Name: 通过联合共聚焦和超分辨率显微镜表征小鼠的神经肌肉接头 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 学习利用共聚焦和STED超分辨率显微镜对小鼠神经肌肉接头进行定量形态学分析的方法。该方案可精确评估脊髓性肌萎缩症和先天性肌无力综合征模型中的突触结构病理变化。

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我们感谢Genethon的&#34;成像与流式细胞术核心设施&#34;以及组织学服务部门，这些设施部分得到了法兰西岛大区、埃松省议会、埃夫里基因谷研究计划、埃夫里-瓦尔德埃松大学和法国国家健康与医学研究院（INSERM）的设备资金支持。我们还感谢Rashmi Kothary博士提供了Smn2B/2B小鼠品系（加拿大渥太华大学），以及Eric Krejci博士提供了ColQDex2/+小鼠品系（未发表，法国巴黎大学）。我们感谢Guillaume Corre在统计分析方面提供的支持。2H3单克隆抗体（由Jessel T.M.和Dodd J.研制）和SV2单克隆抗体（由Buckley K.M.研制）来自发育研究杂交瘤库（DSHB），该库由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）创建，并由爱荷华大学生物系（美国爱荷华州爱荷华城，邮编52242）维护。本研究得到了法国肌病协会（AFM-Telethon）、法国国家健康与医学研究院（INSERM）以及埃夫里-瓦尔德埃松大学的支持。

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作者声明本研究不存在任何利益冲突。

本视频方案详细介绍了通过结合共聚焦显微镜和STED显微镜来定量分析神经肌肉接头三维结构的方法，可用于表征突触前和突触后水平的病理变化。STED显微镜的高分辨率能够可视化并进行形态计量分析，识别出传统共聚焦成像无法分辨的纳米级结构。该方法使我们能够测量脊髓性肌萎缩症（SMA）和ColQ相关先天性肌无力综合征（CMS）小鼠两种四肢肌肉——胫骨前肌（tibialis anterior）和腓肠肌（gastrocnemius）中神经肌肉接头的结构改变。
为了通过该技术获得可靠的结果，必须正确地解剖和分离肌肉，特别注意肌肉周围的筋膜以及用于分离肌束的力度；否则，神经支配模式可能被破坏，从而妨碍对神经肌肉接头（NMJ）突触前结构的准确评估。尽管文中提供了详细的胫骨前肌（TA）和腓肠肌（GA）神经肌肉接头分析方法，但原则上，本方案也可适用于其他肌肉，包括不需要进行肌束分离步骤的扁平肌肉，如膈肌或腹横肌37。组织固定对于确保染色质量也至关重要，因此建议使用高质量的多聚甲醛（PFA），用量应为肌肉体积的15–20倍。此外，固定剂作用时间是一个关键步骤，因为过度固定可能导致收缩、聚集等假象，进而影响神经肌肉接头的形态特征。考虑到样本大小及多聚甲醛溶液在组织中的渗透速率38，建议此类肌肉的固定时间为18–24小时。若计划在组织取材一周后进行染色步骤，建议将PFA固定的肌肉置于添加叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）中，于4 °C保存，以防止细菌增殖。
本方案采用α-BTX-F488进行共聚焦成像，α-BTX-F633进行STED成像。所选荧光染料符合所述实验设计，但可根据可用的设备和材料进行调整。例如，在使用STED连续波592 nm激光进行图像采集和定量分析时，可选择α-BTX F488标记。然而，本研究中采用的配置（脉冲激发门控STED，775 nm耗尽）在性能和分辨率方面优于其他方法（如连续波STED39），因此更适用于当前应用。此外，需谨慎选择激光功率参数，尤其是STED的激发和耗尽激光功率，因为在信号饱和的情况下无法准确测量强度分布特征，因此神经肌肉接头图像中任何饱和信号都可能影响整个分析结果。
本详细工作流程包括使用显微镜软件和ImageJ宏进行图像采集与分析，旨在实现从单块肌肉出发，对神经肌肉接头（NMJ）进行自主形态计量分析，适用于共聚焦显微镜和STED显微镜。此前已报道的NMJ共聚焦分析工作流程，如NMJ-morph2或NMJ-Analyser14，为半自动分析方法的设计奠定了基础，促进了NMJ的形态学分析及比较研究。NMJ-morph（及其更新版本aNMJ-morph15）是一个基于免费ImageJ平台的工具，利用最大强度投影测量21项形态学特征；NMJ-Analyser则采用Python编写的脚本，从完整的三维NMJ结构中生成29个相关参数。在这两种方法中，图像处理过程中唯一需要用户参与的步骤是手动设定阈值。本整合性实验方案详细描述了组织制备、三维共聚焦图像采集以及基于ImageJ的完整骨骼肌NMJ处理步骤，并对突触后（体积、最大投影面积和曲折度）和突触前（轴突终末占据率和神经丝蛋白聚集）终板的五个重要参数进行了简明概述。此外，为在纳米尺度上进行形态计量分析，本研究引入了一个具有生物学意义的额外参数——突触后接头皱褶中乙酰胆碱受体（AChR）的组织排列模式，并通过超分辨率STED显微镜（分辨率20–30 nm）实现40。有趣的是，STED成像的组织制备比其他用于NMJ超微结构研究的方法更为简便，例如传统的透射电子显微镜（TEM）9，后者是一种较为复杂且耗时的过程，需要熟练的操作人员才能获得适当肌肉区域的超薄切片。此外，利用STED配套软件可自动获取多个接头皱褶的定量数据。
本方案已用于阐明SMN和ColQ缺陷肌肉中先前已知的神经肌肉接头（NMJ）缺陷20,36,41,42。通过共聚焦显微镜在两种小鼠模型中均观察到一些共同的变化，例如突触后终板体积减小、MIP面积减小、相对扭曲度降低，以及神经丝积聚增加；而某些更特异性的发现（如NMJ占据率降低）仅在脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠中观察到，提示囊泡运输功能受损36。最后，通过STED分析在ColQ-KO小鼠中检测到乙酰胆碱受体（AChR）条纹间距和宽度增加，这表明突触后皱褶存在超微结构缺陷，此前透射电镜（TEM）研究中也观察到类似现象20。重要的是，本方案有助于在发育、维持以及多种病理条件下对神经肌肉接头进行更深入的形态学表征。

