Name: 用于细菌筛选、选择和分离的可光降解水凝胶接口 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学习利用可光降解水凝胶和高分辨率光图案化技术快速分离特定细菌细胞的方法。该技术能够从复杂菌群中高效提取目标细胞，同时保持细胞活力和DNA纯度，为基因组分析提供可靠样本。

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本研究得到了美国国家科学基金会职业奖 #1944791 的支持。

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RRH 和 AJV 已就该技术申请了专利。其余作者声明不存在利益冲突。

本论文展示了光降解水凝胶在细菌筛选与分离中的应用。该材料与方法能够以简单且经济的方式实现高通量培养、对培养基和生长条件的精确控制，以及干净而精准的细胞提取。提取过程仅需配备图案化光照工具的荧光显微镜，且可按顺序进行，以分离多个目标细胞。每次提取耗时5–10分钟，单个水凝胶中最多已成功移除30个目标菌落。该方法的一个关键优势在于其可适应多种不同的检测形式，本文已通过从整体水凝胶和微孔阵列中进行筛选加以验证。在这两种形式中，分离过程均已成功用于分离表现出独特生长行为的细菌，以便在培养和显微观察后进行下游基因分型，这一能力对于连接细胞基因型与表型至关重要。迄今为止，从这些界面提取的细菌所进行的基因组表征包括：采用16S扩增子测序鉴定来自环境微生物组中产生 emergent 生长行为的多物种细菌集合18，以及通过全基因组测序成功鉴定突变文库中导致罕见生长特征的遗传突变19。
使用块状水凝胶进行细胞筛选和分离是最直接且简单的形式。将前体溶液混合后滴加在透明玻璃盖玻片上，可在25分钟内快速形成可光降解的块状水凝胶，从而将细胞包埋于三维细胞培养基质中，并可使用标准的正置或倒置荧光显微镜进行成像。因此，该方法有望被常规微生物学实验室所采用，即使这些实验室不具备微加工设备或相关专业技术。这种形式的一个缺点是，细胞在三维水凝胶中呈随机分布，因此在使用高倍物镜成像时，部分细胞可能位于焦平面之外；此外，若细胞克隆彼此过于靠近或存在垂直方向上的重叠，则提取操作可能变得困难。如文中所述，沉积一层薄水凝胶（&#60;13 μm）对于缓解这一问题至关重要。在此情况下，采用断续的十字形光照模式（图4B）更为理想，因为该模式可使细胞从水凝胶中释放出来，同时最大限度减少紫外线暴露，从而通过平板培养实现细胞的高效回收。
相比之下，微孔阵列格式提供了更为精确可控的界面，因为细菌细胞被分隔到离散的微孔中，每个微孔可作为独立的培养或共培养位点17,18,26。微孔的尺寸、间距和密度可通过标准的光刻技术精确制备。与整体水凝胶相比，由于细胞仅存在于预定义的位置，而非随机分散在整个水凝胶中，因此可以从微孔阵列中以更高的特异性提取细菌，且交叉污染的风险更低。此外，通过调节接种液中细菌细胞的浓度和比例，可控制微孔接种物的数量和组成，这一接种过程已在先前的研究中得到表征26，从而为筛选实验的设计提供了灵活性。采用微孔阵列格式进行筛选的主要缺点是微加工过程需要额外的时间和技术专长。据估计，每个阵列的微孔制备成本约为10美元，包括材料成本和洁净室使用费用。此外，微孔阵列传统上由硅材料制成，由于基底不透明，可能导致成像困难。而且，硅表面会产生较强的光散射，限制微孔内的成像效果，并在使用图案化照明工具的紫外光照射水凝胶时降低图案分辨率（如图8A、B所示）。已有研究在透明石英基底上制备了类似的微孔以克服此类限制27；然而，这种加工过程要困难得多。在此情况下，采用环形图案照射微孔边缘更为理想，可在释放游离细胞的同时尽量减少紫外线暴露。
无论采用何种形式，培养过程中最常见的问题是由于水凝胶溶胀导致其从底层基质上脱落。如果块状水凝胶出现此问题，应使用适当的表面表征技术（如XPS、ATR-FTIR、AFM等）验证基础玻璃盖玻片表面化学接合层（MTPS）中巯基的存在性、密度及分布均匀性。表面巯基密度过低（通常由表面功能化效率低下引起）会导致基质与水凝胶之间的相互作用减弱。若出现表面巯基化程度不足的情况，应检查MTPS溶液的稳定性。在进行MTPS处理前，需特别注意对玻璃载片进行充分清洗，以确保表面洁净，并在MTPS表面反应过程中确保使用无水甲苯（见实验方案第4部分）。对于微孔阵列，其表面无需进行巯基化处理，水凝胶通过部分填充微孔而实现固定，从而将水凝胶锚定在硅基底上17。若该系统中仍存在水凝胶脱落问题，可在阵列中刻蚀更多微孔或其他微尺度结构，以进一步将水凝胶锚定于基底，增强其附着强度。
