Name: 使用细胞外通量分析仪评估小鼠造血干细胞和原始祖细胞中的细胞生物能量学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学习使用细胞外通量分析仪评估小鼠造血干细胞和原始祖细胞的细胞生物能量学。该方法可实时测量ECAR和OCR，揭示代谢功能，适用于高通量筛选。

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Lombard实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）（NIGMS R01GM101171，NIEHS R21ES032305）、美国国防部（DoD）（CA190267、CA170628、NF170044和ME200030）以及格伦医学研究基金会的支持。李实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）（NHLBI 5R01HL150707）的支持。

所有脊椎动物实验均经密歇根大学动物使用与护理委员会批准，并依照该委员会的法规进行。
1. 检测前一天（总时间：约10分钟）
<ol>
	<li>传感器盒的水合（步骤时间：约10分钟）
	<ol>
		<li>打开细胞外通量检测试剂盒，取出传感器盒和辅助板组件。将加样导板平放保存，供次日使用。</li>
		<li>手动将传感器盒（带盖的上部绿色部分）与辅助板（下方的96孔微孔板）分离，并将其倒置放置在辅助板旁边。</li>
		<li>使用多通道移液器，向辅助板的每个孔中加入200 µL通量检测试剂盒中附带的校准液。</li>
		<li>将传感器盒重新放回辅助板上，确保传感器完全浸没在校准液中。</li>
		<li>将装有校准液的传感器盒与辅助板组件放入无CO2、37 °C的培养箱中过夜。为防止校准液蒸发，需确保培养箱内湿度充足。若使用普通恒温培养箱进行无CO2、37 °C孵育，应在培养箱内放置一个盛有水的敞口烧杯以增加湿度。如有条件，建议使用XF预处理工作站完成所有无CO2、37 °C的孵育步骤。 
		&#8203;注意：也可选择在无CO2、37 °C培养箱中，用无菌超纯水每孔200 µL对传感器盒过夜水合。在检测当天，至少在加载注射孔前45–60分钟，将水更换为每孔200 µL、预热至37 °C的校准液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 检测当天（总时间：约9小时30分钟）
注意：上述总时间包括步骤 2.1 至 2.4 的累计耗时，以及步骤 2.5 或步骤 2.6 之一的时间。
<ol>
	<li>细胞粘附包被微孔板的制备（步骤耗时：约1小时30分钟） 
	注意：所有步骤均须在生物安全柜中进行。
	<ol>
		<li>制备2.5 mL细胞黏附溶液（22.4 µg/mL，参见步骤） 材料表每96孔细胞培养微孔板，将56 µg细胞粘附剂溶于适量经滤膜除菌的0.1 M碳酸氢钠（pH 8.0）中，立即加入相当于细胞粘附剂储备液体积一半的1 N氢氧化钠。涡旋振荡或反复吹打混匀。</li>
		<li>打开通量测定试剂盒中附带的96孔细胞培养微孔板，在每孔底部加入25 µL配制好的细胞黏附溶液。用盖子盖好微孔板，置于生物安全柜内室温孵育30分钟。</li>
		<li>孵育后，使用多通道移液器或抽吸装置移除并弃去多余的细胞黏附溶液，每孔用 200 µL 无菌超纯水洗涤两次。将平板置于生物安全柜中，敞盖空气干燥 30–45 分钟。 
		注意：细胞黏附涂层细胞培养微孔板可在 4 °C 下保存最长一周。4 °C 保存的预包被微孔板在接种细胞前，必须在生物安全柜内恢复至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测培养基的制备（步骤耗时：约30分钟）
	<ol>
		<li>糖酵解压力测试分析培养基的制备
		<ol>
			<li>补充100 mL基础培养基（参见 材料表用1 mL 200 mM L-谷氨酰胺重悬。 
			&#8203;注意：检测培养基中 L-谷氨酰胺的最终浓度为 2 mM。</li>
			<li>将添加了L-谷氨酰胺的培养基在水浴中预热至37 °C。</li>
			<li>用 1 N NaOH 将温热的培养基 pH 值调节至 7.4。</li>
			<li>使用0.2 µm滤器对培养基进行过滤除菌，并在使用前保持于37 °C。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>线粒体应激测试培养基的制备
		<ol>
			<li>在100 mL基础培养基中加入0.45 g葡萄糖、1 mL 200 mM L-谷氨酰胺和1 mL 100 mM丙酮酸钠。 
			注意：最终检测培养基含有 25 mM 葡萄糖、2 mM L-谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸钠。</li>
			<li>将添加了葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的培养基在水浴中预热至 37 °C。</li>
			<li>用 1 N NaOH 将温热的培养基 pH 值调节至 7.4。</li>
			<li>使用0.2 µm滤器对培养基进行过滤除菌，并在使用前保持37 °C。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收获小鼠谱系阴性造血干细胞/祖细胞（操作时间：约3小时）