神经肌肉接头（NMJ）是一种复杂的结构，由运动轴突末梢、突触周围许旺细胞和参与化学信息传递以及将下运动神经元活动与肌肉收缩相偶联的骨骼肌纤维部分组成。在哺乳动物中，神经肌肉接头的形态在发育过程中发生变化，成熟后呈现典型的椒盐卷饼样形状，不同物种之间的形态和复杂程度存在差异，并且在应对运动或衰老等生理过程时表现出一定程度的可塑性1,2,3,4。突触后运动终板形成称为接头皱褶的膜内陷结构，其上部含有乙酰胆碱受体（AChR），并与突触前轴突末梢分支紧密接触5。
神经肌肉接头的形态和功能改变参与了多种神经退行性疾病（如脊髓性肌萎缩症（SMA）和肌萎缩侧索硬化症（ALS））、肌病（如杜氏肌营养不良症（DMD）、先天性肌无力综合征（CMS）、重症肌无力（MG）和中心核肌病（CNM））以及衰老相关性肌肉减少症3,6,7,8,9,10,11,12的病理生理过程。在这些疾病中，可观察到神经肌肉接头的结构改变，例如终板碎裂、突触后褶皱尺寸减小和/或失神经支配。神经肌肉接头的病理变化可能在疾病进展过程中作为原发性或早期事件出现，也可能作为继发性事件在后期出现，并促进临床症状的发展。无论哪种情况，在这些疾病的动物模型中监测神经肌肉接头的形态均是研究病理变化和评估潜在治疗效果的重要参数。
神经肌肉接头的形态通常通过共聚焦显微镜2,13,14,15或电子显微镜5,16技术进行分析，这两种方法分别存在分辨率或技术操作难度等固有局限性。近年来，超分辨率显微镜也被用于可视化神经肌肉接头的特定区域，例如突触前活性区或突触后膜上乙酰胆碱受体（AChR）的分布16,17,18，作为电子显微镜进行超微结构分析的替代或补充手段。
本方案旨在通过结合荧光共聚焦显微镜和受激发射损耗（STED）显微镜技术，提供一种详细且可重复的评估神经肌肉接头（NMJ）形态学参数的方法。在正常和疾病状态下，对小鼠&#160;gastrocnemius 和 tibialis anterior 肌肉中去单根肌纤维神经支配的突触前和突触后终板的重要特征进行了量化分析，包括体积、面积、相对曲折度、乙酰胆碱受体（AChR）条带宽度以及轴突终末分布等参数。特别地，以脊髓性肌萎缩症的 Smn2B/- 小鼠模型为例展示了NMJ的缺陷，该神经肌肉疾病由 SMN1 基因突变引起运动神经元变性11,19；此外还采用了不对称乙酰胆碱酯酶胶原样尾亚基基因敲除（ColQDex2/Dex2 或 ColQ-KO）小鼠作为先天性肌无力综合征的模型进行了研究20,21,22。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;缓冲液与试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (F488)</td><td>Life Technologies, Thermofisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 &amp;alpha;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td><td>Life Technologies, Thermofisher</td><td>B13422</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG (F594)</td><td>Life Technologies, Thermofisher</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>ATTO-633 &amp;alpha;-bungarotoxin (F633-a-BTX)</td><td>Alomone Labs</td><td>B-100-FR</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>浸油，n = 1.518</td><td>THORLABS</td><td>MOIL-10LF&amp;nbsp;</td><td>低自发荧光</td></tr><tr><td>神经丝蛋白 (NF-M) 抗体&amp;nbsp;</td><td>DSHB</td><td>AB_531793</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛 (PFA)</td><td>MERCK</td><td>1.04005</td><td></td></tr><tr><td>突触小泡糖蛋白 2 (SV2) 抗体</td><td>DSHB</td><td>AB_2315387</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝镍钴圆柱形磁铁</td><td>Farnell France</td><td>E822</td><td>直径 19.1 mm，最大拉力 1.9 Kg</td></tr><tr><td>63x 1.4 NA 油镜 HCX Plan Apo CS 物镜&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 物镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>弯曲细镊子 - Moria 虹膜镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>超细剪刀 - Vannas-T&amp;uuml;bingen 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15-003-08</td><td></td></tr><tr><td>细齿镊</td><td>Euronexia</td><td>P-95-AA</td><td></td></tr><tr><td>加样枪头（圆头）1-200 &amp;micro;L</td><td>COSTAR</td><td>4853</td><td></td></tr><tr><td>Leica 激光共聚焦显微镜 TCS SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 激光共聚焦显微镜 TCS SP8 Gated STED 775 nm</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镜头清洁纸&amp;nbsp;</td><td>Whatman (GE Healthcare)</td><td>2105-841</td><td></td></tr><tr><td>中等齿镊</td><td>Euronexia</td><td>P-95-AB</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 24x50 mm，1.5H，170&amp;plusmn;5 &amp;micro;m</td><td>Marienfield</td><td>107222</td><td>高精度</td></tr><tr><td>Nunclon delta 表面（12 孔板）</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon delta 表面（24 孔板）</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Safeshield 手术刀</td><td>Feather</td><td>02.001.40.023</td><td></td></tr><tr><td>尖钝剪刀 - 精细剪刀 - 马氏体不锈钢</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus 载玻片</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad&amp;nbsp;</td><td>Prism, San Diego (US)</td><td>Release N&amp;deg;6.07</td><td>统计分析软件</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>Release N&amp;deg; 1.53f</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X 软件</td><td>Leica Microsystems</td><td>Release N&amp;deg;3.7.2.2283</td><td>可在 https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ 免费获取的显微镜软件&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

