Name: 数字液滴PCR法定量分析小鼠视网膜AAV转导效率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 了解如何使用数字液滴PCR技术定量分析小鼠视网膜中AAV转导效率。本方法涵盖小规模AAV制备、玻璃体腔注射及基因组DNA提取步骤，为基因治疗研究提供高灵敏度的绝对定量方案。

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我们感谢巴塞尔分子与临床眼科学研究所复杂病毒平台的Oezkan Keles、Josephine Jüttner和Botond Roska教授在AAV生产方面提供的帮助与支持。我们还感谢宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Jean Bennett教授提供AAV8/BP2菌株。动物实验在盖布泽技术大学动物实验中心进行，对此我们感谢Leyla Dikmetas和Uygar Halis Tazebay教授在技术协助和动物饲养方面提供的支持。我们还感谢Fatma Ozdemir博士对稿件提出的宝贵意见。本研究得到土耳其科学技术研究理事会（TUBITAK）项目（资助号：118C226 和 121N275）以及萨班哲大学整合项目基金的支持。

所有实验方案均经萨班哲大学伦理委员会批准，并按照“视觉与眼科研究协会”关于实验动物使用的声明进行。
1. 小规模 AAV 制备12
<ol>
	<li>使用15 cm培养板，在10 mL完全DMEM/10% FBS培养基中培养HEK293T细胞，直至细胞融合度达到70-80%。</li>
	<li>在5 mL DMEM中制备转染混合物，其中包含20 µg辅助质粒（pHGT1-Adeno1）、7 µg衣壳质粒、7 µg AAV2-CBA-tdTomato-WPRE载体以及136 µL PEI溶液（1 mg/mL）。</li>
	<li>将5 mL制备好的转染混合物加入含有10 mL培养基的细胞培养皿中，将转染后的细胞在37 °C下孵育48-60小时。</li>
	<li>在转染后48-60小时收集培养上清，加入DNase I至终浓度为250 U/mL，在37 °C下消化30分钟。</li>
	<li>将消化后的上清在4000 × g、4 °C条件下离心30分钟，随后用0.22 µm针头滤器过滤，并收集至预先润湿的100 kDa再生纤维素膜中。</li>
	<li>将再生纤维素膜在4000 × g、4 °C条件下离心30分钟，弃去滤过液。</li>
	<li>用含0.001% Pluronic F-68的PBS洗涤再生纤维素膜，并在4000 × g、4 °C条件下离心30分钟，重复洗涤离心三次，每次均弃去PBS。</li>
	<li>从再生纤维素膜的上层收集浓缩的AAV，并分装用于后续使用。</li>
	<li>取5 µL新制备的AAV，加入DNase I（0.2 U/µL）在37 °C下消化15分钟用于滴度测定；随后在95 °C孵育10分钟，以同时灭活DNase I并降解病毒衣壳。</li>
	<li>使用含0.05% Pluronic F-68的缓冲液对消化后的AAV进行10倍系列稀释。采用AAV2-ITR和WPRE引物进行滴定（表1）。滴度通过将dd-PCR结果乘以稀释倍数计算得出，结果转换为基因组拷贝数/mL（GC/mL）。 
