Name: 通过显微注射在类 圆线虫 物种中产生转基因和敲除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学习通过性腺内显微注射技术将转基因和CRISPR组分导入类圆线虫Strongyloides stercoralis和S. ratti的方法，用于生成基因敲除和转基因品系，研究寄生虫发育与宿主互作机制。

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pPV540 和 pPV402 是由宾夕法尼亚大学的 James Lok 博士慷慨赠送的。我们感谢 Astra Bryant 对手稿提出的有益意见。本研究由布罗德-韦尔奇基金会传染病发病机制研究者奖、霍华德·休斯医学研究所教员学者奖以及美国国立卫生研究院 R01 DC017959 项目（E.A.H.）资助。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本显微注射方案详细介绍了将转基因构建体以及CRISPR/Cas9介导的诱变构建体导入粪类圆线虫（S.&#160;stercoralis）和鼠类圆线虫（S.&#160;ratti）的方法。对于粪类圆线虫（S.&#160;stercoralis）和鼠类圆线虫（S.&#160;ratti）而言，注射后的存活率以及转基因或诱变效率均受多种可优化调节的因素影响。
成功进行转基因的首要关键因素是质粒转基因的构建方式。先前的研究发现，外源转基因在 粪类圆线虫 需要使用 粪类圆线虫 5' 启动子和 3' 非翻译区元件3,13,19. 与……类似 秀丽隐杆线虫 构建体， 粪类圆线虫 构建体通常使用基因特异性启动子和一个常见的3'非翻译区（UTR），例如来自 Ss-e...

Strongyloides stercoralis 与更广为人知的钩虫和蛔虫 Ascaris lumbricoides 相比，长期以来一直被忽视，未被视为重要的人类病原体1。 以往对蠕虫负荷的研究常常严重低估了 S. stercoralis 的流行率，原因是常用诊断方法对 S. stercoralis 的敏感性较低2。近年来，基于改进诊断工具的流行病学研究估计，S. stercoralis 感染的真实流行率远高于以往报道，全球约有 6.1 亿人感染2。
S. stercoralis 和其他 Strongyloides 物种（包括亲缘关系相近的大鼠寄生虫及常用的实验室模式生物 S. ratti）具有独特的生命周期，这一特性有利于开展实验性基因组学研究，因其生命周期中包含寄生世代和自由生活（环境）世代3（图1）。具体而言，S. stercoralis 和 S. ratti 均可经历一个单代的自由生活阶段。该自由生活世代由宿主排出后的寄生后幼虫发育而成，最终形成自由生活的成年雄虫和雌虫；所有自由生活成虫的子代均发育为感染性幼虫，必须侵入宿主才能延续其生命周期。此外，这一环境或自由生活世代可在实验室中进行实验操作。由于自由生活的 Strongyloides 成虫与 C. elegans 成虫形态相似，因此原本为 C. elegans 开发的技术（如性腺内显微注射）可被改造后用于自由生活的 Strongyloides 成虫4,5。尽管通常将DNA导入自由生活的成年雌虫体内，但 Strongyloides 的雄虫和雌虫均可进行显微注射6。因此，已有多种功能基因组学工具可用于研究 Strongyloides 生物学的多个方面。其他寄生性线虫缺乏自由生活世代，因而难以应用此类功能基因组学技术3。
<img alt="粪类圆线虫生活史示意图；寄生阶段，自由生活阶段；自体感染，转基因筛选" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63023/63023fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：该 粪类圆线虫 生命周期 的 S. stercoralis 寄生雌虫栖息于其哺乳动物宿主（人类、非人灵长类、犬类）的小肠内。寄生雌虫通过孤雌生殖在小肠内产卵。卵在宿主体内孵化，形成后寄生期幼虫，随后随粪便排入环境。若后寄生期幼虫为雄性，则发育为自由生活的成年雄虫；若为雌性，则可发育为自由生活的成年雌虫（间接发育），或发育为第三期感染性幼虫（iL3s；直接发育）。自由生活的雄虫与雌虫通过有性繁殖产生后代，这些后代只能发育为iL3s。在特定条件下， S. stercoralis 也可发生自体感染，即部分寄生后幼虫不随粪便排出体外，而是滞留在宿主肠道内。这些幼虫可在宿主体内发育为自体感染性幼虫（L3a），穿透肠壁，经体内迁移后最终返回肠道，发育为具有生殖能力的成虫。其生活史为 S. rattii 相似，但以下情况除外： S. rattii 感染大鼠，且不具有自体感染周期。环境世代对于其应用至关重要。 粪类圆线虫 用于遗传学研究的物种。自由生活的成年雌性（P0）可通过显微注射；其子代均将发育为iL3阶段幼虫，是潜在的F代1 转基因。该图已根据 Castelletto 修改 等3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63023/63023fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
S. stercoralis 在生物学特性上与其他人源性肠道寄生线虫有许多相似之处，包括宿主侵入机制和宿主免疫调节。例如，属于 Necator 和 Ancylostoma 属的人源性钩虫也通过皮肤穿透感染，体内迁移路径相似，最终以寄生成虫形式定植于小肠7。因此，多种肠道线虫可能采用共通的感觉行为和免疫逃逸策略。由此，从 Strongyloides 研究中获得的知识将补充其他遗传操作较困难的线虫的研究成果，从而促进对这些复杂且重要寄生虫的全面理解。
本显微注射方案概述了将DNA导入自由生活期雌性Strongyloides线虫以获得转基因和突变后代的方法。文中描述了菌株维持的相关要求，包括用于显微注射的成虫线虫的发育时间点以及转基因后代的收集方法。方案还包括完整的显微注射技术操作步骤及其演示，以及转基因后代的培养与筛选方案，并列出了所有必需的仪器设备和耗材清单。