通过共聚焦与超分辨率显微镜联合技术对小鼠神经肌肉接头进行表征

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

神经肌肉接头（NMJs）是下运动神经元与骨骼肌纤维之间高度特化的突触，它们在神经系统向随意肌传递分子信号并引发肌肉收缩的过程中发挥着关键作用。许多人类疾病都会影响神经肌肉接头，包括杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）、先天性肌无力综合征（congenital myasthenic syndromes, CMS）、脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等遗传性神经肌肉疾病。因此，在疾病小鼠模型中监测神经肌肉接头的形态及其变化，是病理学研究和治疗策略临床前评估的重要工具。本文介绍了从小鼠分离的单根肌纤维中标记和分析运动终板突触前和突触后部分三维（3D）形态的方法。详细描述了样本制备流程，以及通过共聚焦成像测量神经肌肉接头体积、面积、分支复杂度（tortuosity）和轴突终末形态/占据情况的方法，同时还介绍了利用超分辨率受激发射损耗（stimulated emission depletion, STED）显微镜测量突触后皱褶与乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor, AChR）条带宽度之间距离的技术。本文以脊髓性肌萎缩症（SMA）和先天性肌无力综合征（CMS）突变小鼠为例，展示了这些神经肌肉接头参数的异常改变。

为了以可重复的方式在突触前和突触后水平对神经肌肉接头进行形态学分析，我们建立了一套从肌肉组织采集到显微镜成像及定量分析的工作流程，该流程结合使用显微镜软件和ImageJ自定义宏（图1）。为展示本实验方案的应用价值，我们评估了两种遗传性疾病小鼠模型——脊髓性肌萎缩症（SMA）模型Smn2B/- 小鼠和先天性肌无力综合征（CMS）模型ColQDex2/Dex2小鼠——的神经肌肉接头形态，并将其数据与同龄对照组 littermates 进行比较。
在疾病表征已出现的3周龄和6周龄小鼠中，分别评估了tibialis anterior和gastrocnemius肌肉的神经肌肉接头（NMJ）结构，这些小鼠分别为Smn2B/- （C57Bl/6背景）和ColQDex2/Dex2（B6D2F1/J背景）基因型。在3周龄时，Smn2B/- 小鼠表现出骨骼肌发育迟缓和去神经支配的迹象，例如NMJ萎缩和丢失35,36。先天性肌无力综合征（CMS）小鼠的NMJ存在原发性病理改变，并从出生第一周起即表现出体重下降和显著的肌无力20（数据未显示）。如图2A所示，通过共聚焦显微镜观察，用荧光标记的α-银环蛇毒素染色的突触后运动终板在两种小鼠模型的突变体中均显得更小和/或出现碎片化。使用定制的ImageJ宏对NMJ的Z轴堆栈图像进行定量分析，结果显示，与对照组相比，脊髓性肌萎缩症（SMA）和CMS小鼠的终板体积、最大强度投影（MIP）以及相对扭曲度均显著降低，提示存在NMJ成熟缺陷32（图2B-D）。在患病动物中，突触后终板体积和MIP均减少（Smn2B/- 小鼠体积减少2.7倍，MIP减少2.5倍；ColQDex2/Dex2小鼠体积减少2.0倍，MIP减少2.0倍）。SMN和ColQ缺陷肌肉中的相对扭曲度也低于野生型（SMA小鼠为16.97% ± 1.33%，野生型小鼠为48.84% ± 5.90%；CMS小鼠为13.29% ± 2.79%，对照组小鼠为30.20% ± 4.44%）。此外，使用ImageJ自定义宏对突触前轴突终末分支分布进行定量分析，结果显示两种动物模型中中等分子量神经丝蛋白（neurofilament M）的分布模式发生改变，免疫荧光信号增强（Smn2B/- 小鼠为84.65% ± 0.32% 对照组为16.57% ± 2.03%；ColQDex2/Dex2小鼠为23.64% ± 2.78% 对照组为18.77% ± 1.73%）（图3A-D）。通过SV2染色发现，Smn2B/- 小鼠的占据率（即含有相邻神经末梢活性区的乙酰胆碱受体区域所占百分比）减少了43%（SMA小鼠为49.36% ± 3.76%，野生型小鼠为85.69% ± 2.34%）（图3E,F）。该NMJ参数也在ColQDex2/Dex2突变体的胃肌（GA）中进行了计算，但与对照组 littermates 相比未发现统计学上的显著差异（数据未显示）。
