Name: 用于研究真核糖原代谢的分光光度法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学习使用分光光度法测定糖原合酶活性，无需放射性同位素即可安全研究真核生物糖原代谢。该方法成本低廉、操作简便，适用于广泛的生物化学研究。

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作者感谢Karoline Dittmer和Andrew Brittingham提供的见解以及许多有益的讨论。本工作部分得到了爱荷华骨科教育与研究基金（IOER 03-17-05和03-20-04）资助。

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</ol>

目前没有已知与本工作相关的利益冲突，且本工作未获得可能影响其结果的财务支持。

总体而言，所介绍的各种方法的主要优势在于成本低、操作简便、速度快，且无需依赖专用设备。它们共有的主要缺点是与其它现有方法相比灵敏度较低。涉及NADH/NADPH生成或消耗的实验步骤的灵敏度较易估算。由于NADH/NADPH的摩尔消光系数为6.22 M-1 cm-1，通过简单计算可知，浓度变化约10–20 µM时即可被轻易检测到。根据本文所述的测定体积，这相当于能够检测约10–20 nmol的物质含量。可以说，这一灵敏度已相当可观。然而，通过调整放射性标记底物的比活性，可轻易使检测灵敏度超过分光光度法测定的极限。尽管分支酶活性测定和糖原分支的定性评估均依赖于碘与α1,4-连接的葡萄糖聚合物形成复合物，但两种测定的输出结果不同，其灵敏度也各不相同。下文将分别讨论每种测定方法的具体注意事项。
糖原合酶活性的测定 
此处描述的偶联酶法检测可用于连续测定糖原合酶活性，适用于动力学参数的确定。该方法易于放大，且已有非常相似的方案被用于微孔板，从而可实现酶活性的高通量平行测定<sup class="xref"...