	<ol>
		<li>通过在Hank's平衡盐溶液中添加4%胎牛血清来制备检测缓冲液。用无菌蒸馏水将5x浓缩储备液稀释至1x，制备富集缓冲液。两种缓冲液在使用前均需置于冰上保存。</li>
		<li>使用 CO 对小鼠实施人道安乐死2 随后进行颈椎脱位，用剪刀取下后肢。仔细剥离骨骼上的所有组织，用剪刀剪去股骨和胫骨两端。使用检测缓冲液冲洗股骨和胫骨中的骨髓细胞。将冲洗出的细胞通过无菌70 µm滤膜过滤，滤液于200 × g 4 °C 下离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>通过在500 µL ACK缓冲液（150 mM NH₄Cl，10 mM KHCO₃，0.1 mM Na₂EDTA，pH 7.2–7.4）中重悬细胞沉淀来裂解红细胞4Cl, 10 mM KHCO₃3，0.1 mM EDTA，pH 7.2）。冰上裂解1分钟后，加入1 mL测定缓冲液洗涤样品，200 × g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
		<li>洗涤后，在冰上用500 µL检测缓冲液，将样品与针对CD2（1:200稀释）、CD3（1:200稀释）、CD5（1:200稀释）、CD8（1:200稀释）、Ter-119（1:200稀释）、B220（1:200稀释）和Gr-1（1:800稀释）的生物素标记抗体混合物共同孵育45分钟。</li>
		<li>用1 mL检测缓冲液重悬样本，并按上述方法进行离心洗涤。</li>
		<li>用1 mL 1×富集缓冲液重悬样本，并按照上述方法进行离心洗涤。</li>
		<li>将样品与20 µL链霉亲和素纳米磁珠和100 µL 1x富集缓冲液在冰上孵育15分钟。</li>
		<li>用1 mL 1×富集缓冲液重悬样本，并按照上述方法进行离心洗涤。</li>
		<li>将样品重悬于2.5 mL 1×富集缓冲液中。置于分离磁铁上静置5分钟。分别收集上清液至15 mL锥形管中。</li>
		<li>将磁力分离后的样品用额外的2.5 mL 1×富集缓冲液重悬，再次置于分离磁铁上静置5分钟。收集上清液，并与步骤2.3.9中15 mL锥形管内的先前收集物合并。 
		注意：上清液中含有谱系阴性细胞组分。</li>
		<li>将含有阴性选择细胞的15 mL锥形管在200 × g下离心5分钟 g 在 4 °C 下。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于1 mL检测缓冲液中，使用台盼蓝手动计数，或通过自动细胞计数仪（如Countess 3）进行细胞计数。 
		注意：采用上述方法，可获得约 6 × 106 从单只小鼠的后肢可轻松纯化出谱系阴性造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。若在实验前一天准备好试剂（如检测缓冲液、1×富集缓冲液及谱系特异性抗体混合物），则从4只小鼠中富集HSPCs约需2.5–3小时。每增加一只小鼠，额外需要10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在细胞粘附涂层微孔板中接种细胞（步骤耗时：约1小时）
	<ol>
		<li>离心步骤 2.3.12 中的细胞，200 × g 室温下孵育5分钟。</li>
		<li>移去上清液，并将细胞沉淀重悬于适当的检测培养基中（糖酵解应激测试培养基或线粒体应激测试培养基）。在200 × g 室温下孵育5分钟。</li>
		<li>重复步骤 2.4.2。弃去上清液，并将细胞重悬于适量预热的检测培养基中，调整细胞浓度至 2.5 × 105 每 50 µL 细胞数或 5 × 106 每毫升</li>
		<li>沿室温下的细胞黏附包被96孔细胞培养微孔板每孔侧壁加入50 µL细胞悬液。向角落的背景测量孔中加入50 µL检测培养基。使用多通道移液器进行细胞接种，以确保一致性。</li>
		<li>通过向未包被的96孔细胞培养微孔板的每个孔中加入50 µL水，制备离心平衡板。</li>
		<li>将培养板中的细胞在 200 × g 室温下离心1分钟。不要使用刹车。将培养板转移至非CO₂培养箱2 37 °C 培养箱中孵育 25–30 分钟，以确保细胞完全贴壁。在显微镜下观察，确认细胞已稳定黏附于微孔板表面。 
		注意：由于约6 × 106 阴性谱系的造血干细胞/祖细胞（HSPCs）可从单只小鼠的后肢获取，从4只小鼠分离的HSPCs（约2.4 × 107 细胞&#160;若目标是筛选多种干预措施，则需要填充整个96孔板 离体 同时进行。然而，如果目的是研究基因改变或干预措施对HSPC代谢参数的影响 体内随后，可使用单个孔板平行分析来自多对对照组和实验组小鼠的HSPC，并进行多次技术重复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用细胞外通量分析仪进行糖酵解压力测试（步骤耗时：约3小时30分钟）
	<ol>
		<li>加载传感器 cartridge 并注入化合物
		<ol>
			<li>在预热的糖酵解压力测试培养基（pH 7.4）中配制 100 mM 葡萄糖、20 µM 寡霉素和 500 mM 2-DG 溶液。 
			注意：所有注射用化合物溶液均配制为10倍浓度。终孔浓度分别为葡萄糖10 mM、寡霉素2 µM、2-DG 50 mM（参见 表1).</li>