无论采用何种形式，该技术的一个局限性在于水凝胶在细菌存在下的稳定性有限。已有研究指出，某些细菌（如 A. tumefaciens）可在5至7天内降解水凝胶17，19，从而限制了实验持续时间。目前正对细菌降解机制开展进一步研究；据推测，二丙烯酸酯单体所含的酯基团可能在细菌介导的水解和/或酶促降解作用下发生分解，这在其他体系中已有报道17。开发更稳定的水凝胶化学体系将延长细菌在水凝胶中的存活时间，并使筛选扩展至生长速率较慢的微生物。第二个局限性在于，两种形式下的细胞回收与提取均在开放环境中进行，导致提取体积相对较大（30–100 μL），易受外界污染。因此，必须注意确保目标菌落含有足够数量的细胞，同时尽量减少提取液的体积。为获得足够用于平板培养、回收或DNA材料提取的细胞数量，观察发现，在块体水凝胶中，细胞需培养至菌落直径至少达到10 µm。为降低细胞提取所需的体积，观察表明，使用微升注射器和导管（图2）比移液更为高效。导管可更精确地从释放点吸取分离物，所需溶液体积更少，且降低了污染风险。
未来的研究工作将聚焦于理解水凝胶力学性能对细胞生长的影响，因为通过选择不同分子量的聚乙二醇（PEG）基&#160;单体前驱物，可精确调控这些水凝胶的力学特性28，而力学相互作用可能在细菌行为中发挥重要作用29。由于该水凝胶材料可方便地整合到多种不同的系统与装置中，后续发展也集中于将其集成至微流控系统。这将使提取溶液的体积从传统开放式收集方式所需的30–100 μL减少至飞升至皮升级别。更小的溶液体积将显著降低潜在污染风险，并推动该方法向单细胞分离与表征方向发展。

从复杂且异质的环境中分离出具有独特行为的细胞，是获取生物学遗传信息的基础1。在微生物学中，观察后对稀有或独特微生物的选择与分离，在许多需要将基因组信息与可观察表型信息关联起来的应用中变得尤为重要。这些应用包括从突变体文库中筛选表型稀有的菌株2，从复杂的微生物群落中筛选关键微生物3,4，以及从同基因型群体中筛选表型稀有但重要的细菌。从细菌群体中分离出“可存活但不可培养”的细胞（VBNC）即为后者的典型例子，其中具有VBNC表型的细胞通常以1:102至1:105&#160;的比例隐藏于细菌群体中5,6。&#160;由于细菌分离普遍存在困难，目前对许多表型稀有的微生物仍知之甚少。这些局限性凸显了细胞分离技术的重要性：首先需从混合群体中识别出目标细胞，随后将其捕获并分离，以便进行后续的分子分析7。
细胞分离的一些最常用方法包括流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）8、免疫磁珠分离9,10以及微流控技术11。尽管这些分离方法具有较高的应用价值，但它们也存在一些局限性，限制了其广泛应用。例如，FACS 可在单细胞水平上实现常规的微生物分离，用于后续基因组分析3，但其应用常受限于设备可及性、高昂成本以及下游污染问题11。基于微流控的技术（如微流控流式细胞术）已受到广泛关注，与传统流式细胞术相比，该方法可显著减少所需样本体积12。然而，从微流控装置中分离并回收单个或少量细胞通常具有挑战性，往往需要更复杂的系统配置和装置设计13。许多基于微流控的方法在细胞进入装置并被观测之前即对其进行基因型表征14，这在进行功能筛选时限制了所观察到的独特物种数量。鉴于这些局限性，为了在更多实验室中广泛使用，亟需进一步开发适用于细胞筛选与分离的实用方法和材料。
本文介绍了一种基于材料的新型细菌筛选与分离方法。该方法利用光降解水凝胶实现细胞包封、培养、显微观察，并可按需释放和回收具有独特表型的目标细菌。水凝胶设计为10 nm孔径结构，其每个交联点均含有o-硝基苄基团15。该材料可在允许营养物质和代谢废物扩散以支持细胞培养的同时，包封或截留细胞用于观察。通过正置显微镜将材料暴露于图案化的365 nm紫外光源下，可引发o-硝基苄基团的光裂解，从而实现水凝胶的局部降解16,17。降解过程可触发特定细胞的选择性释放，以便进行后续分析，包括基因组学以及潜在的蛋白质组学和转录组学分析。该实验装置与操作流程相对简单、成本低廉，且易于在微生物学实验室中推广应用。实验仅需通过水凝胶形成实现细胞包封，利用正置明场与荧光显微镜观察被捕获的细胞，并对目标细胞施加图案化紫外光照以实现回收。