糖原在自然界中广泛分布，存在于细菌、多种原生生物、真菌和动物中。在微生物中，当营养物质受限时，糖原对细胞存活具有重要作用；而在哺乳动物等高等生物中，糖原的合成与降解有助于维持血糖水平的稳定1,2,3。因此，糖原代谢的研究对于微生物学和哺乳动物生理学等不同领域均具有重要意义。理解糖原代谢需要研究糖原合成（糖原合酶和分支酶）以及糖原降解（糖原磷酸化酶和去分支酶）的关键酶。目前测定糖原合酶、磷酸化酶、分支酶和去分支酶活性的金标准方法依赖于放射性同位素标记。例如，通常通过检测葡萄糖从UDP-[14C]葡萄糖（适用于动物和真菌酶）或ADP-[14C]葡萄糖（适用于细菌酶）掺入糖原的过程，采用终止式放射化学法测定糖原合酶活性4,5。类似地，糖原磷酸化酶的测定是在糖原合成方向上进行的，通过追踪[14C]葡萄糖-1-磷酸中的葡萄糖掺入糖原来完成6。分支酶的活性测定是通过检测该酶促进糖原磷酸化酶将[14C]葡萄糖从葡萄糖-1-磷酸掺入α1,4-连接链的能力来实现的7，而去分支酶活性则通过检测其将[14C]葡萄糖掺入糖原的能力来确定8。尽管这些放射性方法极为灵敏，可用于酶活性较低的粗制细胞提取物，但放射性底物成本高昂，且使用受到放射性同位素相关法规的限制。这些障碍使得许多研究人员难以采用此类测定方法。然而，多年来已陆续报道了多种用于测定这些酶的分光光度法。总体而言，这些方法最终依赖于检测NADH/NADPH的生成或消耗，或利用糖原与碘之间形成有色复合物的现象进行检测。因此，这些方法操作简便，仅需配备钨灯或氙闪光灯的普通分光光度计即可完成实验。
糖原合酶的分光光度法测定依赖于检测葡萄糖添加到生长中的糖原链时，从糖核苷酸供体释放出的核苷二磷酸9,10。下文方案第1节中所述的测定糖原合酶活性的操作步骤是对Wayllace等11所提出方法的改进，其偶联反应方案如下所示：
(葡萄糖)n + UPD-葡萄糖 → (葡萄糖)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + 磷酸烯醇式丙酮酸 → 丙酮酸 + ATP
丙酮酸 + NADH + H+ → 乳酸 + NAD+
糖原合酶将UDP-葡萄糖中的葡萄糖添加到糖原上。此过程中生成的UDP由核苷二磷酸激酶（NDP激酶）转化为UTP，该反应同时生成ADP。生成的ADP随后作为丙酮酸激酶的底物，丙酮酸激酶利用磷酸烯醇式丙酮酸作为磷酸供体，将ADP磷酸化。所产生的丙酮酸在乳酸脱氢酶催化下转化为乳酸，该反应消耗NADH。因此，该检测可连续进行，通过监测NADH消耗引起的340 nm处吸光度的降低来实现。该方法也可方便地适用于以ADP-葡萄糖作为葡萄糖供体的酶。在此情况下，偶联步骤更为简单，因为糖原合酶反应释放的ADP可直接被丙酮酸激酶利用。
目前有多种分光光度法可用于测定糖原磷酸化酶的活性。在经典方法中，酶促反应被逆向驱动，朝向糖原合成的方向进行，如下所示：
(葡萄糖)n + 葡萄糖-1-磷酸 → (葡萄糖)n+1 + Pi
在设定的时间间隔内，取出反应混合物的等分试样，定量测定所释放的磷酸盐含量12，13。据我们经验，该检测方法的应用受到一定限制，原因在于许多市售的葡萄糖-1-磷酸制剂中已含有可直接测得的游离磷酸盐，同时磷酸化酶作用又需要较高浓度的葡萄糖-1-磷酸。因此，我们常规采用另一种替代性检测方法，通过测定磷酸化酶降解糖原时所释放的葡萄糖-1-磷酸来实现检测13。该方法采用如下所示的偶联反应体系。
(葡萄糖)n + Pi → (葡萄糖)n-1 + 葡萄糖-1-磷酸
葡萄糖-1-磷酸 → 葡萄糖-6-磷酸
葡萄糖-6-磷酸 + NADP+ → 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H+
葡萄糖-1-磷酸在磷酸葡萄糖变位酶的作用下转化为葡萄糖-6-磷酸，后者随后被氧化为6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时伴随NADP+还原为NADPH。下文方案第2节中详述的操作步骤源自Mendicino等14以及Schreiber &amp;#38; Bowling15所描述的方法。该检测可连续进行，通过测定340 nm处随时间增加的吸光度，从而确定反应速率。
分光光度法测定去分支酶活性依赖于检测该酶作用于磷酸化酶极限糊精所释放的葡萄糖含量16。该化合物是通过磷酸化酶对糖原进行彻底处理而制得。由于糖原磷酸化酶的作用在距离α1,6-分支点4个葡萄糖残基处停止，因此极限糊精中的糖原外链被缩短至约4个葡萄糖残基。本文所述的磷酸化酶极限糊精制备方法，源自Taylor等17以及Makino &amp;#38; Omichi18所建立的实验流程。
去分支化是一个两步过程。双功能去分支酶的4-α-葡聚糖转移酶活性首先将三个葡萄糖残基从分支点转移至附近α1,4-连接葡萄糖链的非还原末端。随后，分支点上剩余的单个α1,6-连接葡萄糖残基被α1,6-葡萄糖苷酶活性水解19。该检测通常以终止法进行，在特定时间（或一系列时间点）后释放的葡萄糖通过如下所示的偶联酶法进行测定：
(葡萄糖)n → (葡萄糖)n-1 + 葡萄糖
葡萄糖 + ATP → 葡萄糖-6-磷酸 + ADP
葡萄糖-6-磷酸 + NADP+ → 6-磷酸葡萄糖酸内酯 + NADPH + H+
测定生成的NADPH可反映葡萄糖的产量。下文方案第3节所述步骤基于Nelson等人16所描述的方法。与其他依赖NADH/NADPH消耗或生成的方法类似，该检测方法具有较高的灵敏度。然而，若存在淀粉酶或其他葡萄糖苷酶，这些酶亦可从磷酸化酶极限糊精中释放出游离葡萄糖，从而造成显著干扰（见讨论部分）。
分支酶活性的比色测定依赖于以下事实：葡萄糖的α1,4-糖苷键链可形成螺旋结构，与碘结合生成有色复合物20。所形成复合物的颜色取决于α1,4-糖苷键链的长度。因此，由长而基本无分支的α1,4-连接葡萄糖链组成的直链淀粉与碘形成深蓝色复合物。相比之下，糖原的外链通常仅由6至8个葡萄糖残基组成，与碘形成橙红色复合物。若将直链淀粉溶液与分支酶共同孵育，分支酶在直链淀粉中引入分支，导致生成更短的α1,4-连接葡萄糖链。因此，直链淀粉/碘复合物的吸收峰向较短波长方向移动。本文所述方法源自Boyer &amp;#38; Preiss21的详细方案，分支酶活性通过测定直链淀粉/碘复合物在660 nm处随时间推移吸光度的降低来定量。
从上述讨论中可以明显看出，碘与α1,4-葡萄糖链形成的复合物颜色随链长变化，这意味着糖原/碘复合物的吸光度光谱应随糖原分支程度的不同而变化。事实确实如此，分支较少或外链较长的糖原比分支较多或外链较短的糖原在更长的波长处吸收光。因此，碘染色反应可用于快速获得关于糖原分支程度的定性数据22。当糖原与碘形成复合物时，所产生的橙棕色通常并不十分明显。然而，通过加入饱和氯化钙溶液可增强显色效果22。这种方法的灵敏度可提高约10倍，从而能够方便地分析微克量级的糖原。下文方案第4节所述的分支程度测定方法改编自Krisman建立的实验流程22。该检测只需将糖原样品与碘溶液和氯化钙混合于比色皿中，并采集330 nm至800 nm范围内的吸收光谱即可完成。随着分支程度降低，吸光度最大值向更长波长方向移动。
总体而言，本文所述方法为评估糖原代谢关键酶的活性以及获取糖原分支程度的定性数据提供了简单可靠的手段。