			<li>从非 CO₂ 培养箱中取出已水合的传感器 cartridge2 37 °C 培养箱（来自步骤 1.1.5）。通过将传感器盒从校准液中取出，再放回含校准液的同一工具板中，以去除工具板校准液中的气泡。</li>
			<li>将细胞外通量分析试剂盒中附带的A/D加样导板平放在传感器板上，调整方向使字母“A”位于左上角，以确保仅A孔可供加样。使用多通道移液器向A孔中加入20 µL 100 mM葡萄糖溶液。</li>
			<li>更换A/D加样导板为B/C加样导板，调整方向使字母“B”位于左上角，以确保仅B孔可用于加样。使用多通道移液器，向B孔中加入22 µL的20 µM寡霉素溶液。</li>
			<li>重新调整B/C加样导板的平面方向，使左上角标有字母“C”的位置对应加样孔C。使用多通道移液器，向C孔中加入25 µL的500 mM 2-DG溶液。</li>
			<li>移除并丢弃上样导板。 
			注意：包括背景孔在内的所有96个孔的每一系列端口，必须完全加载相同体积的注射化合物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>模板制作、校准与测量
		<ol>
			<li>在控制器上创建或加载糖酵解压力测试模板。输入有关注射策略、处理条件和细胞类型的详细信息，然后按下 生成组别. 前往 平板图 并将各孔分配给待分析的各个组。将4个角落的孔用于背景测量。</li>
			<li>在 实验方案，确保 校准 和 平衡 在……中进行检查 初始化 步骤。</li>
			<li>用于基础测量以及每次注射（葡萄糖、寡霉素和2-DG）后的测量，设置测量次数 测量循环 到 3 和 混合 - 等待 - 测量时间 到 3 分钟 - 0 分钟 - 3 分钟&#160;（参见 表 2).</li>
			<li>从已加载化合物并水化的传感器 cartridge 中移除盖子，该 cartridge 浸没在 utility plate 的校准液中。将其放置于细胞外通量分析仪的工作托盘上，并开始运行。 
			注意：第一步是校准，通常需要约 20 分钟。</li>
			<li>从非CO₂培养箱中取出含有细胞的微孔板2 37 °C 培养箱中孵育 25–30 分钟后，从步骤 2.4.6 中取出。在不扰动细胞的情况下，每孔缓慢加入 130 µL 预热的糖酵解应激测试检测试剂（pH 7.4），使每孔的培养基总体积达到 180 µL，并将培养板放回无 CO₂2 37 °C 培养箱中继续孵育 15–20 分钟。 
			注意：离心后建议总孵育时间为45–60分钟。</li>
			<li>校准结束后，将工具板替换为含有细胞的检测微孔板（不带盖）。按下 细胞培养板上样&#160;开始测量，完成该检测约需1.5小时。</li>
			<li>测量结束后，收集含有细胞的检测微孔板，在不扰动细胞的情况下移除检测培养基。用250 µL 1x磷酸盐缓冲液轻轻洗涤一次，避免细胞脱落。</li>
			<li>每孔加入 10 µL RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，1% NP-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% 十二烷基硫酸钠，150 mM NaCl，2 mM EDTA，50 mM NaF），并添加 1× 蛋白酶抑制剂混合物，将培养板置于摇床上振荡 10 分钟。随后将整块培养板于 -80 °C 冻存。</li>
			<li>解冻培养板，并按照制造商说明书进行蛋白质定量检测，以用于数据归一化。</li>
			<li>检索并分析数据。使用 Wave Desktop 软件打开数据文件。点击 标准化 并将每个孔的归一化值粘贴。点击 应用 以标准化数据。单击 导出 并选择 糖酵解应激测试报告生成器 将分析后的数据导出至报告生成器。或者，将数据导出至外部应用程序。 
			注意：也可使用每孔的总核DNA含量对数据进行归一化。可使用结合核酸的荧光染料（如CyQuant）来评估每孔的总核DNA含量。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用细胞外通量分析仪进行线粒体应激测试（步骤耗时：约3小时30分钟）
	<ol>
		<li>使用注射化合物加载传感器 cartridge
		<ol>
			<li>在预热的线粒体应激测试培养基（pH 7.4）中配制 20 µM 寡霉素、20 µM FCCP 以及 5 µM 鱼藤酮 + 5 µM 抗霉素 A 溶液。 
			注意：所有注射用化合物溶液均配制为10倍浓度。终孔浓度分别为：寡霉素2 µM，FCCP 2 µM，鱼藤酮和抗霉素A各0.5 µM（参见 表3).</li>
			<li>从步骤1.1.5的37 °C培养箱中取出水合后的传感器 cartridge，并按照步骤2.5.1.2中所述方法去除气泡。</li>
			<li>按照步骤 2.5.1.3 至 2.5.1.6，向 A 孔中加入 20 µL 的 20 µM 寡霉素，向 B 孔中加入 22 µL 的 20 µM FCCP，向 C 孔中加入 25 µL 的 5 µM 鱼藤酮与 5 µM 抗霉素 A 的混合液。 
			注意：所有96个孔的每一系列端口，包括背景孔，都必须完全加载相同体积的注入化合物。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>模板的制备、校准与测量
		<ol>
			<li>在控制器上创建或加载线粒体应激测试模板。输入有关注射策略、处理条件和细胞类型的详细信息，然后按下 生成组别. 前往 平板图 将孔板中的孔分配给各个待分析组别，并将4个角落的孔用于背景测量。</li>
