用于研究真核糖原代谢的分光光度法

这些协议意义重大，因为它们避免使用放射性同位素，并消除了可能阻止许多工人研究糖原代谢酶的屏障。所描述的程序价格低廉，只需要使用简单的分光光度计。首先测定糖原合酶活性，在冰上解冻先前制备的UDP葡萄糖，ATP，磷酸烯醇丙酮酸和NDP激酶储备溶液。

将水浴预热至30摄氏度。当储备溶液准备好时，通过将试剂添加到15毫升管中，根据糖原合酶测定的数量准备足够的测定混合物，如文本协议中所述。通过用水代替反应混合物中的NADH来制备空白反应，并将反应转移到一次性甲基丙烯酸比色皿中。

使用空白反应在分光光度计上将零设置为340纳米波长。在1.5毫升管中取一个770微升等分试样的反应混合物，并依次向管中加入NDP激酶和丙酮酸激酶乳酸脱氢酶混合物各两微升。混合后，将管在水浴中以30摄氏度轻轻孵育三分钟，以预热反应混合物。

然后在pH 7.8的20毫摩尔Tris缓冲液中加入30微升含有糖原合酶的样品，并在将反应混合物转移到处置的甲基丙烯酸比色皿之前轻轻混合。将比色皿放入分光光度计中，并以定时间隔记录340纳米处的吸光度10至20分钟。然后，绘制获得的吸光度与时间的关系图。

为了测量释放的葡萄糖，将40微升上清液从加热的糖原样品转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中。并加入手稿中描述的三乙醇胺、盐酸硫酸镁缓冲液、NADP ATP混合物和水的测定体积。通过轻轻上下移液混合混合物，不要产生气泡。

向每个比色皿中加入0.5微升葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。通过移液混合后，将混合物在室温下孵育10分钟，然后在340纳米处记录吸光度。接下来，如前所述将0.5微升己糖激酶混合到每个比色皿中，并在记录吸收剂组340纳米之前孵育15分钟。

然后继续在室温下孵育五分钟，然后记录吸光度。如果吸收比15分钟记录的吸收增加，则继续孵育5分钟，然后记录340纳米处的最终吸收。为了确定糖原支链，将650微升碘氯化钙彩色试剂原液与100微升水混合在1.5毫升管中，并在转移到一次性甲基丙烯酸比色皿之前彻底混合溶液。

将比色皿放入分光光度计中，以波长扫描模式进行运行，以收集330至800纳米的背景光谱。在一个单独的1.5毫升管中，将650微升的工作碘氯化钙颜色试剂与50微克牡蛎糖原混合，并用水将最终体积补足至750微升。彻底混合混合物后，将溶液转移到一次性甲基丙烯酸酯比色皿中，以收集330至800纳米的吸收光谱。

同样，如前所述，获得含有50微克支链淀粉和30微克直链淀粉的吸收光谱。为了获得未表征糖原样品的支链结构的指示，将25至50微克糖原与650微升工作碘氯化钙颜色试剂混合，并按照前面的说明进行以获得吸收光谱。在糖原合酶测定中，观察到340纳米处的吸收随时间线性降低。

在测定中添加过多的糖原合酶导致反应在前两分钟内完成。对照反应不含糖原合酶，没有显示可测量的吸光度降低。使用纯化酶的糖原磷酸化酶测定的数据具有持续三分钟的线性相。

吸光度增加速率约为每分钟 0.01 至 0.04 单位是最佳的。在糖原脱支酶测定中，反应显示线性相持续至少10分钟。来自糖原支化酶测定的代表性数据显示，缺乏支化酶的对照样品与含有支化酶的反应之间的吸光度存在差异。

图中说明了测定的窄动态范围。可以产生的吸光度的最大变化为0.4个吸光度单位，当吸收的变化约为0.2个吸光度单位时，线性就会丢失。糖原支链评估中使用的糖原、支链淀粉和直链淀粉的质量数显示出约0.7至0.8的最大吸光度读数，每个读数在不同的最大吸光度下。

糖原样品在大约400纳米和460纳米处产生两个峰。碘氯化钙颜色试剂非常致密。在收集吸收光谱之前，确保糖原样品与试剂完全混合非常重要。