这种基于材料的筛选方法的一个关键优势是其可适应不同的筛选形式。在最基本的形式中，该材料可用于将异质细胞群体包埋于大体积水凝胶中进行筛选。随后观察细胞是否具有目标表型，并取出感兴趣的单个细胞进行基因组表征。在更复杂的格式中，该材料还可整合到芯片实验室装置中，以实现从装置特定区域精确释放和回收细胞。本文描述了这两种格式，二者均已推动了近期微生物筛选与选择的新应用17,18,19。本方法以模式革兰氏阴性菌（Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens）和模式革兰氏阳性菌（Bacillus subtilis）为例进行演示，并已顺利拓展至多种其他细菌。

<table><tbody><tr><td>(3-巯丙基)三乙氧基硅烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>175617-25G</td><td>&gt; 95%</td></tr><tr><td>Alconox 洗涤剂粉末</td><td>Alconox</td><td>1104</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Fisher Chemical</td><td>A702-500</td><td>分析纯级颗粒</td></tr><tr><td>Autoclave SK300C</td><td>Yamato Scientific</td><td>18016</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis 1A1135</td><td>枯草芽孢杆菌遗传保藏中心</td><td>1A1135</td><td></td></tr><tr><td>明场直立显微镜</td><td>奥林巴斯株式会社</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>无水氯化钙</td><td>Fisher Chemical</td><td>C614-500</td><td>干燥器用颗粒，4-20目</td></tr><tr><td>离心机 5702</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸一水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>ACS试剂， &gt; 99.0%</td></tr><tr><td>D-葡萄糖（右旋糖）</td><td>VWR Amresco 生命科学</td><td>0188-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>DNA纯化试剂盒</td></tr><tr><td>DOWSIL 184 硅酮弹性体基础剂</td><td>道康宁有机硅公司</td><td></td><td>储存温度：-30-60 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DOWSIL 184 硅酮弹性体固化剂</td><td>道康宁有机硅公司</td><td></td><td>储存温度： &amp;lt; 32 ℃</td></tr><tr><td>EPOCH2 微孔板分光光度计</td><td>BioTek Instruments</td><td>EPOCH2</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 ATCC 25922</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R19020</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，无水</td><td>Fisher Chemical</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12540A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest 优质载玻片，无盖片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-500ML</td><td>含抑制剂，30 wt% 溶于 H2O</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini</td><td>基准测试</td><td>E5-0014-01</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Avantor Performance Materials, Inc.