利用细胞外通量分析仪评估小鼠造血干细胞及原始祖细胞的细胞生物能量代谢

在造血过程中，造血干细胞会经历从糖酵解到氧化磷酸化的代谢转换。本方案可用于评估小鼠造血干细胞和祖细胞的糖酵解功能及线粒体功能。该方法可用于实时评估细胞生物能量状态。

基于96孔微孔板的平台具有高通量和高灵敏度的定量能力，可利用单个微孔板同时分析多个样本。该技术可用于研究化学物质或基因操作在不同条件下对造血干细胞（HSC）代谢的影响，有助于阐明维持HSC多能性的代谢通路。

尽管本研究主要关注小鼠造血干细胞和祖细胞，但该方案和方法可轻松调整，以优化任何类型悬浮细胞的分析条件。在检测前一天，打开细胞外通量检测试剂盒，取出传感器微孔板和工具板组件。保留加载导板，供次日使用。

现在手动将传感器盒从工具板上分离，并将其倒置放置在工具板旁边。使用多通道移液器，向工具板的每个孔中加入 200 µL 随通量测定试剂盒提供的校准液，然后将传感器盒重新放回工具板上，确保传感器完全浸没在校准液中。随后，将含有校准液并组装好的传感器盒的工具板置于非二氧化碳培养箱中，在 37 °C 下孵育过夜，并遵循文中所述的加湿条件。

在进行检测当天，按照文本稿件中的描述，每块96孔细胞培养微孔板准备2.5毫升细胞黏附溶液。打开通量检测试剂盒中包含的96孔细胞培养微孔板，将25微升制备好的细胞黏附溶液加入每个孔的底部。用盖子盖住微孔板，并在生物安全柜内室温下孵育30分钟。

孵育后，使用多通道移液器或抽吸装置移除并弃去多余的细胞粘附溶液，每孔用 200 微升无菌超纯水洗涤两次。将培养板置于生物安全柜内，敞盖空气干燥 30 至 45 分钟。将制备好的小鼠谱系阴性造血干细胞在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。

弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于适当的检测培养基中，再次离心细胞悬液。重复此步骤一次，最后将细胞重悬于适量预温的检测培养基中，调整细胞浓度至每50微升含250,000个细胞，或每毫升含500万个细胞。使用多通道移液器沿细胞黏附包被的96孔细胞培养微孔板各孔侧壁加入50微升细胞悬液，然后向角落的背景测量孔中加入50微升检测培养基。

通过向未包被的96孔细胞培养微孔板的每个孔中加入50微升水，制备离心平衡板。在室温下以200 × g离心细胞1分钟。将微孔板置于不含二氧化碳的培养箱中，在37°C孵育25至30分钟，以促进细胞贴壁。

30分钟后，在显微镜下观察，确认细胞已稳定贴附于微孔板表面。首先，按照文本稿件中的说明，用预热的糖酵解压力测试分析培养基配制所有所需溶液，并将水化后的传感器 cartridge 从培养箱中取出。将传感器 cartridge 从校准液中提起，然后将其放回装有校准液的同一工具板中，以去除气泡。

将80加样导板平放在传感器盒顶部，方向为字母A位于左上角。使用多通道移液器，在A孔中加入20微升100毫摩尔葡萄糖溶液。将80加样导板替换为BC加样导板，方向为字母B位于左上角，在B孔中加入22微升20微摩尔寡霉素溶液。重新调整BC加样导板方向，使字母C位于左上角以对准C孔，向C孔中加入25微升500毫摩尔2-脱氧-D-葡萄糖溶液。随后取下并丢弃加样导板。

现在在控制器上创建或加载糖酵解压力测试的模板。输入有关注射策略、处理条件和细胞类型的详细信息，然后点击生成分组。转到孔板图，为每个待分析的分组分配相应的孔位。

在实验方案中，确保在初始化步骤中检查校准和平衡。对于基线测量以及每次注射后的测量，将测量循环次数设置为三次，并将混合、等待、测量时间分别设置为3分钟、0分钟、3分钟。在软件中点击“开始运行”。

取下已加载化合物并水合的传感器 cartridge 的盖子，将其放置于细胞外通量分析仪的工作托盘上。开始校准运行。从培养箱中取出含有接种细胞的微孔板。

在不扰动细胞的情况下，每孔缓慢加入130微升预热的糖酵解压力测试检测试剂，使每孔的培养基总体积达到180微升，并将培养板放回培养箱中继续孵育15至20分钟。在软件中点击“打开托盘”以打开Seahorse仪器的温控托盘。校准完成后，将工具板替换为含有细胞的该检测微孔板，然后按“加载细胞板”以开始测量。

测量结束后，从孔板中移除检测培养基，注意不要扰动细胞，然后用250微升磷酸盐缓冲液轻轻洗涤细胞，避免细胞脱落。随后，向每孔加入10微升含有1X蛋白酶抑制剂混合液的放射免疫沉淀裂解缓冲液，在摇床上震荡10分钟。将整块孔板置于-80摄氏度冷冻保存。

解冻酶标板，并按照制造商说明书进行蛋白质定量检测，以用于数据归一化。使用 Wave 桌面软件打开数据文件，检索并分析数据。点击“归一化”（Normalize），粘贴每个孔的归一化数值，然后点击“应用”（Apply）以完成数据归一化。

单击“导出”并选择糖酵解应激测试报告生成器，将分析后的数据导出至报告生成器。非糖酵解性酸化速率随着细胞数量从 50,000 增加到 250,000 而上升，但在 200,000 到 250,000 之间仅轻微增加。加入 10 毫摩尔葡萄糖可刺激所有细胞数量下的糖酵解，每孔 250,000 个细胞时观察到 ECAR 的最大增幅。

然而，加入2 µM的寡霉素并不会进一步增加ECAR。在同一组糖酵解压力测试中获得的OCR数据显示，由于复合体5被抑制，加入寡霉素后OCR显著下降。根据糖酵解压力测试参数的计算结果，选择每孔250,000个细胞并加入2 µM寡霉素的条件用于后续研究。

线粒体应激测试显示，2 µM 寡霉素注射通过抑制复合体5导致OCR显著降低。FCCP以剂量依赖的方式刺激HSPC中的OCR，在2 µM时观察到最大增幅。0.5 µM鱼藤酮和0.5 µM抗霉素A的混合物注射使OCR降至最低水平，对应于非线粒体氧消耗。

线粒体应激测试参数已计算完成，并选定两微摩尔的FCCP用于后续研究。鉴于该技术具有高通量特性，本文所述方案可轻松适用于在造血干细胞、造血祖细胞及恶性造血细胞中筛选大量生物能量调节剂。在多种研究背景下， Seahorse 分析已广泛用于文献中，以检测在不同底物和抑制剂存在条件下的细胞代谢情况。