	注意：小规模AAV制备的浓度通常约为1 × 1012 GC/mL。本方案不适用于像AAV213这类不能有效将AAV释放到培养上清中的血清型。</li>
</ol>
2. AAV 的玻璃体内注射
<ol>
	<li>设备准备
	<ol>
		<li>开始前，准备一支带有36 G钝针头的10 µL微量注射器。用70%乙醇冲洗五次，再用ddH2O冲洗五次，最后用PBS冲洗五次。</li>
		<li>根据每次注射所需，将适量的AAV装入微量注射器中。</li>
		<li>准备好手术针（缝线，丝线，6/0）、胶带、镊子和剪刀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>玻璃体内注射
	<ol>
		<li>在麻醉前，向每只眼睛滴加1滴含0.5%托吡卡胺和2.5%盐酸去氧肾上腺素（例如Mydfrin）的眼药水，以扩大瞳孔。</li>
		<li>使用5%异氟烷（1 L/min）对小鼠进行麻醉诱导，并在操作过程中维持1.5%异氟烷（1 L/min）。初次诱导时使用小型异氟烷麻醉舱。</li>
		<li>通过翻正反射消失、回缩反射消失以及尾部夹捏反应来确认麻醉深度。</li>
		<li>在注射操作前，向每只眼睛施用0.3%妥布霉素和0.1%地塞米松无菌眼用溶液。滴眼液可防止角膜干燥，并发挥抗炎和抗菌作用。</li>
		<li>使用手术钩固定上眼睑，轻轻向后牵拉以暴露眼球背侧部分。用胶带将钩子固定在实验台上以保持其位置稳定。</li>
		<li>在解剖显微镜下，使用弯头虹膜剪剪除结膜（面积小于1 mm2），暴露巩膜。使用新的无菌胰岛素注射器（30 G）穿刺巩膜。</li>
		<li>通过显微操作仪将微量注射器的针头经同一穿刺点插入，将针尖置于晶状体后方、眼杯中央位置。</li>
		<li>缓慢向玻璃体腔内注射1 µL AAV2/BP2 和 AAV2/PHP.S 载体，其浓度分别为1.63 x 1012 GC/mL 和 1.7 x 1012 GC/mL。注射体积由手动控制。注射后留针1分钟，然后缓慢拔出针头。</li>
		<li>松开眼睑，并在眼杯上涂抹含有0.3%妥布霉素和0.1%地塞米松的抗炎抗菌外用凝胶。在随后几天内根据评分表监测和评估小鼠状况，评估指标包括外观（眼睛明亮、毛发整洁、弓背）、行为（活动能力、不动、自残）和体重，评分范围为0至3分。每项条件评分为0–3分，总分达到或超过3分即为终止实验的标准。</li>
		<li>待动物恢复后，将其放回笼中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 荧光与眼底成像
<ol>
	<li>通过向每只眼睛滴加0.5%托吡卡胺和2.5%盐酸去氧肾上腺素滴眼液，使小鼠瞳孔散大。</li>
	<li>使用异氟烷按上述方法对动物进行麻醉，并通过轻捏足爪仔细评估麻醉深度。</li>
	<li>将小鼠放置于成像台上，通过眼底相机检查确认瞳孔充分散大。在眼睛表面涂抹局部凝胶（0.2%卡波姆980），以防止麻醉期间角膜脱水，并作为成像时的耦合介质。</li>
	<li>调整成像台位置，使其与物镜的接头对齐。根据需要调节成像台，使小鼠眼睛位于中心位置。当眼睛居中后，缓慢移动物镜直至其与眼睛接触。</li>