<table><tbody><tr><td>(&amp;minus;)-尼古丁，&amp;ge;99%（GC），液体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876-5ML</td><td>用于麻痹线虫的尼古丁</td></tr><tr><td>3&quot; 铁制C型夹，3&quot; x 2&quot;（容量 x 深度）</td><td>VWR</td><td>470121-790</td><td>用于将装置固定在实验台面上的C型夹</td></tr><tr><td>低电渗琼脂糖（Agarose LE）</td><td>Phenix</td><td>RBA-500</td><td>用于载玻片的琼脂糖</td></tr><tr><td>骨炭，4磅桶装，10 x 28目</td><td>Ebonex</td><td>n/a</td><td>用于粪便-炭培养的活性炭</td></tr><tr><td>骨炭，颗粒状，10 x 28目</td><td>Reade</td><td>bonechar10x28</td><td>用于粪便培养的活性炭（上述产品的替代品）</td></tr><tr><td>粗调微操作器</td><td>Narishige</td><td>MMN-1</td><td>粗调微操作器</td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X 离心管滤器</td><td>Fisher</td><td>07-200-385</td><td>微型滤柱</td></tr><tr><td>盖玻片，48 x 60 mm，1号厚度</td><td>Brain Research Lab</td><td>4860-1</td><td>盖玻片（48 x 60 mm）</td></tr><tr><td>深型培养皿，加厚型，带6个通气孔，直径100 mm</td><td>VWR</td><td>82050-918</td><td>10 cm 培养皿（用于粪便-炭培养）</td></tr><tr><td>Eisco 带杆铁架台底座</td><td>Fisher</td><td>12-000-101</td><td>Baermann 装置用支架</td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet 显微注射器微加载吸头</td><td>VWR</td><td>89009-310</td><td>用于填充显微注射针头</td></tr><tr><td>Fisherbrand 吸水垫巾</td><td>Fisher</td><td>14-206-62</td><td>实验台纸（用于样品制备）</td></tr><tr><td>Fisherbrand 铸铁环</td><td>Fisher</td><td>14-050CQ</td><td>Baermann 装置用O型环</td></tr><tr><td>Fisherbrand 三角形聚丙烯烧杯</td><td>Fisher</td><td>14-955-111F</td><td>塑料烧杯（用于混合）</td></tr><tr><td>Fisherbrand 三角形聚丙烯烧杯</td><td>Fisher</td><td>14-955-111F</td><td>塑料烧杯（用于接液桶/水桶）</td></tr><tr><td>Fisherbrand 三角形聚丙烯烧杯</td><td>Fisher</td><td>14-955-111F</td><td>塑料烧杯（x2）（用于制作支架）</td></tr><tr><td>注射器装Gorilla环氧树脂</td><td>McMaster-Carr</td><td>7541A51</td><td>胶水（用于连接管路）</td></tr><tr><td>卤代烃油700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td>卤代烃油</td></tr><tr><td>食品饮料级耐高温硅橡胶管，内径1/2&quot;，外径5/8&quot;</td><td>McMaster-Carr</td><td>3038K24</td><td>管路（用于漏斗）</td></tr><tr><td>KIMAX 长颈漏斗，60&amp;deg; 角，Kimble Chase</td><td>VWR</td><td>89001-414</td><td>Baermann 漏斗</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science 实验台保护垫</td><td>Fisher</td><td>15-235-101</td><td>实验台纸（用于样品制备）</td></tr><tr><td>带荧光功能的Leica体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>用于鉴定和分选转基因线虫的GFP体视显微镜</td></tr><tr><td>microINJECTOR 黄铜直臂针夹</td><td>Tritech</td><td>MINJ-4</td><td>显微注射针夹</td></tr><tr><td>microINJECTOR 系统</td><td>Tritech</td><td>MINJ-1</td><td>显微注射系统</td></tr><tr><td>蒙古沙鼠</td><td>Charles River Laboratories</td><td>213-Mongolian Gerbil</td><td>用于维持粪类圆线虫（S. stercoralis）的沙鼠，雄性，4–6周龄</td></tr><tr><td>Nasco Whirl-Pak 易封袋，18盎司</td><td>VWR</td><td>11216-776</td><td>Whirl-Pak 样品袋</td></tr><tr><td>尼龙网纱（网状）</td><td>Jo-Ann Fabrics</td><td>zprd_14061949a</td><td>Baermann 