</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td>ACS试剂， &gt; 99.8%</td></tr><tr><td>NanoDrop One 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>压缩氮气</td><td>Matheson</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>氧气等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>季戊四醇四(巯基乙基)聚氧乙烯（4臂-PEG）</td><td>NOF America Corporation</td><td>PTE-100SH</td><td>Sunbright-PTE-100SH</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓缩液</td><td>VWR Amresco 生命科学</td><td>K813-500ML</td><td>储存于15至25℃之间 &amp;deg;C&amp;ndash;30 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）Slygard 184</td><td>道康宁</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Polygon400</td><td>Mightex</td><td>DSI-D-000</td><td></td></tr><tr><td>高级显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td>25 x 75 x 1 毫米</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma生命科学</td><td>S5886-500G</td><td>生物试剂，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>BioXtra &gt; 98%，无水颗粒</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505-250G</td><td>分子生物学用 BioUltra， &gt; 99.0%（T）</td></tr><tr><td>不锈钢测厚仪</td><td>Precision Brand Products</td><td>77739</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>甲苯，无水，99.8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-1L</td><td>无水的， &gt; 99.8%</td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷（TPS），97%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td>用于微生物学</td></tr><tr><td>Super Nuova 数字式电热板搅拌器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S131825</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Fischer Scientific</td><td>FS-110H</td><td></td></tr></tbody></table>

光可降解水凝胶界面用于细菌筛选、选择与分离

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