			<li>在 实验方案，确保 校准 和 平衡 在……中进行检查 初始化步骤.</li>
			<li>用于基础值测量以及每次注射（寡霉素、FCCP 和鱼藤酮 + 抗霉素 A）后的测量，设置循环次数 测量循环 到 3 和 混合 - 等待 - 测量时间 到 3 分钟 - 0 分钟 - 3 分钟 （参见 表4).</li>
			<li>按照2.5.2.4步骤开始运行以执行校准。</li>
			<li>每孔加入 130 µL 预热的线粒体应激测试培养基（pH 7.4），步骤同 2.5.2.5。</li>
			<li>开始测量；按照步骤 2.5.2.6 至 2.5.2.10 的方法获取并分析数据。将分析后的数据导出至 线粒体应激测试报告生成器 或外部应用。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本文介绍了一种利用Seahorse细胞外通量分析仪优化的小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）细胞生物能量代谢（糖酵解和氧化磷酸化）评估方案。该仪器是一种强大的工具，可同时测量活细胞的胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），分别作为糖酵解和线粒体呼吸的指标，从而实现实时监测细胞生物能量状态。此外，基于96孔微孔板的平台具有高通量和高灵敏度的优势，可在单块微孔板上同时分析多个样本；相比之下，另一种高分辨率呼吸测定仪Oroboros O2k仅能同时分析2个样本，而传统的Clark电极20则通量更低。
细胞外通量分析仪主要用于贴壁细胞类型的分析，因其要求细胞以单层形式存在，这使得对悬浮培养的细胞进行分析更具挑战性。此外，在通过加药孔注入药物后，药物与培养基在检测孔内混合过程中会产生湍流，可能导致细胞从孔底脱落。因此，细胞必须牢固地贴附于孔的底部。本方案中采用了一种来源于海洋贻贝Mytilus edulis的非免疫原性多酚蛋白制成的细胞黏附剂，以制备小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的贴壁单层细胞。
<p clas...

造血作用是指由造血干细胞（HSCs）生成具有高度特化功能的各种成熟血细胞的过程1。HSCs 具有自我更新能力，并可分化为多种多能性及谱系特异性的祖细胞群体。这些祖细胞最终产生淋巴系、髓系、红系和巨核细胞系的细胞。为了维持其自我更新能力，HSCs 大多处于静息状态，并且与其他组织干细胞类似，被认为主要依赖糖酵解而非线粒体氧化磷酸化（OxPHOS）来生成 ATP2,3。一旦进入细胞周期，呼吸作用和氧化磷酸化增强，导致活性氧（ROS）水平升高，这不利于 HSC 的维持和功能3。因此，反复的细胞分裂可能导致 HSC 自我更新能力下降，最终导致其耗竭。
在成体造血过程中，造血干细胞（HSCs）主要进行不对称细胞分裂，其中一个子代细胞保留HSC潜能，并继续依赖糖酵解代谢；另一个子代细胞则转变为原始祖细胞，失去自我更新能力，但能够增殖并最终分化为成熟的有功能的造血细胞4。当HSCs分化生成下游祖细胞时，据认为会发生从糖酵解向线粒体代谢的转换，以提供支持这一快速转变所需的能量和生物合成前体5，这一观点得到了以下观察结果的支持：HSCs具有非活性的线粒体质量6,7,8,9。相比之下，谱系定向祖细胞中的线粒体活性（以活性氧水平为指标）显著高于HSCs9,10,11。因此，造血过程最初阶段发生的代谢变化提示线粒体在调控HSC命运中具有直接而关键的作用。
在衰老、癌症、糖尿病和肥胖等多种应激条件下存在的功能障碍线粒体12，可能干扰造血干细胞的自我更新能力，通过产生活性氧（ROS）过量、损害ATP生成和/或改变其他代谢过程，诱导造血干细胞/祖细胞分化失衡9,12,13造血干细胞/祖细胞分化过程中代谢稳态的紊乱可能显著影响造血过程，进而可能导致血液系统异常的发生13鉴于糖酵解和线粒体氧化磷酸化（OxPHOS）对造血干细胞（HSC）干性和分化具有关键影响，研究在正常和应激条件下这两种代谢参数具有重要意义。通过检测细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）——分别反映细胞糖酵解和线粒体呼吸的指标——可深入了解HSC及其祖细胞的糖酵解和线粒体功能。
Seahorse 细胞外通量分析仪是一种功能强大的设备，每个孔配备两个探针，可同时测量活细胞的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），从而能够实时评估细胞在不同底物或抑制剂作用下的生物能量状态。与该分析仪配套使用的检测板含有注射孔，最多可容纳四种药物，以便在检测过程中自动注入。典型的糖酵解应激测试方案如图1A所示。该检测首先测量细胞在含有谷氨酰胺但不含葡萄糖或丙酮酸的糖酵解应激测试培养基中孵育时的ECAR。这部分酸化来源于细胞的非糖酵解活性，记为非糖酵解性酸化。随后注入饱和浓度的葡萄糖。细胞内葡萄糖通过糖酵解转化为丙酮酸，丙酮酸可在胞质中进一步代谢生成乳酸，或在线粒体中代谢生成CO2和水。