我们通过量化突触后膜皱襞之间的距离以及位于这些皱襞 crest 处的 AChR 条带宽度，进一步分析了突触后膜的特征， ColQ使用超分辨率受激发射损耗（STED）显微镜观察缺乏特定蛋白的肌肉组织。如图所示 图 4，这些结构的形态可通过荧光标记的α-银环蛇毒素染色结合强度分布分析清晰地可视化。我们评估了这些神经肌肉接头参数，发现乙酰胆碱受体条带的突触褶间距（d）和宽度（w）增加 腓肠肌 突变体肌肉中肌节的距离分别为 358.3 nm ± 11.97 nm 和 320.8 nm ± 10.90 nm，宽度分别为 216.9 nm ± 10.51 nm 和 186.3 nm ± 7.015 nm ColQDex2/Dex2 与野生型小鼠相比，p &lt; 0.05) (图4C，D).
<img alt="肌肉纤维STED分析；示意图；免疫标记、共聚焦图像栈、NMJ强度、曲折度方程" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：通过共聚焦和STED显微镜进行三维多尺度神经肌肉接头（NMJ）表征的视频方案流程图。Tibialis anterior（TA）和gastrocnemius（GA）肌肉取自小鼠，分离出肌纤维后，使用α-银环蛇毒素-F488或α-银环蛇毒素-F633、DAPI、针对神经丝蛋白M（NF-M）和突触小泡糖蛋白2（SV2）的一抗，以及荧光染料（F488或F594）标记的二抗进行标记。通过共聚焦显微镜获取图像栈，并用于测量突触后NMJ体积、突触前NF-M聚集、NMJ轴突终末占据率、突触后最大强度投影（MIP）终板面积以及曲折度（dObj(AB)表示沿物体边缘（红线）A点与B点之间的距离，而dEuc(AB)表示A点与B点之间的欧几里得距离（绿线））。在STED显微镜分析中，通过α-BTX-F633染色的强度分布曲线量化乙酰胆碱受体（AChR）条带的宽度以及接头皱襞之间的距离。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经肌肉接头分析；α-BTX染色；胫骨前肌和腓肠肌；柱状图显示WT、Smn2B/−、ColQDex2/Dex2小鼠神经肌肉接头突触后体积、面积和强度；肌肉比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：脊髓性肌萎缩症（SMA）和ColQ相关先天性肌无力综合征（CMS）小鼠模型中神经肌肉接头突触后多参数表征。（A）使用α-银环蛇毒素-F488（α-BTX）标记的胫骨前肌（TA）和腓肠肌（GA）突触后运动终板代表性图像。（B）3周龄野生型（WT）和Smn2B/-小鼠TA肌肉中神经肌肉接头突触后终板体积的定量分析，（C）最大强度投影（MIP）面积，以及（D）相对扭曲度（左图，每种基因型N = 3只动物，分别为n = 37和n = 56个神经肌肉接头）；6周龄WT和ColQDex2/Dex2小鼠（右图，每种基因型N = 5只小鼠，分别为n = 89和n = 97个神经肌肉接头）。数据以每只小鼠的平均值（圆点）± 标准误（SEM）表示。组间差异采用Mann-Whitney检验分析（* p &lt; 0.05）。比例尺为10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="野生型与突变型中神经丝蛋白的聚集情况；荧光显微镜图像、柱状图、ColQ突变" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3野生型与突变型小鼠肌肉中突触前轴突末梢分布的形态计量学分析 神经肌肉接头支配模式 胫骨前肌 （TA）和 腓肠肌 野生型、SMA 的 (GA) 肌肉 ColQ相关的 CMS 小鼠。 (A, B野生型和突变型TA中具有代表性的神经肌肉接头 Smn2B/- 21日龄小鼠，使用针对神经丝蛋白M（NF-M，红色）和α-银环蛇毒素-F488（α-BTX，绿色）的抗体标记（A），以及神经丝积聚的定量分析结果（B); (C, D6周龄野生型小鼠GA肌典型神经肌肉接头 ColQDex2/Dex2 小鼠经神经丝蛋白M（NF-M，红色）抗体和α-银环蛇毒素-F488（α-BTX，绿色）标记，显示碎片化且不成熟的突触后终板（C），以及两组动物中神经丝积聚的结果（D）。N = 4（n = 34 个神经肌肉接头）B）以及 N = 3（n = 54 个神经肌肉接头）（D野生型动物，N=3（n=36 个神经肌肉接头） Smn2B/- 且 N = 3（n = 55 个神经肌肉接头） ColQDex2/Dex2 小鼠在实验中被分析（B, D). (E, F) 3周龄野生型（WT）和突变型小鼠TA肌肉NMJ中轴突终末占据情况的代表性图像 Smn2B/- 用突触小泡糖蛋白2抗体（SV2，红色）和α-银环蛇毒素-F488（α-BTX，绿色）标记的小鼠 (E），以及神经肌肉接头占据率（SV2/AChR 体积比）的结果（F). 来自 N = 3（n = 50 个 NMJ）野生型和 N = 4（n = 62 个 NMJ） Smn2B/- 小鼠被用于分析。数据以每只小鼠的平均值（圆点）± 标准误（SEM）表示。组间差异采用Mann-Whitney检验分析（* p &lt; 0.05）。