适用于那些难以冷冻的蛋白质晶体的静态结构测定14。在本实验方案中，我们介绍了使用该平台进行室温数据收集所需的关键技术考量及关键操作步骤。该方法特别适用于对机械操作、X射线辐射损伤或空气暴露敏感的脆弱蛋白质晶体。
该平台原型已在美国阿贡国家实验室先进光子源（APS）的两条蛋白质晶体学光束线上进行了广泛测试。尽管按照本方案建立芯片上结...

由于X射线辐射具有电离效应，在过去三十年中，蛋白质晶体学在很大程度上局限于低温条件下的研究。因此，目前对蛋白质在发挥功能过程中分子运动的认识，主要来源于在低温条件下观测到的不同状态的静态结构之间的比较。然而，低温不可避免地会阻碍生化反应的进行或不同构象状态之间的相互转换，而这些过程正是蛋白质分子发挥功能时所必需的。为了通过晶体学手段在原子分辨率上直接观察蛋白质的结构动态变化，亟需建立稳定且常规的室温衍射实验方法，这要求在样品输送、数据采集以及后续数据分析等方面实现技术革新。为此，近年来发展的序列晶体学（serial crystallography）为在室温下捕捉中间态及短寿命结构物种的分子图像提供了新的途径。1,2,3与……相比，截然不同 &#34;单晶单数据集&#34; 串行晶体学采用了一种与单颗粒冷冻电镜类似的数据收集策略，该策略在传统冷冻晶体学中被广泛应用。具体而言，串行晶体学的实验数据来自大量独立样品的微小数据片段，随后通过密集的数据处理，对这些数据片段进行评估并整合为完整的数据集，用于三维结构的解析。4。这一点 &#34;一次一晶体&#34; 通过“衍射先于破坏”策略，有效缓解室温下X射线辐射对蛋白质晶体的损伤5.
由于序列晶体学需要大量蛋白质晶体才能完成一个数据集，因此对于蛋白质样品有限和/或涉及精细晶体操作的许多生物系统而言，这构成了重大的技术挑战。另一个重要考虑因素是在序列衍射实验中如何最佳地保持晶体完整性。 原位 衍射方法通过让蛋白质晶体在其生长位置直接发生衍射，且不破坏结晶腔室的密封性，从而解决了上述问题6,7,8,9这些无需手动操作的方法天然适用于大规模序列衍射。我们近期报道了一种用于结晶的装置的设计与实现 原位 基于晶体-晶体概念的衍射——蛋白质晶体直接生长在单晶石英上11。这一点 &#34;晶对晶&#34; 该装置具有多项优势。首先，其采用单晶石英基底制成X射线和可见光透明窗口，背景散射极低，因而可获得蛋白质晶体衍射图像的优异信噪比。其次，单晶石英具有与玻璃相当的优异阻隔水汽性能，可为蛋白质结晶提供稳定的环境。相比之下，采用聚合物基底的其他结晶装置由于聚合物材料具有透汽性，容易发生干燥，除非使用较厚的聚合物材料，但后者会显著增加背景散射10第三，该装置能够在无需任何晶体操作或挑取的情况下，将大量蛋白质晶体递送至X射线束中，这对于保持晶体完整性至关重要。11.
为简化使用晶体-晶体装置的连续X射线衍射实验，我们开发了一种衍射仪原型，可方便地在光学扫描和X射线衍射模式之间切换12该衍射仪体积小巧，已在中国台湾阿贡国家实验室先进光子源（APS）的两条光束线站上用于序列数据采集。具体而言，我们使用BioCARS 14-ID-B进行劳厄衍射，使用LS-CAT 21-ID-D进行单色振荡衍射。如果同步辐射或X射线自由电子激光光束线具备以下两项关键功能，则无需使用该衍射仪硬件：（1）配备电动样品定位系统，可在所有方向上围绕X射线束在±12 mm范围内移动；（2）配备轴上数字相机，可在对所研究的蛋白质晶体安全的光照条件下观察晶体。单晶石英装置连同便携式衍射仪，以及用于光学扫描、晶体识别和自动化的控制软件 原位 数据采集共同构成了用于序列晶体学的inSituX平台。尽管该技术的开发主要受其使用多色X射线源进行动态晶体学应用的推动，但我们已展示了该技术在支持单色振荡方法方面的潜力10,12通过自动化，该平台可在室温下以较低的蛋白质消耗实现高通量的连续数据采集。
本文详细介绍了如何在湿实验室内建立芯片上结晶系统，以及如何利用inSituX平台在同步辐射光束线上进行连续X射线数据采集。
批量法可用于在与相同蛋白质样品的悬滴气相扩散法相似的条件下，在芯片上进行结晶（表1）。作为起始条件，我们建议使用沉淀剂的浓度为气相扩散法所用浓度的1.2–1.5倍。如有必要，可通过精细网格筛选进一步优化批量结晶条件。优化实验无需使用石英晶片，可改用玻璃盖玻片（见下文）。建议使用部分加载的结晶装置，以缩小优化实验的规模。已有多种蛋白质样品利用该装置通过批量法成功实现结晶10（表1）。
该装置本身由以下部分组成：1）一个外环；2）两片石英晶片；3）一个垫圈状的塑料或不锈钢垫片；4）一个固定环；5）显微镜浸油作为密封剂（图1）。加载到一个芯片上的结晶溶液体积总量取决于实验目的。通过选择不同厚度和/或内径的垫片，可调节结晶室的容量。我们通常使用厚度为50–100 μm的垫片，组装成容量为10–20 µL的结晶装置。一种典型的装置可产生数十至数千颗适合进行序列数据收集的蛋白质晶体（图2）。
若操作成功，芯片上的结晶过程将在每个石英装置上生成数十至数百甚至数千个可用于X射线衍射的蛋白质晶体。在同步辐射光束线上，该装置通过运动学机制安装在衍射仪的三轴平移台上。对已安装装置的结晶窗口进行光学扫描，获得数十至数百张显微图像。这些显微图像随后被拼接成一幅高分辨率的全景图像。对于光敏性晶体，可在红外光（IR）下进行光学扫描，以避免意外的光激活。我们已开发出一种计算机视觉软件，用于识别并定位随机分布在装置上的蛋白质晶体。这些晶体将根据其尺寸、形状和位置进行排序，以指导或优化串行晶体学中的数据采集策略。例如，可在每个目标晶体上设定单次或多次照射。用户可规划对目标晶体的一次性扫描或多次路径采集。我们已实现多种行进路径的计算软件。例如，采用解决旅行商问题的算法来计算最短路径13。对于泵浦-探测动态晶体学应用，可选择激光（泵浦）与X射线（探测）脉冲的时序和持续时间。自动化的串行数据采集程序可依次将每个目标晶体移入X射线束中。
原位X射线衍射仪的关键组件包括：1）样品装置支架；2）三轴平移台；3）用于光学扫描的光源；4）X射线光束挡板；5）若研究光敏蛋白，则配备泵浦激光器；6）配备对红外敏感相机的树莓派微型计算机；7）控制软件，用于同步电机、相机、光源、泵浦激光器，并与光束线控制系统进行交互。