葡萄糖转化为乳酸会导致质子净生成并随后释放到细胞外环境中，从而引起细胞外酸化率（ECAR）迅速升高14,15,16。在基础条件下，这种由葡萄糖刺激引起的ECAR变化被报告为糖酵解活性。第二次注射寡霉素（一种ATP合酶抑制剂，也称为复合体V17），可抑制线粒体ATP的生成。在寡霉素介导的氧化磷酸化（OxPHOS）抑制过程中，细胞会最大程度地上调糖酵解以满足其能量需求。这导致ECAR进一步升高，反映出细胞的最大糖酵解能力。最大糖酵解能力与基础糖酵解之间的差值称为糖酵解储备。最后注射2-DG，其会引起ECAR显著下降，通常接近非糖酵解性酸化水平。2-DG是一种葡萄糖类似物，可竞争性地结合己糖激酶，从而抑制糖酵解过程18。因此，2-DG诱导的ECAR降低进一步证实了在葡萄糖和寡霉素注射后观察到的ECAR升高确实来源于糖酵解。
图1B展示了典型的线粒体应激测试示意图。该检测首先测量细胞在含有葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸的线粒体应激测试培养基中孵育时的基础耗氧率（OCR）。在完成基础OCR测量后，向体系中注射寡霉素（oligomycin），该物质可抑制复合体V，从而减少电子传递链（ETC）中的电子流动17。因此，OCR因寡霉素的注射而降低，这一OCR的下降部分反映了线粒体ATP的生成水平。第二次注射的是羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP），它是一种质子载体，也是线粒体氧化磷酸化（OxPHOS）的解偶联剂17。FCCP通过允许质子跨线粒体内膜流动，破坏线粒体内的质子梯度。由于FCCP的注射，电子传递链中的电子流动被解除抑制，复合体IV以最大速率消耗氧气。最大OCR与基础OCR之间的差值称为备用呼吸能力（spare respiratory capacity），用于衡量细胞在应激条件下应对能量需求增加的能力。最后，注射两种电子传递链抑制剂的混合物（鱼藤酮，复合体I抑制剂；抗霉素A，复合体III抑制剂17），完全阻断电子流动，使OCR降至极低水平。在注射鱼藤酮和抗霉素A后测得的OCR代表由细胞内其他过程驱动的非线粒体耗氧率。非线粒体OCR可用于计算基础呼吸、质子漏和最大呼吸。
基础呼吸代表基础OCR与非线粒体OCR之间的差值。质子漏呼吸指寡霉素注射后的OCR与非线粒体OCR之间的差值。最大呼吸代表FCCP注射后的OCR与非线粒体OCR之间的差值。偶联效率计算为ATP生成速率占基础呼吸速率的百分比。本文提供了一种详细的实验方案，利用Seahorse XFe96细胞外通量分析仪测定谱系阴性造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的ECAR和OCR。该方案描述了分离小鼠谱系阴性HSPCs的方法，阐述了细胞接种密度及细胞外通量检测中所用各种药物浓度的优化过程，并介绍了药物处理策略。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Corning</td><td>430626</td><td>用于过滤除菌检测培养基</td></tr><tr><td>100 mM 丙酮酸钠</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>线粒体应激检测培养基的组分</td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形 Falcon 管</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>用于造血干细胞与祖细胞（HSPCs）收获及检测药物溶液配制</td></tr><tr><td>200 mM L-谷氨酰胺</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>糖酵解应激检测和线粒体应激检测培养基的组分</td></tr><tr><td>2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>糖酵解应激检测中的第三次药物注射</td></tr><tr><td>5x 富集缓冲液（MojoSort）</td><td>Biolegend</td><td>480017</td><td>用于 HSPCs 收获过程中的洗涤</td></tr><tr><td>氯化铵（NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-3</td><td>ACK 裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>抗霉素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>线粒体应激检测中的第三次药物注射</td></tr><tr><td>Bio-Rad DC 蛋白检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td>按制造商说明书使用</td></tr><tr><td>羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>线粒体应激检测中的第二次药物注射</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>细胞黏附剂，用于细胞微孔板的包被</td></tr><tr><td>Countes 3 全自动细胞计数仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2793-500</td><td>ACK 裂解缓冲液和 RIPA 裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>用于 HSPCs 