比例尺为 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="α-BTX定位图与AChR分布图、比例尺及统计分析结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：STED 成像技术对神经肌肉接头突触后终板的观察。 (A代表性STED图像，显示用α-银环蛇毒素-F633（α-BTX）标记的神经肌肉接头 腓肠肌 6周龄野生型小鼠的突触后乙酰胆碱受体条带（标尺为 5 µm). (B) 乙酰胆碱受体（AChR）条带区域的高倍放大图像（下图），用于生成强度分布曲线。对该区域的AChR条带宽度（w）以及相邻两条带之间的距离（d）进行量化，并在柱状图中展示。示意图显示突触后终板结构，以说明AChR条带的宽度（w）和间距（d）。这些参数（CAChR 条带间距和（D）宽度，在 ColQDex2/Dex2 6周龄小鼠及其对照同窝小鼠。来自5只野生型（总计n = 29个NMJ）和6只 ColQDex2/Dex2 （总共分析了43个NMJ的动物），分析过程采用盲法。数据以每只小鼠的平均值（圆点）± 标准误（SEM）表示。组间统计学差异采用Mann-Whitney检验进行分析（* p &lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图1：LAS X软件的启动及共聚焦图像采集参数。 共聚焦图像采集的各个步骤在实验方案的3.1.2至3.1.7节中进行了描述。每次采集NMJ图像堆栈时，需打开一个项目（步骤3.1.4），并设置图像尺寸、采集速度以及X、Y和Z轴参数（步骤3.1.7），同时指定每次连续扫描的条件（Seq.1，405 nm激光用于DAPI染色；Seq.2，488 nm激光用于α-BTX-F488；Seq.3，552 nm激光用于F594标记的二抗）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：LAS X软件的启动及STED成像参数设置。 获取STED图像的步骤在实验方案的3.2.2至3.2.8节中进行了描述。显微镜以STED ON配置模式启动（步骤3.2.2），然后打开一个项目（步骤3.2.3）。图像采集参数（步骤3.2.7）（包括图像尺寸、采集速度、缩放倍数、X轴方向）针对每次连续扫描进行设置（Seq.1用于α-BTX-F633；Seq.2用于F488标记的二抗）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：通过STED显微镜获得的α-BTX染色突触后皱褶图像。 使用α-BTX-F633标记的6周龄野生型小鼠突触后终板图像示例，左图为正确聚焦下获取的图像，右图为聚焦不准确时获取的图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4：自定义ImageJ宏输入与输出数据的Windows弹窗说明。 左侧列展示了NMJ图像的输入数据示例（.tif和.lif文件）。宏生成的输出数据（右侧列）将保存在文件夹中（Save_Volume、Save_Accu），其中包含突触连接的图像（.tif）以及包含结果的数据表（.csv文件）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图5：使用LAS X软件对STED图像中的AChR条纹间距和宽度进行分析。 分析NMJ STED图像的步骤详见方案第5节。A) 标记的突触后终板区域图像，其中包含AChR条纹。通过绘制垂直线（绿色线，用于条纹间距）或垂直矩形（紫色矩形，用于条纹宽度）来选择条纹分析的兴趣区域。B、C) 显示所选区域的强度分布曲线，以及用于计算AChR条纹间距（B）和AChR条纹宽度（C）的测量结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 1：Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal。 用于提取神经肌肉接头参数测量值（神经肌肉接头体积、最大投影终板面积和神经肌肉接头迂曲度）的 ImageJ 自定义宏。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充代码文件 2：Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal。ImageJ 自定义宏，用于提取 NF-M 积累和 SV2 染色信号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种通过共聚焦与STED显微镜联合进行神经肌肉接头形态计量分析的方法，用于量化脊髓性肌萎缩（SMA）和与ColQ相关的先天性肌无力综合征（CMS）小鼠模型中的病理改变。