<table><tbody><tr><td>分析软件</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铈掺杂钇铝石榴石</td><td>MSE Supplies</td><td></td><td>Ce:Y3Al5O12，YAG单晶衬底</td></tr><tr><td>芯片夹具</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>控制软件</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>浸油</td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>A型低粘度 150 cSt</td></tr><tr><td>inSituX平台</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>红外光源</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>带玻璃透镜的LED，1085 nm，5 mW，TO-18</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>外环</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>泵浦激光器</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm，400 mW，&amp;Oslash;9 mm，E针编码，激光二极管</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Foundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>固定环</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>用于&amp;Oslash;1&quot;透镜管和安装座的SM1固定环</td></tr><tr><td>无籽石英晶体</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>直径25.4 mm，Z切，厚度0.05 mm，双面抛光，-X轴方向偏移8 mm</td></tr><tr><td>垫片</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X射线光束挡板</td><td>自主开发</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

片上结晶与室温大规模连续衍射

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

通过展示蛋白质在不同功能状态之间的转变，可以更好地理解生化反应和生物过程。由于低温条件不符合生理状态，可能会阻碍、抑制甚至改变蛋白质的结构动态，因此迫切需要一种能够在室温下进行常规X射线衍射实验的可靠方法。本实验方案中使用的晶体-晶体装置及其配套硬件和软件旨在实现无需任何样品操作即可对不同尺寸的蛋白质晶体进行原位（in situ）室温X射线衍射。本文介绍了从装置组装、芯片上结晶、光学扫描、晶体识别到X射线曝光规划及自动化数据采集等关键步骤的实验流程。由于该平台无需晶体 harvesting 或其他任何形式的样品操作，因此可在程序化和高通量模式下将芯片上生长的数百至数千个蛋白质晶体依次引入X射线束中。