收获过程中的细胞过滤</td></tr><tr><td>Gibco 胎牛血清（FBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>26400044</td><td>用于 HSPCs 收获过程中检测缓冲液的配制</td></tr><tr><td>Gibco HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14175095</td><td>用于 HSPCs 收获过程中检测缓冲液的配制</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>线粒体应激检测培养基的组分，以及糖酵解应激检测中的首次注射</td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>糖酵解应激检测中的第二次药物注射，以及线粒体应激检测中的首次药物注射</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td>用于检测后细胞洗涤以进行蛋白定量</td></tr><tr><td>碳酸氢钾（KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Fisher Scientific</td><td>P235-500</td><td>ACK 裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物（PIC）</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>以片剂形式提供。每片溶于 10 mL RIPA 缓冲液中，配制成 1x PIC。</td></tr><tr><td>大鼠生物素标记抗小鼠 B220 抗体，克隆编号：RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103203</td><td>用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭</td></tr><tr><td>大鼠生物素标记抗小鼠 CD2 抗体，克隆编号：RM2-5</td><td>Biolegend</td><td>100103</td><td>用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭</td></tr><tr><td>大鼠生物素标记抗小鼠 CD3 抗体，克隆编号：17A2</td><td>Biolegend</td><td>100243</td><td>用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭</td></tr><tr><td>大鼠生物素标记抗小鼠 CD5 抗体，克隆编号：53-7.3</td><td>Biolegend</td><td>100603</td><td>用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭</td></tr><tr><td>大鼠生物素标记抗小鼠 CD8 抗体，克隆编号：53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100703</td><td>用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭</td></tr><tr><td>大鼠生物素标记抗小鼠 Gr-1 抗体，克隆编号：RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108403</td><td>用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭</td></tr><tr><td>大鼠生物素标记抗小鼠 Ter-119 抗体，克隆编号：TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116203</td><td>用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭</td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>线粒体应激检测中的第三次药物注射</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 细胞外通量分析仪</td><td>Seahorse Biosciences（现为 Agilent）</td><td></td><td>用于实时测量 ECAR 和 OCR。