	<li>在玻璃体内注射后1周和2周，对双眼进行眼底成像和荧光成像，以追踪tdTomato的表达情况（图3B）14。采用相同的成像参数获取眼底和荧光图像，以便比较报告基因的表达水平。</li>
</ol>
4. 视网膜分离
<ol>
	<li>在2周时间点完成眼底和荧光成像后，通过吸入CO2处死动物以收集视网膜。</li>
	<li>使用13.5 cm分离镊将眼球向前移动。</li>
	<li>用镊子轻轻施压，移除晶状体及残留的玻璃体。</li>
	<li>用精密弯头镊切断眼球与视神经的连接，并用同一把弯头镊轻轻挤压视网膜。</li>
	<li>将分离的视网膜转移至微量离心管中。</li>
	<li>将离心管放入液氮中，快速冷冻视网膜。</li>
</ol>
5. 组织基因组DNA提取
<ol>
	<li>使用市售的基于蛋白酶K消化的组织基因组DNA试剂盒提取基因组DNA。</li>
	<li>在55 °C、200 × g 条件下，用试剂盒中提供的蛋白酶K消化视网膜组织30分钟。</li>
	<li>按照制造商说明书进行RNase孵育、洗涤缓冲液I和II的洗涤步骤，最后进行洗脱步骤。</li>
	<li>最后一次洗涤后增加一次离心步骤，以去除残留的乙醇。</li>
	<li>测定基因组DNA浓度，并将样品储存在-20 °C。</li>
</ol>
6. 采用微滴数字PCR分析小鼠视网膜样本以定量病毒基因组
<ol>
	<li>将注射后视网膜的基因组DNA用0.05% Pluronic F-68溶液稀释，使每个样本的最终浓度达到1 ng/µL。</li>
	<li>分别对WPRE和18S进行独立反应，使用靶标特异性引物，每种引物的终浓度为125 nM。</li>
	<li>在20 µL的PCR反应体系中进行微滴生成，反应体系包含1 ng基因组DNA、125 nM引物和2× evagreen supermix。</li>
	<li>将样本混合液加载至微滴生成芯片的中部区域。</li>
	<li>完成样本加载后，向芯片底部一行加入70 µL微滴生成油。</li>
	<li>将垫圈置于芯片上方，并放入微滴生成仪中，确保垫圈与芯片之间无间隙。</li>
	<li>轻柔吸取顶部孔中生成的约40 µL微滴，将微滴溶液加入半裙边96孔PCR反应板中。</li>
	<li>使用铝箔封口膜密封PCR板。</li>
	<li>将PCR板放入96孔热封式PCR仪中，采用以下PCR程序：95 °C预变性5 min，随后进行40个循环（95 °C变性30 s，60 °C退火1 min），最后4 °C保持5 min，90 °C延伸5 min，再于4 °C无限期保存。每个循环的升温速率为2 °C/s，以确保微滴在每个步骤中达到准确温度。</li>
	<li>将PCR板放入微滴读取仪中，使用dd-PCR软件对微滴进行定量分析。根据evagreen的特定设置建立分析模板。</li>
	<li>使用一维图（荧光强度 vs 微滴数量）对每个样本的数据进行分析。设定阈值，使高于阈值的微滴判为阳性，低于阈值的判为阴性。随后应用泊松算法计算目标DNA的初始浓度（单位：copies/µL）。通过计算WPRE与18S的比值，评估AAV转导效率。</li>
</ol>