<table><tbody><tr><td>来自糯玉米的支链淀粉（无直链淀粉）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A0456</td><td></td></tr><tr><td>直链淀粉</td><td>Biosynth Carbosynth</td><td>YA10257</td><td></td></tr><tr><td>ATP，二钠盐</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3377</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖-1,6-二磷酸，钾盐</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6893</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖-6-磷酸，钠盐</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，I型，来自酵母</td><td>MilliporeSigma</td><td>10127655001</td><td></td></tr><tr><td>糖原，II型，来自牡蛎</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8751</td><td></td></tr><tr><td>己糖激酶</td><td>MilliporeSigma</td><td>11426362001</td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯酸酯比色皿，1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-128</td><td>必须使用甲基丙烯酸酯材质，因为某些实验在340 nm或更低波长下进行</td></tr><tr><td>&amp;beta;-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0505</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型二钠盐</td><td>MilliporeSigma</td><td>43420</td><td></td></tr><tr><td>核苷5'-二磷酸激酶</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0379</td><td></td></tr><tr><td>磷酸烯醇式丙酮酸，单钾盐</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>来自兔肌肉的磷酸葡萄糖变位酶</td><td>MilliporeSigma</td><td>P3397</td><td></td></tr><tr><td>来自兔肌肉的磷酸化酶A</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1261</td><td></td></tr><tr><td>来自兔肌肉的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶酶混合物</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0294</td><td></td></tr><tr><td>UDP-葡萄糖，二钠盐</td><td>MilliporeSigma</td><td>U4625</td><td></td></tr></tbody></table>

真核生物糖原代谢研究的分光光度法

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

糖原是由从细菌到动物等多种生物合成的葡萄糖储存形式。该分子由α1,4-连接的葡萄糖残基组成的线性链构成，并通过引入α1,6-连接形成分支结构。要理解糖原的合成与降解如何被调控，以及糖原如何形成其特有的分支结构，必须研究糖原储存相关的酶。然而，目前研究这些酶活性最常用的方法通常依赖于某些并非所有研究人员都能获得的试剂或技术。本文介绍了一系列技术方法，这些方法在操作上简便、成本低廉，但仍能有效揭示糖原储存的调控机制。这些技术需要使用波长范围为330至800 nm的分光光度计，并假设使用者将采用一次性塑料比色皿进行实验。不过，这些方法易于按比例放大，也可修改后适用于微孔板读数仪，从而实现高通量平行分析。

糖原合酶活性测定 
图1展示了使用纯化酶进行糖原合酶活性检测的代表性结果。在图A中，经过短暂的滞后期后，340 nm处的吸光度在约12分钟的时间内呈线性下降。图1A中吸光度变化速率约为0.12吸光度单位/分钟。吸光度变化速率在约0.010至约0.20吸光度单位/分钟之间为最佳，应调整所添加糖原合酶的用量，使反应速率落在该范围内。在图B中，显示了在检测中加入过多糖原合酶的结果，反应在前2分钟内即已完成。对照反应（本例中不含糖原合酶）在时间过程中未观察到可测的吸光度下降。如讨论部分所述，本检测中使用组织匀浆完全可行，但需增设额外的对照反应。
本方案采用牡蛎糖原作为底物，该底物适用于多种不同来源的糖原合酶。但需要注意的是，糖原合酶的活性可能因所用糖原类型的不同而表现出较大差异。因此，在开展任何深入研究之前，建议先对多种类型的糖原进行比较筛选。
该方案在反应体系中加入了葡萄糖-...