生物学家长期以来一直致力于理解表型与基因型之间的关系。为了更深入地认识这种联系，开发能够将显微镜下单细胞筛选与高纯度细胞分离相结合的技术至关重要，以便进行后续的遗传学分析。本文介绍了利用光降解性聚乙二醇水凝胶，从异质性细胞群体中筛选并分离具有独特生长表型细菌的方法。该方法首先将细胞包埋于水凝胶中，随后进行培养和显微观察，再利用高分辨率光图案化工具实现对水凝胶降解的时空控制，从而将目标细胞释放到溶液中以便回收。通过应用不同的光照图案，可以控制所提取细胞的形态，例如采用环形或十字形图案可在尽量减少紫外线直接照射的情况下回收细胞，从而降低对分离菌株DNA的损伤。此外，该光图案化工具可调节光照剂量，以实现不同程度的水凝胶降解和细胞释放速率。其高分辨率降解能力使得细胞回收具有微米级的空间精度。本文展示了该材料在整体水凝胶以及微加工芯片实验室装置中用于筛选和回收细菌的应用。该方法成本低廉、操作简便，可广泛应用于微生物学中的常规及前沿研究，包括从突变体文库中分离具有罕见生长特征的细菌菌株，以及分离具有新出现表型的细菌群落用于基因组学表征。

为了研究紫外光触发水凝胶可控降解以实现细胞释放的能力，首先将水凝胶封装在巯基化盖玻片上，且不含有细菌。每个水凝胶分别暴露于三种不同强度和照射时间的圆形光图案下，重复三次。在每种光强度照射后计算水凝胶降解的百分比，随后通过将悬挂的巯基与荧光素-5-马来酰亚胺染料偶联进行荧光成像，以定量测定照射时间19,24。这两个参数对水凝胶降解影响的代表性示例如图3所示。显然，由图案化照明工具提供的图案化光照能够以特定时空分辨率控制水凝胶的降解，该分辨率可实现仅释放少量细胞。
<img alt="光降解曲线，降解率 vs. 暴露时间，光强效应，插图为微结构图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：水凝胶降解的调控。通过图案化光照工具可调节紫外光剂量及水凝胶的降解速率。（插图）选择两种不同的光强进行图案化水凝胶降解。经365 nm紫外光照射后，使用荧光素-5-马来酰亚胺对水凝胶进行标记，用于荧光成像。转载（改编）自Fattahi等人的研究19，经美国化学会2020年版权许可。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为进行细胞提取，采用了不同的光照模式以研究细胞释放情况（图4）。此处，将Agrobacterium细菌细胞包埋于修饰有巯基的玻璃盖玻片上的块状水凝胶中，并培养形成微米级菌落。随后在明场显微镜下观察水凝胶，对目标微菌落施加不同的紫外光照射模式。结果发现，不同的光照模式会影响释放细胞的形态。这一特性在多种应用中可能具有优势。例如，对目标菌落周围施加环形光照，可使整个菌落以仍被保护性PEG水凝胶包裹的形式释放，同时避免细胞直接暴露于紫外光下（图4A），从而有助于保持细胞活性并便于后续纯化。相比之下，若将菌落部分或全部暴露于紫外光下，则可将细胞以聚集的细胞团簇形式（图4B）或以游离的单个细胞形式（图4C）提取出来。
<img alt="细胞回收过程中紫外光图案曝光的显微镜图像：环形、断裂十字形、十字形图案。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：对回收细胞形态的控制。（A）使用环形图案释放被聚乙二醇（PEG）基质保护的完整细胞克隆。（B）使用断裂十字形图案释放细胞团块。（C）使用十字形图案释放单个细胞。经许可转载（改编）自 Fattahi 等人19。​ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在包封实验方案中，细胞接种密度和水凝胶厚度均至关重要，因为这两个参数都会影响包埋于水凝胶中用于观察的细胞数量。为说明这一点，将A. tumefaciens细胞样品利用不同厚度的间隔片（薄型：12.7 µm；厚型：40 µm）包埋入两种不同厚度的水凝胶中，并按照既定方案进行培养和成像。使用较薄的水凝胶时，整个水凝胶内的微菌落密度达到90个菌落/mm2，且观察到菌落重叠极少（图5A）。相比之下，当水凝胶厚度超过12.7 µm时，菌落在垂直方向上出现重叠现象（图5B），可能导致提取过程中同时获取多个菌落。由于光图案具有二维特性，重叠的菌落可能在提取时造成交叉污染。例如，当目标为上方菌落时，其下方的菌落也可能被一并提取（图5C）。因此，建议在制备水凝胶时使用12.7 µm的间隔片。