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<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们构建了两种具有不同衣壳蛋白的AAV载体，并分别对其进行了滴定。该方案最关键的步骤之一是生产出足够量的AAV，以确保转导后能够检测到报告基因的表达12,13。
AAV滴定也是调整玻璃体内注射AAV剂量的重要因素。一旦满足这些关键条件，即可采用数字滴定PCR（dd-PCR）方法对AAV的转导效率进行定量分析。
许多实验室正在使用定量PCR（qPCR）方法对AAV进行滴度测定。基于qPCR的绝对定量方法需要一条标准曲线，该曲线包含已知数量目标DNA的不同稀释浓度样品18。然而，数字滴定PCR（dd-PCR）无需标准曲线，因为它通过检测含有至少一个拷贝目标DNA的阳性液滴，直接定量给定样品中目标分子的总数。由于dd-PCR是一种终点分析，且不需要标准曲线，因此在qPCR反应中可能出现的效率问题（例如低效PCR或标准曲线质量不佳）在dd-PCR中影响较小...

腺相关病毒（AAVs）目前已被广泛用于多种视网膜基因治疗研究。AAVs 提供了一种安全且高效的基因递送方式，具有较低的免疫原性和较少的基因组整合风险。AAV 进入靶细胞的过程通过内吞作用实现，该过程需要病毒与细胞表面的受体和共受体结合1,2。因此，AAV 对不同类型细胞的转导效率主要取决于其衣壳以及与宿主细胞受体的相互作用。AAV 具有不同的血清型，每种血清型可能表现出独特的细胞/组织嗜性及转导效率。此外，还可通过病毒衣壳的化学修饰、杂合衣壳的构建、肽段插入、衣壳重排、定向进化以及合理诱变等方法，人工构建 AAV 血清型和变异体3。即使衣壳的氨基酸序列或结构发生微小改变，也可能影响其与宿主细胞因子的相互作用，从而导致嗜性发生变化4。除了衣壳变异体外，注射途径以及 AAV 生产过程中的批次间差异等因素也会影响 AAV 在神经视网膜中的转导效率。因此，建立可靠的比较不同变异体转导效率的方法十分必要。
目前大多数测定腺相关病毒（AAV）转导效率的方法依赖于报告基因的表达，包括荧光成像、免疫组织化学、蛋白质印迹或对报告基因产物进行组织化学分析5,6,7。然而，由于AAV载体存在容量限制，并不总是能够容纳报告基因以监测转导效率。使用强启动子元件（如杂合的巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子）或土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）作为mRNA稳定序列，进一步加剧了载体容量的问题8。因此，采用更直接的方法来确定注射后AAV的转导率将具有重要意义。
数字滴定聚合酶链式反应（dd-PCR）是一种从极微量样本中定量目标DNA的强大技术。dd-PCR技术依赖于将目标DNA和PCR反应混合物包裹在油滴中。每次dd-PCR反应包含数千个液滴，每个液滴均作为一个独立的PCR反应进行处理和分析9。通过对液滴的分析，可直接利用泊松算法计算出任何样本中目标DNA分子的绝对拷贝数。由于AAV的转导效率与其在神经视网膜中基因组的拷贝数相关，因此我们采用dd-PCR方法来定量AAV基因组。
本文介绍一种基于数字滴定聚合酶链式反应（dd-PCR）的方法，用于从视网膜基因组DNA中计算腺相关病毒（AAV）载体的转导效率6,10。首先，采用小规模制备方案生成表达tdTomato报告基因的AAV，并通过dd-PCR方法测定其滴度11。随后，将AAV通过玻璃体内注射导入神经视网膜。为评估转导效率，我们首先使用荧光显微镜结合ImageJ软件对tdTomato的表达水平进行定量分析。接着，提取基因组DNA，并利用dd-PCR对注射后视网膜中的AAV基因组进行定量。将tdTomato表达水平与dd-PCR定量得到的转导AAV基因组数量进行比较，结果表明dd-PCR方法能够准确量化AAV载体的转导效率。本研究提供的实验方案详细描述了基于dd-PCR技术定量AAV转导效率的方法。此外，该方案还展示了如何通过基因组DNA提取后的稀释倍数及dd-PCR结果，直接计算玻璃体内注射后被转导的AAV基因组的绝对数量。总体而言，该方法提供了一种强有力的替代方案，可用于替代报告基因表达分析，以定量评估AAV载体在视网膜中的转导效率。