介绍了一种利用可见光范围内的简易分光光度计测定糖原代谢关键酶活性的技术。

糖原是由从细菌到动物等多种生物合成的葡萄糖储存形式。该分子包含线性链……

这些实验方案具有重要意义，因为它们避免了放射性同位素的使用，消除了可能阻碍许多研究人员研究糖原代谢酶的障碍。所描述的实验步骤成本低廉，仅需使用普通的分光光度计即可完成。首先测定糖原合酶活性时，将先前配制的UDP-葡萄糖、ATP、磷酸烯醇式丙酮酸和NDP激酶的储备溶液置于冰上解冻。将水浴预热至30摄氏度。当储备液准备好后，根据糖原合酶检测的数量，按照文本方案中的描述，将试剂加入15毫升试管中，制备足够量的检测混合液。通过用水替代反应混合物中的NADH来制备空白反应，并将反应液转移至一次性丙烯酸甲酯比色皿中。使用空白反应在340纳米波长下将分光光度计调零。取770微升反应混合物至1.5毫升离心管中，依次向管中各加入2微升NDP激酶和丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶混合液。混匀后，将离心管轻轻放入30摄氏度水浴中孵育3分钟，以预热反应混合物。然后加入含有糖原合酶的样品30 µL，样品溶于pH 7.8的20 mmol/L Tris缓冲液中，轻轻混匀，再将反应混合物转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中。将比色皿放入分光光度计，于340 nm波长处以定时间隔记录吸光度，持续10至20分钟。随后，以时间为横坐标，绘制吸光度随时间变化的曲线。为测定释放的葡萄糖，将加热后糖原样品的40微升上清液转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中。然后按照文稿中的描述，加入三乙醇胺、盐酸硫酸镁缓冲液、NADP ATP混合液以及水的测定体积。通过轻轻吹吸混合液，注意避免产生气泡。向每个比色杯中加入 0.5 µL 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。用移液器混匀后，在室温下孵育 10 分钟，然后在 340 纳米处测定吸光度。接着，按照前述方法向每个比色杯中加入 0.5 µL 己糖激酶，混匀后孵育 15 分钟，再在 340 纳米处记录吸光度。然后在室温下继续孵育5分钟，随后测定吸光度。如果吸光度较15分钟时记录的数值有所增加，则继续孵育5分钟，再记录340纳米处的最终吸光度。为测定糖原分支度，取650微升碘-氯化钙显色试剂储备液与100微升水加入1.5毫升离心管中，充分混匀后转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中。将比色皿放入分光光度计中，在330至800纳米波长范围内进行扫描，以采集背景光谱。在另一个1.5毫升离心管中，加入650微升工作浓度的碘-氯化钙显色试剂和50微克牡蛎糖原，再加水定容至终体积750微升。充分混匀后，将溶液转移至一次性甲基丙烯酸甲酯比色皿中，采集330至800纳米范围内的吸收光谱。同样，按照之前所述方法，分别取50微克支链淀粉和30微克直链淀粉，获得其吸收光谱。为初步判断一种未表征糖原样品的支化结构，可将25至50微克糖原与650微升工作浓度的碘-氯化钙显色试剂混合，然后按照前述方法操作，获取吸收光谱。在糖原合酶活性检测中，观察到340纳米处的吸光度随时间呈线性下降。向测定中加入过多的糖原合酶会导致反应在前两分钟内即完成。不含糖原合酶的对照反应未显示出可测的吸光度下降。使用纯化酶进行的糖原磷酸化酶测定数据显示，其线性阶段持续三分钟。吸光度每分钟增加0.01至0.04个单位为最佳范围。在糖原去分支酶活性检测中，反应呈现至少持续10分钟的线性阶段。糖原分支酶活性检测的代表性数据展示了不含分支酶的对照样品与含有分支酶的反应体系之间吸光度的差异。该检测方法的动态范围较窄，如图所示。吸光度最大变化仅为0.4个吸光度单位，当吸光度变化达到约0.2个吸光度单位时，线性关系即已丧失。在糖原分支活性评估中，所用糖原、支链淀粉和直链淀粉的质量均表现出最大吸光度读数，约为0.7至0.8，各自在不同的吸光度峰值处达到最大值。糖原样品在约400纳米和460纳米处产生两个峰。碘-氯化钙显色试剂密度较高，因此在采集吸收光谱前，必须确保糖原样品与试剂充分混匀。

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生物化学

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