从脂肪组织中获取间充质干细胞及长期冷冻保存后基质血管组分表征的技术

在此，我们展示了获取和保存高质量且具有活性的细胞的方案，可用于治疗性操作，例如多能间充质细胞的输注。该方法的主要优势在于，通过此技术，我们能够在从采集的组织中分离细胞的过程中，获得细胞活性随时间变化的数据。该技术可推广应用于所有需要异源医学和细胞治疗的疾病或病理状态。

该方法还可应用于药物测试等领域的细胞基因组稳定性检测，因为在这些领域可能需要长期培养细胞。操作活细胞时，务必保持冷静和自信。需格外注意无菌操作，并始终以科学家的敏锐观察力警惕任何异常情况，及时做出正确判断和决策。

首先，称量袋子的重量，并使用数字非接触式红外临床体温计测量温度。将袋子置于超净工作台内静置五分钟，使较油腻的层析出并分离出含有细胞的组织。向转移袋中注入 100 毫升含钙的 DPBS，并用手轻轻混匀。

静置五分钟，然后使用连接在袋适配器上的60毫升注射器弃去大部分沉淀的底层液体。重复此步骤两次。

向袋子中加入 100 毫升消化液，在 37 摄氏度下缓慢搅拌孵育 30 分钟。然后将袋子中的全部内容物转移至四个 50 毫升锥形管中，在 22 摄氏度下以 400 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，并向细胞沉淀中加入 5 毫升含 20% 胎牛血清的低糖 DMEM 培养基。

将 10 微升 0.05% 的台盼蓝溶液与 10 微升细胞悬液在蒸馏水中新鲜混合，孵育 5 分钟。使用倒置光学显微镜在 20 倍放大倍数下，于血细胞计数板（Neubauer 细胞计数板）中计数活细胞。将细胞沉淀重悬于冷冻保护液中，细胞浓度为每毫升 100 万个细胞。

然后将1毫升该混合物加入冻存管中。使用冷冻容器，以每分钟1摄氏度的速率降温，于-80摄氏度保存一年。一年后，将其转移至标准冻存盒中，并置于液氮气相中长期保存。

本表展示了九位患者在不同操作步骤中的数据。根据初始细胞得率，确定了各样本的细胞取样体积：细胞得率较高的样本取1毫升，得率中等的样本取1.1毫升，得率较低的样本每份取2毫升。

即使在胰蛋白酶消化前达到相同的汇合度，传代前的细胞得率仍存在较大差异。因此，这些细胞可能以多层方式生长。代表性图像显示了分离后第一代贴壁生长的间充质ADSCs在光学显微镜下的形态。

细胞表现出对塑料的贴壁生长特性以及成纤维细胞样的形态。此处显示了通过台盼蓝染色法在血细胞计数板中计数的活细胞数量。本表展示了来自六位患者的流式细胞术数据。

从这些CD45阴性细胞中，确定了具有不同干细胞标志物组合的ADSC所占的百分比。代表性图像显示了第9号病例在冷冻保存八个月后，SVF中表达干细胞相关标志物的细胞亚群。其中，R1为在前向散射与侧向散射图中分析的全部细胞区域。

R2 为 CD45 阴性区域。该区域内 CD73、CD90 和 CD105 群体呈阳性。此处展示了 ADSC 向软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞的分化。

进行该操作时，请记住缓慢搅拌，最好用手操作，同时在37摄氏度下放置30分钟，以观察粘连和水疱形成情况。保持工作环境温度在25摄氏度左右，避免因温度过高而产生热冲击。我们在此展示的技术可用于成功地从其他组织中分离出多能间充质细胞。