<table><tbody><tr><td>96孔半裙边ddPCR板</td><td>BioRad</td><td>12001925</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>Amicon滤器</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>AAV</td></tr><tr><td>C1000 TOUCH 96深孔PCR仪</td><td>BioRad</td><td>1851197</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>C57BL/6JRj小鼠品系</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6JRj</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>DG8密封垫</td><td>BioRad</td><td>1863009</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>DG8微流控芯片</td><td>BioRad</td><td>1864008</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>Lonza</td><td>BE12-604Q</td><td>AAV</td></tr><tr><td>DPBS缓冲液</td><td>PAN BIOTECH</td><td>L 1825</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Droplet generation oil eva green</td><td>BioRad</td><td>1864006</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>Droplet reader oil</td><td>BioRad</td><td>1863004</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>FBS胎牛血清</td><td>PAN BIOTECH</td><td>p30-3306</td><td>AAV</td></tr><tr><td>PX1 PCR板封膜机用铝箔封膜</td><td>BioRad</td><td>1814040</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD Medical</td><td>320933</td><td>玻璃体内注射</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET</td><td>N01AB06</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>微量注射器MM33</td><td>World Precision Instruments</td><td>82-42-101-0000</td><td>玻璃体内注射</td></tr><tr><td>Micron IV</td><td>Phoenix Research Labs</td><td>Micron IV</td><td>基于3-CCD彩色相机、图像采集卡和现成软件的显微成像系统，可实现小鼠视网膜成像。</td></tr><tr><td>美多丽（2.5%盐酸去氧肾上腺素）</td><td>Alcon</td><td>S01FB01</td><td>瞳孔扩张</td></tr><tr><td>Nanofil微量注射器 10 &amp;mu;l</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL</td><td>玻璃体内注射</td></tr><tr><td>针头 RN G36，25 mm，PST 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF36BL-2</td><td>玻璃体内注射</td></tr><tr><td>PEI-MAX</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>AAV</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素双抗</td><td>PAN BIOTECH</td><td>P06-07100</td><td>AAV</td></tr><tr><td>质粒pHGT1-Adeno1</td><td>PlasmidFactory</td><td>PF1236</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Pluronic F-68</td><td>Gibco</td><td>24040032</td><td>AAV</td></tr><tr><td>PX1 PCR板封膜系统</td><td>BioRad</td><td>1814000</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>BioRad</td><td>1864034</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX200微滴读取仪/QX200微滴生成仪</td><td>BioRad</td><td>1864001</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>SPLITTER FORCEP WATCHER&lt;br/&gt; MAKER - 长度 = 13.5 cm</td><td>endostall medical</td><td>EJN-160-0155</td><td>视网膜分离</td></tr><tr><td>无菌注射器滤器</td><td>AISIMO</td><td>ASF33PS22S</td><td>AAV</td></tr><tr><td>组织基因组DNA提取试剂盒</td><td>EcoSpin</td><td>E1070</td><td>基因组DNA提取</td></tr><tr><td>托百士（0.3%妥布霉素 / 0.1%地塞米松）</td><td>Alcon</td><td>S01CA01</td><td>抗炎/抗生素</td></tr><tr><td>托吡卡胺（0.5%）</td><td>Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.</td><td>S01FA06</td><td>瞳孔扩张</td></tr><tr><td>Turbonuclease</td><td>Accelagen</td><td>N0103L</td><td>AAV</td></tr><tr><td>维速达（卡波姆 2 mg/g）</td><td>Bausch+Lomb</td><td>S01XA20</td><td>润滑型滴眼液</td></tr></tbody></table>

数字滴定pcr法用于定量小鼠视网膜中aav转导效率

Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

目前，许多视网膜细胞生物学实验室已常规使用腺相关病毒（AAV）进行基因编辑和调控应用。AAV转导效率通常至关重要，直接影响整体实验结果。决定转导效率的主要因素之一是AAV载体的血清型或变体。目前已有多种人工构建的AAV血清型和变体，它们对宿主细胞表面受体具有不同的亲和力。在视网膜基因治疗中，这导致不同视网膜细胞类型的转导效率存在差异。此外，注射途径以及AAV制备的质量也可能影响视网膜中AAV的转导效率。因此，比较不同变体、批次和方法的转导效率十分必要。数字滴定PCR（dd-PCR）方法能够高精度地定量核酸，且无需标准品或参照物即可实现对特定目标的绝对定量。利用dd-PCR，还可通过绝对定量注射后视网膜内AAV基因组拷贝数来评估AAV的转导效率。本文提供了一种利用dd-PCR定量AAV在视网膜细胞中转导率的简便方法。经过少量修改后，该方法也可用于线粒体DNA拷贝数的定量，以及评估碱基编辑效率，这对于多种视网膜疾病及基因治疗应用具有重要意义。

小规模AAV生产是一种快速高效的方法，可为玻璃体内注射提供载体（图1）。小规模AAV生产通常可获得约1 × 1012 GC/mL的滴度，足以在视网膜中检测到报告基因的表达（图2）。使用数字滴定PCR（dd-PCR）进行AAV滴度测定可获得一致的结果。常规使用ITR2和WPRE特异性引物，通过dd-PCR软件将目标分子的起始浓度建模为泊松分布进行计算。最终通过乘以稀释倍数并换算为每毫升基因组拷贝数（GC/mL）完成计算。本方案所制备的AAV2/BP2和AAV2/PHP.S的滴度分别为1.63 × 1012 GC/mL和1.7 × 1012 GC/mL7,15。作为对照，两种血清型使用了相同的tdTomato表达载体。我们注射了大致相等滴度的AAV，以量化AAV的转导效率。在注射上述浓度的AAV 1 µL后，分别于1周和2周时间点对动物进行成...