过去几年中，已发表多个代表性数据集10,12 以及来自多种蛋白质样品（包括光感受器蛋白和酶）的晶体学结果和科学发现，例如植物紫外光-B光感受器UVR8、光驱动DNA修复光解酶PhrB10一种来自多结构域感受组氨酸激酶的新型远红光感应蛋白14配体/光双重感应结构域，以及细菌光敏色素的光感应核心模块12作为代表性结果，我们列出了这些蛋白质在芯片上的结晶条件 表1， 并与用于蒸汽扩散法的条件直接比较。此处我们展示了芯片上结晶的另外四个案例研究（图2) 和一系列 原位 电影中的衍射图样（视频 2。代表性 原位 使用本方案收集的数据集汇总于 表 2.
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本文介绍了如何在晶上晶装置上设置蛋白质结晶，以及如何利用芯片结晶平台在室温下进行自动化的序列数据收集。

生化反应和生物过程可以通过展示蛋白质在其功能状态之间的转变来获得最佳理解。由于……

本方案展示了在类似芯片的装置上进行蛋白质结晶并收集X射线衍射数据的方法。该装置被称为“晶体上生长晶体”，因为蛋白质晶体生长在单个石英晶体上。当蛋白质晶体在该装置上成功生长后，可在室温下从每个装置上收集数千张衍射图像，且无需触碰蛋白质晶体。室温下的X射线衍射对于研究涉及多种构象状态的蛋白质功能至关重要。这些具有信息性的蛋白质变化或蛋白质行为在低温晶体学中会被冻结，因而无法检测。该技术可用于研究光诱导的信号传导过程和氧化还原变化。仅有少数设备能够提供完整且冗余的数据集。开始设备预组装时，需在外环上标注样品标识，包括项目名称、设备编号、结晶条件以及所需日期。然后将标记好的环形圈倒置放在干净的表面上，并将一片石英晶片放入外圈内。接着，取少量显微镜浸油倒入培养皿中，将垫片浸入油中，确保垫片两面均被充分涂覆。用垫片轻触干净表面，去除多余的油。然后将涂有油的垫片放在第一片石英晶圆上。使用移液器在第一片石英晶圆上混合蛋白质溶液和结晶缓冲液。混合时尽量避免产生气泡。结晶溶液的总体积不得超过由垫片尺寸和厚度决定的结晶室最大容量。将第二片石英晶片盖在混合溶液上，溶液会自发铺展开来。然后轻轻敲击第二片石英晶片的边缘，以帮助油均匀铺展并排出空气。将固定环旋入外环，以固定装置。如有必要，可使用紧固工具。避免过度拧紧，以免导致精密的石英晶片变形或破裂。将组装好的装置存放在室温下的盒子中，或置于温度可控的培养箱内。数小时或数天后，将结晶装置置于显微镜下，观察晶体生长情况。 如有必要，按照论文中所述优化结晶条件。进行校准时，将一块薄的YAG晶体安装在芯片支架上，然后安装光束挡板。接着，打开Insitux软件，运行指定程序以采集直射光束的X射线荧光图像，其中device为用户自定义的结晶装置名称。param 是包含设备特定控制参数的文件名。然后通过运行光束轮廓拟合程序来确定直接X射线束的精确位置，其中 burn image 是X射线荧光图像的文件名。对于光学扫描，将结晶装置放入芯片架中，并使用拇指螺丝固定。然后通过运动学装置将芯片架安装到衍射仪的平移台上。根据蛋白质样品的光敏感性及实验目的，在装置的光学窗口处安装白色或红外光源以采集显微图像。设置完成后，输入光束线上指定的扫描运动命令，运行扫描程序。然后在用户计算机上运行平铺程序，其中 x 为列的初始值，y 为显微照片异常位移的初始值。该程序将所有显微照片拼接成分辨率为一至三微米像素的全景图像。拼接完成后，输入指定命令以运行晶体识别程序。该程序执行晶体识别和打靶规划，程序中的关键参数可实现特定晶体的选择和目标规划。移除光源并放置光束挡板，然后运行数据采集程序以进行序列衍射实验。建议的指令会按照预设的顺序访问规划的拍摄点，从而触发数据采集。每个目标晶体将被移至光束位置。在每个停留点，将按照预定的时间延迟进行X射线曝光，曝光时可选择是否同时进行激光照射。本研究比较了蒸气扩散法与芯片上批量法的结晶条件。本文展示了芯片上结晶的四个案例研究，以及直接从石英装置获取的代表性数据集。动态晶体学实验通过比较暗处条件下4,352个晶体和光照后8,287个晶体的数据，揭示了远红光光感受蛋白在光照诱导下的结构变化。原位连续劳厄衍射获得的暗态数据集得到了分辨率更高的电子密度图，从而能够可靠地构建出处于全Z构型的胆绿素发色团模型。光诱导差值图揭示了中心β折叠片中协同运动的存在，表明发色团的吡咯环与多个芳香族残基之间的π-π堆积具有重要作用。该平台被称为Insitux。该平台的独特优势在于，一旦完成结晶，便无需进行任何晶体操作。为了捕捉蛋白质的运动过程，必须在不同条件下收集大量数据集。而Insitux使得这一目标成为可能，因为它能够在室温下从数千个蛋白质晶体中实现大规模数据采集。通过这种包含晶体学的新功能，可以在装置内触发对光敏感的系统；如果将晶面-晶面装置转化为流出装置，则可以研究对光惰性的系统。