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>用于配制微孔板包被用细胞黏附溶液</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>RIPA 裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>RIPA 裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>氟化钠（NaF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td>RIPA 裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>配制成 1 N 溶液，用于 pH 值调节</td></tr><tr><td>链霉亲和素纳米磁珠（MojoSort）</td><td>Biolegend</td><td>480015</td><td>用于 HSPCs 收获过程中的谱系耗竭</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153</td><td>RIPA 裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>XF 基础培养基</td><td>Agilent</td><td>102353-100</td><td>用于配制糖酵解应激检测和线粒体应激检测培养基的基础培养基</td></tr><tr><td>XF 预处理工作站</td><td>Seahorse Biosciences</td><td></td><td>用于非 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 条件下 37 &amp;deg;C 的孵育</td></tr><tr><td>XFe96 细胞外通量检测试剂盒</td><td>Agilent</td><td>102416-100 或 102601-100</td><td>包含检测用微孔板、辅助板、加样导板（用于向检测微孔板中加样&lt;br/&gt; 药物）、XF 校准液以及 XF 细胞培养微孔板</td></tr></tbody></table>

利用细胞外通量分析仪评估小鼠造血干细胞及原始祖细胞的细胞生物能量代谢

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

在稳态条件下，造血干细胞（HSCs）主要处于静息状态，且被认为主要依赖糖酵解来满足其能量需求。然而，在感染或失血等应激条件下，HSCs 会进入增殖状态，并迅速产生下游祖细胞，这些祖细胞进一步分化，最终生成成熟的血细胞。在此转变与分化过程中，HSCs 退出静息状态，并迅速发生代谢转换，从糖酵解转变为氧化磷酸化（OxPHOS）。多种应激条件，如衰老、癌症、糖尿病和肥胖，可能对线粒体功能产生负面影响，从而改变造血过程中 HSCs 及祖细胞的代谢重编程和分化能力。通过检测细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）——分别反映细胞糖酵解和线粒体呼吸的指标——可以获得在正常和应激条件下 HSCs 及祖细胞糖酵解与线粒体功能的宝贵信息。
本文提供了一种详细的实验方案，用于利用细胞外通量分析仪检测小鼠骨髓来源的谱系阴性细胞群体（包括造血干细胞和原始祖细胞，HSPCs）的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）。该方案描述了从小鼠骨髓中分离谱系阴性细胞的方法，阐述了细胞接种密度以及2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG，一种抑制糖酵解的葡萄糖类似物）和多种靶向氧化磷酸化（OxPHOS）通路的药物（寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素A）在实验中的浓度优化，并介绍了药物处理策略。通过该实验可测定糖酵解通量的关键参数，如基础糖酵解、糖酵解能力及糖酵解储备，以及OxPHOS相关参数，如基础呼吸、最大呼吸、质子泄漏、ATP生成、备用呼吸能力及偶联效率。本方案实现了对非贴壁型HSPCs的ECAR和OCR测定，并可推广应用于优化各类悬浮细胞的分析条件。

通过本方案，优化了细胞数量以及多种靶向氧化磷酸化（OxPHOS）药物的浓度（用于细胞外通量测定），以检测从24周龄雌性C57BL/6小鼠中分离得到的造血干细胞和祖细胞（HSPC）的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR）。首先进行糖酵解压力测试，以优化细胞数量和寡霉素（oligomycin）浓度。本实验中每孔使用的HSPC数量范围为5 × 104 至 2.5 × 105。如图2A和图2C所示，非糖酵解性酸化速率随着细胞数量从5 × 104增加到2.5 × 105而上升，但在2 × 105至2.5 × 105细胞之间仅轻微增加。正如预期，加入10 mM葡萄糖在所有细胞数量下均刺激了糖酵解反应，且每孔2.5 × 105个细胞时ECAR达到最大增幅。然而，加入2 μM寡霉素并未进一步增加ECAR，这与预期结果不符。使用1 μM寡霉素也得到类似结果（未显示）。这些结果提示...

本文介绍的方法总结了利用细胞外通量分析仪实时测定非贴壁小鼠造血干细胞和原始祖细胞（HSPCs）的细胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），以评估其细胞生物能量学的优化实验方案。

在稳态条件下，造血干细胞（HSCs）主要处于静息状态，且被认为主要依赖糖酵解来满足其能量需求……