支架用尼龙网</td></tr><tr><td>铂丝，36号规格，每英寸</td><td>Thomas Scientific</td><td>1233S72</td><td>用于制作线虫挑取针的铂/铱合金丝</td></tr><tr><td>Puritan 压舌板，152 mm（长）x 17.5 mm（宽）</td><td>VWR</td><td>62505-007</td><td>木棒（用于混合样品）</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（250次）</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>QIAGEN 质粒小提试剂盒</td></tr><tr><td>大鼠-Long Evans品系</td><td>Envigo</td><td>140 HsdBlu:LE Long Evans</td><td>用于维持类圆线虫（S. ratti）的大鼠，雌性，4–6周龄</td></tr><tr><td>大鼠-Sprague Dawley品系</td><td>Envigo</td><td>002 Hsd:Sprague Dawley SD</td><td>用于维持类圆线虫（S. ratti）的大鼠，雌性，4–6周龄</td></tr><tr><td>Really Useful Boxes 半透明带盖储物盒，容量1.6 L，尺寸7-5/8&quot; x 5-5/16&quot; x 4-5/16&quot;</td><td>Office Depot</td><td>452369</td><td>用于加湿培养室的塑料盒</td></tr><tr><td>Shepherd 技术板，8 x 16.5英寸</td><td>Newco</td><td>999589</td><td>技术板</td></tr><tr><td>不锈钢抬高式金属网底板</td><td>Ancare</td><td>R20SSRWF</td><td>金属网笼底</td></tr><tr><td>StalkMarket 可降解餐具勺，6&quot;，白色，每包1000个</td><td>Office Depot</td><td>9587303</td><td>勺子</td></tr><tr><td>Stender 培养皿，叠放式，37 x 25 mm</td><td>Carolina (Science)</td><td>741012</td><td>表面皿（小型，圆形）</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Motic</td><td>K-400 LED</td><td>解剖制备用体视显微镜</td></tr><tr><td>储物箱，透明/白色，外部高度4-7/8英寸，外部长度13-5/8英寸，Sterilite品牌</td><td>Grainger</td><td>53GN16</td><td>用于加湿培养室的塑料盒</td></tr><tr><td>Sutter P-30 微量移液管拉制仪</td><td>Sutter</td><td>P-30/P</td><td>带铂/铱丝加热丝的针头拉制仪</td></tr><tr><td>Syracuse 表面皿</td><td>Fisher</td><td>S34826</td><td>表面皿（大型，圆形）</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Castaloy 固定角度夹具</td><td>Fisher</td><td>05-769-2Q</td><td>漏斗夹具（2个）</td></tr><tr><td>三轴悬挂式操纵杆油压微操作器</td><td>Narishige</td><td>MM0-4</td><td>精细微操作器</td></tr><tr><td>United Mohr 压夹钳</td><td>Fisher</td><td>S99422</td><td>压夹钳（2个）</td></tr><tr><td>带通气孔的锐边培养皿（直径60 mm）</td><td>Tritech Research</td><td>T3308P</td><td>6 cm 培养皿（用于小规模粪便-炭培养）</td></tr><tr><td>VWR 轻型擦拭纸</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td>Baermann 支架内衬</td></tr><tr><td>表面皿，方形，1-5/8英寸</td><td>Carolina (Science)</td><td>742300</td><td>表面皿（小型，方形）</td></tr><tr><td>Whatman 定性滤纸圆片，1号等级，直径5.5 cm</td><td>Fisher</td><td>09-805B</td><td>滤纸（用于6 cm 培养皿）</td></tr><tr><td>Whatman 定性滤纸圆片，1号等级，直径9 cm</td><td>Fisher</td><td>09-805D</td><td>滤纸（用于10 cm 培养皿）</td></tr><tr><td>World Precision Instrument 硼硅酸盐玻璃毛细管，1.2 mm x 4英寸</td><td>Fisher</td><td>50-821-813</td><td>用于显微注射针头的玻璃毛细管</td></tr><tr><td>X-Acto 刀具，1号刀柄配11号刀片</td><td>Office Depot</td><td>238816</td><td>无刀片的X-Acto刀具，用于固定线虫挑针</td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver A1</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>倒置显微镜</td></tr></tbody></table>