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室温下的片上结晶和大规模连续衍射

本方案详细描述了在室温下用于X射线衍射数据收集的微流控器件的制备与操作方法。此外，还介绍了如何通过动态光散射监测蛋白质结晶过程，以及如何处理和分析所获得的衍射数据。...

微流控芯片用于 原位 晶体X射线衍射与 原位 用于序列晶体学的动态光散射

本文详细介绍了用于芯片上透析法蛋白质结晶的微流控芯片的制备方案 原位...

通过微透析芯片法进行蛋白质结晶 原位 X射线衍射研究

本文描述了一种多功能微流控装置，该装置能够利用逆扩散法实现酶的结晶，通过浸泡法将底物引入晶体，并在室温下对芯片内的晶体进行连续分析，从而测定酶与底物复合物的三维结构。...

通过多功能微流控芯片中的序列晶体学对酶-底物复合物进行结晶及结构测定

我们介绍一种利用哈韦尔研究复合体（Research Complex at Harwell）中的结晶设施进行蛋白质结晶的实验方案，以及后续的 原位 在钻石光源同步辐射装置的多功能大分子晶体学线站对晶体板中的晶体进行X射线晶体学数据收集 原位 (VMXi)...

结晶与 原位 使用哈威尔结晶设施和钻石光源 VMXi 光束线在室温下收集数据

我们描述了用于在X射线自由电子激光器和同步辐射光源上进行序列晶体学实验的脂质立方相中膜蛋白微晶的制备与递送方法。这些方案也可应用于可溶性蛋白微晶的包埋与递送，与液体注射相比，可显著减少样品消耗。...

用于序列飞秒晶体学的脂质立方相中蛋白质微晶的制备与递送

本文描述并讨论了用于常规制备大量筛选板及纳升级结晶液滴以进行蒸汽扩散实验的自动化系统与方案。...

MRC分子生物学实验室大分子结晶的自动化方案

介绍了一种利用蛋白质微晶进行X射线晶体学的实验方案。两个分析实例 体内纯化后生长的微晶 在细胞内...

蛋白质晶体的微晶衍射分析 活细胞内 衍射

本方案描述了一种在固体培养基上大规模培养秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

基于平板的大规模培养 秀丽隐杆线虫糖尿病代谢改变研究的样本制备

电子顺磁共振（EPR）波谱法是检测自由基的明确方法。利用特异性自旋探针，可实现对细胞不同区室中自由基的检测。本文介绍一种实用且高效的生物样本采集方法，便于样本的处理、保存和转移，以进行EPR测量。...

在室温和77 K条件下对生物样品进行电子顺磁共振研究的应用

本文介绍一种通过在大肠杆菌（Escherichia...

基于类病毒系统的Escherichia coli中环形支架上大规模生产重组RNA

学习片上结晶技术，利用晶体-晶体装置在室温下进行蛋白质结晶和X射线衍射数据采集。该方法无需接触晶体即可自动收集数千张衍射图像，有助于研究蛋白质的动态构象变化和功能机制。

片上结晶与室温大规模连续衍射

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