神经肌肉接头（NMJs）是下运动神经元与骨骼肌纤维之间高度特化的突触，其在……中发挥至关重要的作用。

本方案通过简单的操作流程，以接近电子显微镜的分辨率对神经肌肉接头的三维结构进行定量分析。该方案的主要优势在于肌肉样本的处理方式相似，并可进行共聚焦和STED显微镜的免疫标记，从而缩短在动物模型中准确评估神经肌肉接头结构所需的时间。我们开发的形态学定量方法可轻松适用于其他亚细胞结构的分析。我很荣幸向大家介绍来自我团队的科学家 Martina Marinello 博士，她将演示如何进行肌肉分离和免疫染色，并就该方案的成功应用提供一些建议。我还有幸介绍来自 Genethon 成像平台的 Jeremie Cosette 博士，他将展示如何使用共聚焦显微镜和 STED 显微镜进行图像采集与分析。在动物安乐死后，使用两把精细的锯齿状镊子，将胫骨前肌分离成宽度约为一毫米的小束肌纤维，开始进行肌纤维剥离操作。随后，将这些肌束转移至含有 PBS 配制的 1% Triton X-100 的 24 孔板中，在室温下轻轻振荡孵育 1 小时，或在 4°C 下孵育 5 小时。用 PBS 在室温下洗涤样品三次，每次 5 分钟后，将样品在含有 PBS 配制的 4% BSA 和 1% Triton X-100 的封闭液中，于 4°C 下在轻柔振荡条件下孵育 4 小时。然后，将样品在含有针对神经丝蛋白 M 或突触小泡糖蛋白 2 的一抗单克隆抗体的相同封闭液中，于 4°C 下过夜孵育，以分别标记突触前轴突末端或活性区。次日，在轻柔振荡条件下，用 PBS 将标记的肌束清洗三次，每次五分钟。然后将肌束置于摇床上，加入适当的二抗，室温孵育两小时。再次清洗肌束后，将其置于载玻片上，用封片介质封片。然后，在顶部放置一个1.5级的玻璃盖玻片，并在载玻片两侧放置圆柱形磁铁，以施加压力并压平肌肉组织。使用共聚焦显微镜成像时，启动显微镜软件，选择“机器”作为配置模式，并根据文本稿件中所述的设置，采集各实验组神经肌肉接头的图像堆栈。会话结束时，点击“在3D查看器中打开”，选择一个代表该实验组的神经肌肉接头，以可视化其三维标记。为计算突触后神经肌肉接头及终板体积、最大强度投影面积和相对扭曲度，将用于神经肌肉接头体积定量的宏文件拖放到 Image J 窗口中；当该宏在第二个窗口中打开后，点击 Macros 并运行宏。选择包含待分析接头子文件夹的原始文件夹，然后点击 Select。随后，在保存文件夹的弹出菜单中选择存储文件夹，然后点击 Select。在名为“图像类型”的新弹出菜单中，选择Z轴层叠采集的格式。选择与目标染色相对应的RGB通道，并输入X、Y方向的像素尺寸和Z轴步长。如果选择了专有文件格式，宏将直接读取像素尺寸和Z轴步长。为了定量分析突触前神经丝的聚集情况，将神经肌肉接头聚集定量分析宏拖放到 Image J 窗口中，然后点击 Macros（宏）并运行宏。选择之前演示过的接头子文件夹、存储文件夹以及Z轴堆栈图像的格式。