通过显微注射法在 strongyloides 属物种中生成转基因株和基因敲除株

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

钩口线虫属（Strongyloides）包含多种可穿透皮肤的线虫，其宿主范围各异，其中包括粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）和鼠类圆线虫（Strongyloides ratti）。S.&#160;stercoralis 是一种感染人类的寄生性皮肤穿透线虫，全球约有6.1亿人受其感染；而鼠类寄生虫 S.&#160;ratti 与 S.&#160;stercoralis 亲缘关系密切，常被用作研究 S.&#160;stercoralis 的实验室模型。通过性腺内显微注射外源核酸的技术，S.&#160;stercoralis 和 S.&#160;ratti 均易于实现转基因和基因敲除，因此已成为其他尚无法应用该技术的寄生性蠕虫的研究模型体系。
寄生性Strongyloides成虫栖居于宿主的小肠内，并通过粪便将子代释放到环境中。进入环境后，幼虫发育为自由生活的成虫，这些成虫生活在粪便中，并产生必须寻找并侵入新宿主的子代。这种环境世代为Strongyloides物种所特有，其形态与模式自由生活线虫Caenorhabditis elegans高度相似，因此针对C. elegans开发的技术可被改造后用于这些寄生性线虫，包括性腺内显微注射技术。通过性腺内显微注射，可将多种外源转基因导入Strongyloides。此外，也可通过显微注射CRISPR/Cas9组分来创制突变型Strongyloides幼虫。本文详细描述了对Strongyloides进行性腺内显微注射的技术，包括自由生活成虫的准备、注射操作步骤以及转基因子代的筛选方法。文中还展示了利用CRISPR/Cas9诱变技术获得的转基因Strongyloides幼虫图像。本论文的目的是帮助其他研究人员利用显微注射技术创制转基因和突变型Strongyloides。