在造血过程中，造血干细胞会经历从糖酵解到氧化磷酸化的代谢转换。本方案可用于评估小鼠造血干细胞和祖细胞的糖酵解功能及线粒体功能。该方法可用于实时评估细胞生物能量状态。基于96孔微孔板的平台具有高通量和高灵敏度的定量能力，可利用单个微孔板同时分析多个样本。该技术可用于研究化学物质或基因操作在不同条件下对造血干细胞（HSC）代谢的影响，有助于阐明维持HSC多能性的代谢通路。尽管本研究主要关注小鼠造血干细胞和祖细胞，但该方案和方法可轻松调整，以优化任何类型悬浮细胞的分析条件。在检测前一天，打开细胞外通量检测试剂盒，取出传感器微孔板和工具板组件。保留加载导板，供次日使用。现在手动将传感器盒从工具板上分离，并将其倒置放置在工具板旁边。使用多通道移液器，向工具板的每个孔中加入 200 µL 随通量测定试剂盒提供的校准液，然后将传感器盒重新放回工具板上，确保传感器完全浸没在校准液中。随后，将含有校准液并组装好的传感器盒的工具板置于非二氧化碳培养箱中，在 37 °C 下孵育过夜，并遵循文中所述的加湿条件。在进行检测当天，按照文本稿件中的描述，每块96孔细胞培养微孔板准备2.5毫升细胞黏附溶液。打开通量检测试剂盒中包含的96孔细胞培养微孔板，将25微升制备好的细胞黏附溶液加入每个孔的底部。用盖子盖住微孔板，并在生物安全柜内室温下孵育30分钟。孵育后，使用多通道移液器或抽吸装置移除并弃去多余的细胞粘附溶液，每孔用 200 微升无菌超纯水洗涤两次。将培养板置于生物安全柜内，敞盖空气干燥 30 至 45 分钟。将制备好的小鼠谱系阴性造血干细胞在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于适当的检测培养基中，再次离心细胞悬液。重复此步骤一次，最后将细胞重悬于适量预温的检测培养基中，调整细胞浓度至每50微升含250,000个细胞，或每毫升含500万个细胞。使用多通道移液器沿细胞黏附包被的96孔细胞培养微孔板各孔侧壁加入50微升细胞悬液，然后向角落的背景测量孔中加入50微升检测培养基。通过向未包被的96孔细胞培养微孔板的每个孔中加入50微升水，制备离心平衡板。在室温下以200 × g离心细胞1分钟。将微孔板置于不含二氧化碳的培养箱中，在37°C孵育25至30分钟，以促进细胞贴壁。30分钟后，在显微镜下观察，确认细胞已稳定贴附于微孔板表面。首先，按照文本稿件中的说明，用预热的糖酵解压力测试分析培养基配制所有所需溶液，并将水化后的传感器 cartridge 从培养箱中取出。将传感器 cartridge 从校准液中提起，然后将其放回装有校准液的同一工具板中，以去除气泡。将80加样导板平放在传感器盒顶部，方向为字母A位于左上角。使用多通道移液器，在A孔中加入20微升100毫摩尔葡萄糖溶液。将80加样导板替换为BC加样导板，方向为字母B位于左上角，在B孔中加入22微升20微摩尔寡霉素溶液。重新调整BC加样导板方向，使字母C位于左上角以对准C孔，向C孔中加入25微升500毫摩尔2-脱氧-D-葡萄糖溶液。随后取下并丢弃加样导板。现在在控制器上创建或加载糖酵解压力测试的模板。输入有关注射策略、处理条件和细胞类型的详细信息，然后点击生成分组。转到孔板图，为每个待分析的分组分配相应的孔位。在实验方案中，确保在初始化步骤中检查校准和平衡。对于基线测量以及每次注射后的测量，将测量循环次数设置为三次，并将混合、等待、测量时间分别设置为3分钟、0分钟、3分钟。在软件中点击“开始运行”。取下已加载化合物并水合的传感器 cartridge 的盖子，将其放置于细胞外通量分析仪的工作托盘上。开始校准运行。从培养箱中取出含有接种细胞的微孔板。在不扰动细胞的情况下，每孔缓慢加入130微升预热的糖酵解压力测试检测试剂，使每孔的培养基总体积达到180微升，并将培养板放回培养箱中继续孵育15至20分钟。在软件中点击“打开托盘”以打开Seahorse仪器的温控托盘。校准完成后，将工具板替换为含有细胞的该检测微孔板，然后按“加载细胞板”以开始测量。测量结束后，从孔板中移除检测培养基，注意不要扰动细胞，然后用250微升磷酸盐缓冲液轻轻洗涤细胞，避免细胞脱落。随后，向每孔加入10微升含有1X蛋白酶抑制剂混合液的放射免疫沉淀裂解缓冲液，在摇床上震荡10分钟。将整块孔板置于-80摄氏度冷冻保存。解冻酶标板，并按照制造商说明书进行蛋白质定量检测，以用于数据归一化。使用 Wave 桌面软件打开数据文件，检索并分析数据。点击“归一化”（Normalize），粘贴每个孔的归一化数值，然后点击“应用”（Apply）以完成数据归一化。单击“导出”并选择糖酵解应激测试报告生成器，将分析后的数据导出至报告生成器。非糖酵解性酸化速率随着细胞数量从 50,000 增加到 250,000 而上升，但在 200,000 到 250,000 之间仅轻微增加。加入 10 毫摩尔葡萄糖可刺激所有细胞数量下的糖酵解，每孔 250,000 个细胞时观察到 ECAR 的最大增幅。然而，加入2 µM的寡霉素并不会进一步增加ECAR。在同一组糖酵解压力测试中获得的OCR数据显示，由于复合体5被抑制，加入寡霉素后OCR显著下降。根据糖酵解压力测试参数的计算结果，选择每孔250,000个细胞并加入2 µM寡霉素的条件用于后续研究。线粒体应激测试显示，2 µM 寡霉素注射通过抑制复合体5导致OCR显著降低。FCCP以剂量依赖的方式刺激HSPC中的OCR，在2 µM时观察到最大增幅。0.5 µM鱼藤酮和0.5 µM抗霉素A的混合物注射使OCR降至最低水平，对应于非线粒体氧消耗。线粒体应激测试参数已计算完成，并选定两微摩尔的FCCP用于后续研究。鉴于该技术具有高通量特性，本文所述方案可轻松适用于在造血干细胞、造血祖细胞及恶性造血细胞中筛选大量生物能量调节剂。在多种研究背景下， Seahorse 分析已广泛用于文献中，以检测在不同底物和抑制剂存在条件下的细胞代谢情况。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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