本方案介绍了如何结合数字滴定PCR（dd-PCR）、小规模AAV制备、玻璃体内注射、视网膜成像及视网膜基因组DNA提取，定量小鼠视网膜中AAV的转导效率。

数字滴定PCR法用于定量小鼠视网膜中AAV转导效率

许多视网膜细胞生物学实验室目前常规使用腺相关病毒（AAVs）进行基因编辑和调控应用。其效率的……

在本视频中，我们将展示如何使用数字滴定PCR方法定量小鼠视网膜中的AAV转导效率。该方法极为灵敏，可对目标DNA进行绝对定量。我们开发此方法主要用于较大的AAV载体，这类载体无法容纳报告基因，例如基于CRISPR的构建体。通过使用该方法，我们可以直接定量AAV在视网膜中的转导率。该方法依赖于数字滴定PCR的高灵敏度和绝对定量能力，可获得直接明确的结果。在本视频中，我们将展示如何利用数字滴定PCR方法定量小鼠视网膜中AAV的转导效率，该方法具有极高的灵敏度，并能对目标DNA进行绝对定量。我们开发该方法主要用于那些无法使用报告基因（如基于CRISPR的构建体）的大片段载体。通过使用该方法，我们可以简单地量化 AAV 在视网膜中的转导效率。该方法依赖于双液滴 PCR 的高灵敏度和绝对定量能力，可获得直观明确的结果。由于数字液滴 PCR 技术的高效性，已有多个实验室从定量实时 PCR 转向数字液滴 PCR 或 AAV 滴度测定。该方法还可为视网膜中线粒体DNA的定量提供基础，并可用于检测基于CRISPR的基因治疗在小鼠视网膜中突变校正的效率。用AAV辅助质粒、AAV衣壳质粒、AAV载体和PI溶液在5 mL中制备转染混合物。将5 mL制备好的转染混合物加入培养基中。将转染后的细胞在37摄氏度下孵育。在转染后48至60小时收集培养基。用DNase以终浓度250单位/毫升在37摄氏度下消化培养基30分钟，然后在4摄氏度下以4,000 ×g离心30分钟。用 PBS 预润湿再生纤维素膜。使用 0.22 微米注射器滤器将培养基过滤至预润湿的再生纤维素膜中，截留分子量为 100 千道尔顿。在 4,000 ×g、4 °C 条件下离心再生纤维素膜 30 分钟，弃去滤液。用含有0.001% Pluronic F68的PBS洗涤再生纤维素膜，并在4°C、4000 G条件下离心30分钟，重复三次。从再生纤维素膜的上层收集浓缩的AAV，用于后续实验。此处展示了如何进行小规模AAV的制备。在验证本方案后，您应能够制备出足以在视网膜中观察到报告基因表达的 AAV。您还可以遵循数字 PCR 方案，以对所制备的 AAV 进行滴度测定。在麻醉前，使用含有 0.5% 托吡卡胺和 2.5% 盐酸去氧肾上腺素的眼药水滴一滴，以散大瞳孔。使用异氟烷麻醉小鼠并验证反射。注射前在每只眼睛中滴加0.3%妥布霉素和0.1%地塞米松无菌眼用溶液。使用手术钩固定上眼睑。轻轻向后牵拉以暴露眼部的背侧。将钩子固定在绷带上以保持其位置。使用弯头虹膜剪除去结膜，暴露眼球的巩膜。使用新的无菌30G胰岛素注射器穿刺巩膜。通过显微操作仪将微量注射器的针头经同一穿刺点插入。将针头尖端置于眼杯中央晶状体后方。将一微升 AAV 溶液缓慢注射至眼内玻璃体中。留针一分钟，然后缓慢拔出针头。在眼杯中涂抹含有 0.3% 妥布霉素和 0.1% 地塞米松的抗炎及抗菌外用凝胶。在麻醉前滴一滴含0.5%托吡卡胺和2.5%盐酸去氧肾上腺素的眼药水以散大瞳孔。将每克含2毫克卡波姆的局部凝胶涂抹于眼部表面。根据需要调整小鼠支架，使小鼠眼睛居中。在玻璃体内注射后一周和两周，对双眼进行眼底及荧光成像，以监测TdTomato表达。在操作前，采用二氧化碳吸入法处死动物。使用13.5厘米的分离镊将眼球向前移动。移除晶状体及残留的玻璃体。用精密弯镊切断眼球与视神经的连接，并用同一把弯镊轻轻挤压视网膜。使用商业化蛋白酶K消化膜法组织基因组DNA试剂盒提取基因组DNA。在55摄氏度、200 G条件下，用蛋白酶K消化视网膜30分钟。