如果实验成功，F1 幼虫将表达目标转基因和/或突变表型（图4）。然而，转化率具有高度变异性，取决于所用构建体、线虫的健康状况、注射后的培养条件以及实验人员的技术水平。通常情况下，一次成功的实验将获得 &gt;15 F1 每只注射雌虫的幼虫数及转化率 &gt;3%用于荧光标记。如果每只雌虫产生的存活后代平均少于10条幼虫，则可能表明该构建体具有毒性，导致转基因幼虫无法存活。观察到大量荧光卵但无荧光幼虫是注射混合物可能存在毒性的另一迹象。初次学习该技术时，建议使用表达效果良好的构建体，例如 act-2::mRFPmars, 在体壁肌中驱动强烈表达13 (图4).
在通过CRISPR/Cas9介导的靶向诱变产生突变体时，建议使用包含act-2::mRFPmars或act-2::GFP转基因的修复模板<sup class="xr...

针对寄生性线虫粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）和鼠类圆线虫（Strongyloides ratti）的功能基因组学工具包包括转基因技术、CRISPR/Cas9介导的诱变以及RNA干扰技术。本实验方案将演示如何通过性腺内显微注射法，将转基因元件和CRISPR组分导入粪类圆线虫（S.&#160;stercoralis）和鼠类圆线虫（S.&#160;ratti）中。

通过显微注射法在 Strongyloides 属物种中生成转基因株和基因敲除株

粪类圆线虫属（Strongyloides）包含多种可穿透皮肤的线虫，其宿主范围各异，包括粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）和……

通过显微注射将DNA构建体导入粪小杆线虫，可实现基因敲除和转基因，从而用于研究这些蠕虫的发育过程、环境导航能力以及寄生宿主的机制。迄今为止，这是在这些寄生线虫中成功生成基因敲除和转基因个体的唯一有效技术。显微注射前一天，使用玻璃巴斯德吸管将180微升琼脂糖溶液滴加到盖玻片上，随后立即覆盖第二张盖玻片，以将琼脂糖压平形成薄层垫片。5 到 10 秒后，通过滑动将两个盖玻片分开，取下顶部的盖玻片，确定琼脂垫位于哪一片载玻片上，并将其正面朝上放置。然后，从破碎的盖玻片中选取一小片玻璃碎片，用镊子轻轻将其压入琼脂垫顶部边缘附近的琼脂中。在显微注射当天，准备巴ermann 持架，该持架由两个塑料环构成，中间夹有两层尼龙筛网，并用三片重叠的实验室纸巾固定。然后将粪便-木炭混合物加入贝尔曼装置中。接着将装有粪便-木炭混合物的贝尔曼装置放入漏斗，将纸巾碎片折叠包裹住粪便-木炭混合物，并加入足量的水，使大部分粪便-木炭浸没。随后用一个15厘米的塑料培养皿盖盖住漏斗顶部，以防止气味逸出，并根据需要标记漏斗。一到两小时后，将一个50毫升离心管置于漏斗底部的橡胶管下方，小心打开底部的夹子，将含有线虫的30至40毫升水溶液排入50毫升离心管中。然后，取15毫升含有线虫的贝尔曼法收集液转移至一个15毫升离心管中。离心该管，弃去最多13毫升上清液，并将其倒入含有碘的液体废液容器中，以杀死可能存在的任何线虫。收集所有线虫后，检查试管底部的线虫沉淀。若未观察到线虫，需等待一至两小时，然后从贝尔曼装置中收集更多线虫。将线虫尽可能少地带水转移至一个直径六厘米、含2%线虫生长培养基且铺有大肠杆菌HB101菌苔的培养皿中，并将此培养皿作为显微注射的来源培养皿。在解剖显微镜下，使用标准的铂金线虫挑取工具，将卤代烃油覆盖在微注射垫盖玻片的玻璃碎片上。然后，将微注射垫盖玻片放置在微注射显微镜下，找到被油覆盖的玻璃碎片。调整玻璃碎片的位置，使其边缘与针头方向垂直，以此边缘作为折断针头的接触面。接下来，使用解剖显微镜检查，确保针头的锥形部分无气泡或碎屑，然后将针头插入加压固定器中，深度为1至1.5厘米。用肉眼观察，并在低倍镜下将针尖置于显微镜视野中央，调整针尖位置，使其在视野中与玻璃碎片的一侧垂直。随后切换至高倍镜，将针尖与玻璃边缘对齐，位置靠近但不接触玻璃边缘。接下来，为了折断针尖并使液体流动，可在持续施加气体压力的同时，轻轻将针尖在玻璃片侧面轻敲。一旦液体开始流出，需检查针尖形状，确保其锋利且液体能够顺畅流出。当液体从针尖稳定流出后，将显微注射载玻片移至解剖显微镜下，并在琼脂垫上加入一到两微升卤代烃油，用于放置线虫。将20至30条年轻成虫期的粪类圆线虫转移至不含细菌的2%线虫生长培养基平板上，放置至少五分钟，以去除表面多余的细菌，并挑选单条线虫用于显微注射。注射过程中可根据需要向平板中添加更多线虫。使用微量