随后，在“Staining Infos”（染色信息）弹出窗口中，标明突触前和突触后的标记物及其颜色，然后点击“OK”（确定）。在“Pixel Size”（像素大小）弹出窗口中，设置X、Y方向的像素大小为0.072微米，Z轴步进为0.5微米，然后点击“OK”（确定）。如果选择了专有文件格式，该宏将直接读取像素大小和Z轴步进信息。要计算乙酰胆碱受体条带之间的距离，请在中央窗口顶部选择“Quantify”菜单。点击“Tools”选项卡，选择“intensity”，然后点击线轮廓（line profile）图标。将Oversampling设置为1，并勾选Sort Channels。单击“打开项目”选项卡，选择要分析的已过滤图像。然后，单击绘制线条图标，沿垂直方向穿过多条条带或连接褶皱画一条线。单击第一个峰顶，按住鼠标左键并移动鼠标指针，直至到达下一个最高峰顶。记录 DX 值，该值对应于两个峰之间的距离。在右侧窗口图像中右键单击鼠标，然后选择“保存 ROI”。单击箭头图标后，点击 ROI，并通过单击垃圾桶图标将其删除。为计算乙酰胆碱受体条带的宽度，请在工具选项卡的左上方面板中选择“强度”，点击“确定半高全宽（FWHM）”图标，并勾选“排序通道”。然后点击“打开项目”选项卡，选择待分析的滤波图像。接下来，点击右窗口顶部菜单中的“绘制矩形”图标。选择一个水平或垂直的条带，并垂直于该条带绘制一个矩形。中央窗口将显示一个轮廓。根据条带的方向是垂直还是水平，单击左侧面板中“平均投影”菜单的相应选项（垂直或水平）。单击中央窗口中的统计信息以读取 FWHM 值，然后保存并删除 ROI，操作方法如前所述。使用荧光标记的 α-银环蛇毒素标记的突触后运动终板在两种小鼠品系的突变体中表现为更小且呈碎片化。利用定制的 Image J 宏对神经肌肉接头的 Z 轴层扫图像进行定量分析，结果显示，与对照组相比，两种疾病小鼠模型的终板体积、最大强度投影以及相对弯曲度均显著降低，表明存在神经肌肉接头成熟缺陷。使用 Image J 自定义宏对突触前轴突末梢分支分布进行定量分析，揭示了两种动物模型中神经丝蛋白 M 分布模式的改变，表现为免疫标记增强。通过突触小泡糖蛋白 2 染色，在 Smn 2B/- 小鼠中观察到乙酰胆碱受体区域与相邻神经末梢活性区共定位的比例减少了 43%。利用荧光标记的α-银环蛇毒素染色及强度分布分析，可清晰显示神经肌肉接头突触后终板的形态特征。对神经肌肉接头参数的评估显示，突变体腓肠肌中乙酰胆碱受体条纹的接头皱褶间距和宽度增加。为了获得可靠的结果，必须恰当地分离肌肉，并特别注意施加的力度，以分开肌束。该方案有助于更深入地表征神经肌肉接头的形态学特征，而此前这类特征仅能通过透射电子显微镜等复杂且耗时的实验方法进行分析。STED成像技术为研究神经肌肉接头疾病病理生理学相关的突触前和突触后标志物提供了新途径。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