彻底裂解视网膜，并按照制造商的说明书进行操作。在这些方案中，我们展示了玻璃体内注射、眼底荧光成像，以及视网膜和基因组DNA的提取。这些是视网膜研究中的关键步骤，通过遵循本方案，您应能够注射所制备的腺相关病毒（AAV），并追踪其表达情况。同时可通过定量视网膜基因组DNA中的AAV基因组来评估转导效率。在此，您可以看到数字滴定PCR的基本应用，即对转导至视网膜细胞中的AAV基因组进行绝对定量。将注射后视网膜的基因组DNA用0.05% Pluronic F-68溶液稀释，使每个样本的终浓度达到每微升1纳克。在20微升PCR反应体系中进行液滴生成，反应体系包括1纳克基因组DNA、125纳摩尔引物和2× Evergreen Super Mix。将样本混合液加载至微流控芯片的中部区域，用于生成液滴。随后将 70 微升的液滴生成油加入芯片的底排。将垫圈置于芯片上方，确保垫圈与芯片之间无间隙。然后将其放入液滴生成器中。轻轻吸取顶部钟形区域生成的大约40微升液滴，将液滴溶液加入半裙边96孔PCR反应板中。使用铝箔封膜将PCR板用PCR板封膜仪密封。将PCR板放入96孔热封循环仪中。采用本文所述的ddPCR实验方案。将PCR板放入液滴读取仪中以分析数据。观看本视频后，您应能够掌握基本的数字PCR技术。您还可以使用含有少量材料的细胞，这非常适合数字PCR技术。然而，您应仔细调整目标 DNA 的量，以确保不超过数字滴定 PCR 的检测上限。以下是实验流程图。我们进行了小规模 AAV 制备，随后进行 AAV 滴度测定。然后进行玻璃体内注射。之后，通过眼底荧光成像定量分析荧光强度。随后分离小鼠视网膜，并从视网膜组织中提取基因组DNA用于微滴数字PCR（ddPCR）。滴定 AAV 对于准确量化 AAV 转导也至关重要。ddPCR 依赖于生成含有稀释后目标 AAV 基因组的液滴。代表性 ddPCR 结果显示了针对 AAV 基因组的阳性与阴性液滴。高于阈值为阳性，低于阈值为阴性。乘以稀释倍数后，发现腺相关病毒（AAV）的滴度为每毫升10的12次方基因组拷贝。为了准确量化AAV的转导效率，注射了多个视网膜。对注射后的动物进行成像，并计算荧光平均强度。在两周时间点，分离视网膜组织，并使用WPRE和18S引物进行数字滴定PCR（ddPCR）检测。AAV 注射视网膜的荧光强度与 AAV 基因组定量结果呈正相关，显示出该方法的优越性。在此，我们展示了多种技术，包括小规模 AAV 制备及玻璃体内注射。

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数字液滴PCR法定量分析小鼠视网膜AAV转导效率

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一种用于腺相关病毒滴定的定量点印迹检测方法及其在腺相关病毒组装激活蛋白功能评估中的应用

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一种可验证的微滴数字聚合酶链式反应检测方法用于腺相关病毒载体在泪液生物脱落研究中的检测

本文详细介绍了一种优化的小鼠侧尾静脉注射方案，用于在成年小鼠中系统性给予腺相关病毒（AAV）。此外，我们还描述了常用的检测方法，以评估AAV的转导效率。...

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体内 电穿孔转染发育中小鼠视网膜

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数字滴定PCR法用于定量小鼠视网膜中AAV转导效率

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