<img alt="环形光照下的细胞活力分析；荧光与明场显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：水凝胶厚度影响提取纯度。（A）使用厚度为 12.7 µm 的间隔片形成水凝胶时，细胞集落可在同一个 10 倍焦平面内形成。（B）若使用厚度大于 12.7 µm 的间隔片，在 10 倍放大下可观察到细胞集落的重叠现象。（C）在细胞释放过程中，若存在集落重叠，则可能发生交叉污染：（i）使用环形图案释放目标细胞集落；（ii）目标细胞集落从水凝胶上脱落；（iii）在目标集落下方的光照区域中观察到第二个位于下层的集落。该下层集落也会被移除，从而导致交叉污染。经许可转载（改编）自 Fattahi 等人19，版权所有 2020 年美国化学会。​ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
鉴于紫外线可能对细菌造成损伤，进一步研究了不同紫外线微图案对模式革兰氏阳性菌（B. subtilis）和模式革兰氏阴性菌（E. coli）细胞活力的影响。将上述细菌分别包埋于块状水凝胶中，并按照标准操作流程培养成微米级菌落，以验证其与水凝胶的相容性。随后，选取尺寸相当的目标微菌落（直径为 26 ± 1 μm），在恒定光照剂量（168 mJ/mm2）下进行照射，光照图案包括圆形图案（使整个微菌落暴露于紫外线下）和十字形图案（仅降解水凝胶边缘，从而最小化细胞的光照暴露）。之后回收细胞并进行涂布，以定量测定每个菌落回收的 CFU/mL。结果显示，两种图案处理下的细胞回收量无显著差异（图 6A）。为进一步考察所提取细胞的纯度，从 E. coli 样品中提取 DNA，并使用紫外-可见分光光度计进行分析。两种图案处理所得 DNA 的质量均表现为 A260/A280 比值介于 1.8 至 2.0 之间（图 6B），处于基因组测序的理想范围25。这表明，在所述条件下用于释放的紫外线图案对从块状水凝胶中回收的活细胞数量以及提取后基因组 DNA 的质量均无明显影响。
<img alt="比较大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的生长、DNA 质量及光照模式暴露结果的柱状图与显微照片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图 6：不同光照模式对从整体水凝胶中释放的细菌细胞活力和 DNA 质量的影响。（A）使用十字形和圆形图案提取后，E. coli 和 B. subtilis 的细胞回收水平。本实验中，提取自直径相同的球形菌落（26 µm ± 1 µm）以确保每个菌落释放的细胞数量相等。随后将提取液涂布培养以计算每种图案获得的 CFU/mL。统计分析显示，E. coli 和 B. subtilis 在十字形与圆形图案之间获得的 CFU/mL 无显著差异（P 值 > 0.05，两种菌株的 n = 6）。（B）使用十字形和圆形图案分离的 E. coli 细胞 DNA 质量的分光光度法定量。此处，统计分析未显示所用图案在 DNA 质量上存在显著差异（P 值 > 0.05，n = 6）。（C）经受十字形和圆形图案照射、直径相等的菌落的明场图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
微孔阵列提供了一种替代性的芯片实验室筛选平台，相较于整体水凝胶，具有更精确可控的筛选特性。例如，微孔阵列可将细菌接种于独立的培养位点，并精确控制接种液中的细胞数量。微孔的几何特征（如孔深和孔径）也可通过标准的微加工方法进行调控。得益于这些优势，微孔已被广泛用于研究空间限制条件下细菌的生长行为26，并最近被用于发现不同细菌种类在微尺度共限制条件下存在的共生与拮抗相互作用18。从微孔中提取细胞以进行基因组分析（如16S扩增子测序）对于这些应用至关重要。使用相同的水凝胶材料时，可通过紫外光照射含有目标细胞的微孔，照射模式可选择圆形或环形。后者仅在微孔边缘引发水凝胶降解，从而避免对细胞造成直接辐照损伤。为验证该方法，将表达mCherry的A. tumefaciens细胞接种至微孔中，并将水凝胶固定于微孔阵列上。细胞培养后，分别采用圆形或环形图案进行紫外照射，随后用荧光素-5-马来酰亚胺染料对膜结构进行染色。双色荧光成像结果显示，两种照射模式下，微孔内的细胞及其膜结构均被有效去除17。与整体水凝胶体系不同的是，此处观察到的细胞提取仅以细胞簇的形式出现18。