通过联合共聚焦和超分辨率显微镜表征小鼠的神经肌肉接头

Drosophila melanogaster 的神经肌肉接头（NMJ）是研究正常突触功能以及某些神经系统疾病中突触功能异常的重要模型系统。本文介绍了一种用于解剖 Drosophila 幼虫运动系统的实验方案，以及对 NMJ...

活性区的分离与成像 果蝇 神经肌肉接头

我们描述了对年轻成年小鼠的耳长提肌（LAL）反复给予毒蕈碱信号通路抑制剂的操作步骤，以及随后对完整肌肉标本中神经肌肉接头（NMJs）进行免疫染色的方法。LAL肌在揭示药物对神经肌肉接头的体内药理作用方面具有独特优势。...

小鼠耳前长肌的毒蕈碱受体拮抗剂皮下给药及三重免疫荧光染色

在致密组织中观察单个细胞（例如神经肌肉接头（NMJs）处的终末施万细胞（SCs））具有挑战性。“连续光漂白”技术可用于清晰界定单个终末施万细胞，例如在胸骨三角肌离体组织中，这是一种便捷的神经-肌肉制备模型，可在其中将连续漂白与延时成像以及事后免疫染色相结合。...

通过连续光漂白法界定神经肌肉接头处单个施万细胞

来源：Marinello, M.，等. 通过共聚焦与超分辨率显微镜联合表征小鼠神经肌肉接头.J. Vis. Exp.

通过共聚焦与超分辨率显微镜联合表征小鼠神经肌肉接头

在本视频中，我们演示了一种解剖小鼠大脑海马区的实验方案 腹横肌...

解剖 腹横肌 用于全组织神经肌肉接头分析的肌肉

在多种情况下，神经肌肉接头（NMJ）会发生改变，有时可能导致突触功能障碍。本报告描述了基于荧光显微镜的方法，用于量化此类结构变化。...

神经肌肉接头：利用共聚焦荧光显微镜测量突触大小、碎片化程度及突触蛋白密度的变化

本方案展示了如何利用超分辨率显微镜研究原代神经元培养物中蛋白质的共定位。...

超高分辨率成像研究原代神经元中蛋白质与突触标志物的共定位

准确检测神经肌肉接头组分的能力对于评估病理或发育过程引起的结构改变至关重要。本文详细介绍了一种简便的方法，可用于获取高质量的全装片神经肌肉接头图像，进而进行定量测量。...

单根骨骼肌纤维的分离用于全 mounts 神经肌肉接头的免疫荧光及形态计量分析

本方案描述了通过切断的神经将荧光钙染料加载到小鼠运动神经末梢的方法。此外，还介绍了一种利用共聚焦显微镜记录外周神经末梢快速钙瞬变的独特方法。...

使用共聚焦显微镜以高时间分辨率记录小鼠神经肌肉接头中的钙瞬变

本实验方案介绍了一种利用不同生物标志物（即神经丝蛋白200、囊泡乙酰胆碱转运体、α-银环蛇毒素和S100）进行荧光免疫组织化学染色，以检测大鼠腓肠肌内侧头中突触前末梢、突触后受体及突触周施万细胞之间空间相关性的方法。...

可视化大鼠腓肠肌内侧头中神经肌肉接头的形态学特征

本文介绍了一种用于可视化神经肌肉接头和肌细胞中微管网络的详细方案。结合黑腹果蝇（Drosophila...

使用 果蝇 幼虫神经肌肉接头与肌细胞中微管网络的可视化

学习利用共聚焦和STED超分辨率显微镜对小鼠神经肌肉接头进行定量形态学分析的方法。该方案可精确评估脊髓性肌萎缩症和先天性肌无力综合征模型中的突触结构病理变化。

通过共聚焦与超分辨率显微镜联合技术对小鼠神经肌肉接头进行表征

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