通过共聚焦与超分辨率显微镜联合技术对小鼠神经肌肉接头进行表征

本方案通过简单的操作流程，以接近电子显微镜的分辨率对神经肌肉接头的三维结构进行定量分析。该方案的主要优势在于肌肉样本的处理方式相似，并可进行共聚焦和STED显微镜的免疫标记，从而缩短在动物模型中准确评估神经肌肉接头结构所需的时间。我们开发的形态学定量方法可轻松适用于其他亚细胞结构的分析。

我很荣幸向大家介绍来自我团队的科学家 Martina Marinello 博士，她将演示如何进行肌肉分离和免疫染色，并就该方案的成功应用提供一些建议。我还有幸介绍来自 Genethon 成像平台的 Jeremie Cosette 博士，他将展示如何使用共聚焦显微镜和 STED 显微镜进行图像采集与分析。在动物安乐死后，使用两把精细的锯齿状镊子，将胫骨前肌分离成宽度约为一毫米的小束肌纤维，开始进行肌纤维剥离操作。

随后，将这些肌束转移至含有 PBS 配制的 1% Triton X-100 的 24 孔板中，在室温下轻轻振荡孵育 1 小时，或在 4°C 下孵育 5 小时。用 PBS 在室温下洗涤样品三次，每次 5 分钟后，将样品在含有 PBS 配制的 4% BSA 和 1% Triton X-100 的封闭液中，于 4°C 下在轻柔振荡条件下孵育 4 小时。然后，将样品在含有针对神经丝蛋白 M 或突触小泡糖蛋白 2 的一抗单克隆抗体的相同封闭液中，于 4°C 下过夜孵育，以分别标记突触前轴突末端或活性区。

次日，在轻柔振荡条件下，用 PBS 将标记的肌束清洗三次，每次五分钟。然后将肌束置于摇床上，加入适当的二抗，室温孵育两小时。再次清洗肌束后，将其置于载玻片上，用封片介质封片。

然后，在顶部放置一个1.5级的玻璃盖玻片，并在载玻片两侧放置圆柱形磁铁，以施加压力并压平肌肉组织。使用共聚焦显微镜成像时，启动显微镜软件，选择“机器”作为配置模式，并根据文本稿件中所述的设置，采集各实验组神经肌肉接头的图像堆栈。会话结束时，点击“在3D查看器中打开”，选择一个代表该实验组的神经肌肉接头，以可视化其三维标记。

为计算突触后神经肌肉接头及终板体积、最大强度投影面积和相对扭曲度，将用于神经肌肉接头体积定量的宏文件拖放到 Image J 窗口中；当该宏在第二个窗口中打开后，点击 Macros 并运行宏。选择包含待分析接头子文件夹的原始文件夹，然后点击 Select。随后，在保存文件夹的弹出菜单中选择存储文件夹，然后点击 Select。

在名为“图像类型”的新弹出菜单中，选择Z轴层叠采集的格式。选择与目标染色相对应的RGB通道，并输入X、Y方向的像素尺寸和Z轴步长。如果选择了专有文件格式，宏将直接读取像素尺寸和Z轴步长。

为了定量分析突触前神经丝的聚集情况，将神经肌肉接头聚集定量分析宏拖放到 Image J 窗口中，然后点击 Macros（宏）并运行宏。选择之前演示过的接头子文件夹、存储文件夹以及Z轴堆栈图像的格式。随后，在“Staining Infos”（染色信息）弹出窗口中，标明突触前和突触后的标记物及其颜色，然后点击“OK”（确定）。在“Pixel Size”（像素大小）弹出窗口中，设置X、Y方向的像素大小为0.072微米，Z轴步进为0.5微米，然后点击“OK”（确定）。如果选择了专有文件格式，该宏将直接读取像素大小和Z轴步进信息。

要计算乙酰胆碱受体条带之间的距离，请在中央窗口顶部选择“Quantify”菜单。点击“Tools”选项卡，选择“intensity”，然后点击线轮廓（line profile）图标。将Oversampling设置为1，并勾选Sort Channels。

单击“打开项目”选项卡，选择要分析的已过滤图像。然后，单击绘制线条图标，沿垂直方向穿过多条条带或连接褶皱画一条线。单击第一个峰顶，按住鼠标左键并移动鼠标指针，直至到达下一个最高峰顶。

记录 DX 值，该值对应于两个峰之间的距离。在右侧窗口图像中右键单击鼠标，然后选择“保存 ROI”。单击箭头图标后，点击 ROI，并通过单击垃圾桶图标将其删除。

为计算乙酰胆碱受体条带的宽度，请在工具选项卡的左上方面板中选择“强度”，点击“确定半高全宽（FWHM）”图标，并勾选“排序通道”。然后点击“打开项目”选项卡，选择待分析的滤波图像。接下来，点击右窗口顶部菜单中的“绘制矩形”图标。

选择一个水平或垂直的条带，并垂直于该条带绘制一个矩形。中央窗口将显示一个轮廓。根据条带的方向是垂直还是水平，单击左侧面板中“平均投影”菜单的相应选项（垂直或水平）。

单击中央窗口中的统计信息以读取 FWHM 值，然后保存并删除 ROI，操作方法如前所述。使用荧光标记的 α-银环蛇毒素标记的突触后运动终板在两种小鼠品系的突变体中表现为更小且呈碎片化。利用定制的 Image J 宏对神经肌肉接头的 Z 轴层扫图像进行定量分析，结果显示，与对照组相比，两种疾病小鼠模型的终板体积、最大强度投影以及相对弯曲度均显著降低，表明存在神经肌肉接头成熟缺陷。

使用 Image J 自定义宏对突触前轴突末梢分支分布进行定量分析，揭示了两种动物模型中神经丝蛋白 M 分布模式的改变，表现为免疫标记增强。通过突触小泡糖蛋白 2 染色，在 Smn 2B/- 小鼠中观察到乙酰胆碱受体区域与相邻神经末梢活性区共定位的比例减少了 43%。利用荧光标记的α-银环蛇毒素染色及强度分布分析，可清晰显示神经肌肉接头突触后终板的形态特征。

对神经肌肉接头参数的评估显示，突变体腓肠肌中乙酰胆碱受体条纹的接头皱褶间距和宽度增加。为了获得可靠的结果，必须恰当地分离肌肉，并特别注意施加的力度，以分开肌束。该方案有助于更深入地表征神经肌肉接头的形态学特征，而此前这类特征仅能通过透射电子显微镜等复杂且耗时的实验方法进行分析。

STED成像技术为研究神经肌肉接头疾病病理生理学相关的突触前和突触后标志物提供了新途径。