generating-transgenics-knockouts-strongyloides-species

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

通过显微注射在类 圆线虫 物种中产生转基因和敲除

本视频演示了通过显微注射将外源DNA导入秀丽隐杆线虫（C.

利用显微注射法构建稳定的转基因秀丽隐杆线虫

转基因线虫在秀丽隐杆线虫（C.

通过基因枪转化法产生转基因 C. elegans

本文展示了通过体细胞核移植（SCNT）进行表观遗传重编程可作为一种工具，用于构建具有预设T细胞受体（TCR）特异性的转基因小鼠模型。这些转基因小鼠在其内源性启动子的调控下，于内源性基因座表达相应的TCR。...

通过体细胞核移植技术获得的针对Toxoplasma gondii具有预定义T细胞受体特异性的转基因核小鼠

在模式生物中，转基因技术可操控基因功能，而RNA干扰（RNAi）则可降低特定mRNA转录水平1-2。本实验方案旨在介绍将稳定遗传的DNA和瞬时双链RNA导入嗜尸线虫Pristionchus...

通过显微注射实现嗜尸线虫Pristionchus pacificus的RNAi介导基因敲低与转基因

通过胚胎显微注射将核酸递送至全球重要农业害虫昆虫地中海实蝇 Ceratitis capitata

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

对Nasonia vitripennis胚胎进行显微注射是实现可遗传基因组修饰的关键方法。本文详细描述了Nasonia...

用于Nasonia vitripennis基因组操作的胚胎显微注射与移植技术

Drosophila 转基因的胚胎显微注射

基因组编辑改进效率 通过 输卵管核酸递送（I-GONAD）方法与传统显微注射技术相当，后者需要从供体雌性动物中收集受精卵，并将其移植到假孕雌性动物体内。本方案通过引入CRISPR/Cas9诱导的突变，证明了该方法的有效性 ROSA26...

基因组编辑技术的改进 通过 基于输卵管核酸递送的 在体 内 电穿孔技术用于基因敲除小鼠的制备

本文展示了在雌雄同体斯氏线虫（Steinernema...

基于CRISPR-Cas9的昆虫病原线虫Steinernema hermaphroditum诱变及突变株系的保种

学习通过性腺内显微注射技术将转基因和CRISPR组分导入类圆线虫Strongyloides stercoralis和S. ratti的方法，用于生成基因敲除和转基因品系，研究寄生虫发育与宿主互作机制。

通过显微注射法在 Strongyloides 属物种中生成转基因株和基因敲除株

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