<img alt="荧光显微镜图像；显示红色和蓝色荧光的细胞。水平与垂直截面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：共聚焦显微镜代表性图像，显示光照模式对微孔阵列中细胞分离的影响。 (A直径为的微孔 40 µm 含有细菌（红色）的接种与培养后样本。B使用圆形和环形图案进行光照（蓝色）。C) 红色荧光减弱表明细胞已从受照射的孔中移除。D照射后膜和细菌的双色荧光图像，显示目标孔中水凝胶（绿色）和细菌（红色）均被清除。EZ轴堆叠，目标孔的双色荧光图像。（中的红线D) 表示在 ( 中成像的 xz 平面E)，以及（E）表示在（中成像的 xy 平面D). 图像中的样品（C-E) 洗涤以去除脱落的细胞，随后固定并成像。比例尺 = 40 µm. 重新印制（改编）自 van der Vlies 等人，经许可。17. 版权所有 2019 美国化学会 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
为定量分析以该方式提取后细菌细胞的活力和DNA质量，将 B. subtilis 和 E. coli 细胞接种、培养后，分别采用圆形和环形图案从微孔阵列中释放（图8A，B）。释放的细胞随后接种于ATGN琼脂平板上，并对提取细胞的DNA质量进行定量分析。为确保每次提取时细胞数量一致，选择荧光强度相近（约6000 A.U.）因而细胞数量相近的微孔进行释放。采用圆形图案提取的活菌数量与采用环形图案提取的活菌数量相比，两种细菌之间均无显著差异（图8C）。同样，两种细菌在圆形与环形图案之间的DNA质量水平也无显著差异（图8D）。因此，与在整体水凝胶中的研究结果类似，在本实验指定的强度和照射时间下，紫外光照射对从微孔阵列中提取细胞的活力和DNA质量影响可忽略不计。这些结果表明，活细菌细胞可从微孔中被选择性回收，并可用于后续分析，且损伤极小。
<img alt="细菌生长与DNA质量分析；模式形成；CFU/mL与DNA纯度图；实验" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图8"> 
图8：不同光照模式对从微孔阵列释放的细菌细胞活力和DNA质量的影响。（A，B）对于E. coli和B. subtilis，分别采用圆形图案和环形图案从10 µm微孔中提取细胞。本实验中用于细胞提取的圆形图案直径为10 µm，环形图案内径为10 µm、外径为20 µm。使用相同直径的微孔以确保从每个微孔释放的细胞数量一致。（C）将提取液涂布培养以计算每种光照模式下获得的CFU/mL。统计分析显示，E. coli和B. subtilis在圆形与环形图案之间获得的CFU/mL无显著差异（P值 > 0.05，两种菌株n = 6）。（D）采用分光光度法测定使用圆形和环形图案提取的E. coli和B. subtilis细胞的DNA质量。此处统计分析也未显示所用图案在DNA质量上存在显著差异（P值 > 0.05，两种菌株n = 6）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：微孔阵列的设计与制备。 （A）采用标准的微加工技术在硅晶圆上制备微孔阵列。（B）每个基底包含7 x 7排列的微孔，孔径为10 µm，深度为20 µm，间距为30 µm。（C）每个阵列包含225个微孔。该图已根据Barua等人的研究修改18。版权所有 2021 Frontiers Media。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

报道了利用高分辨率光刻工具通过光降解水凝胶分离细菌细胞的方法。综述了该方法的关键实验步骤、结果及其优势。该方法能够从异质性菌群或种群中快速、低成本地分离出具有稀有或独特功能的目标细菌。

生物学家长期以来一直致力于理解表型与基因型之间的关系。为了更深入地认识这种关联，至关重要的是……

本方案旨在快速从筛选界面分离细胞，用于基因组表征，这一能力具有重要意义，因为它可将宏观上可观察的细胞特征与基因组信息相结合。利用该技术，可简便地以高空间定位精度从筛选界面分离目标细菌细胞。该水凝胶可应用于其他筛选界面。该水凝胶材料可轻松整合至微流控通道中，用于按需从微流控装置中回收细胞。首先，用所需细胞密度接种交联缓冲液。在0.5毫升微量离心管中，加入12.5 µL交联缓冲液和5.6 µL PEG ONB二丙烯酸酯溶液，配制水凝胶前体溶液。最后，向混合物中加入 6.9 µL 前臂 PEG 巯基溶液。进行细胞包封时，将巯基化处理的基底盖玻片置于洁净的培养皿中，并在盖玻片相对的两侧各放置一个间隔片。用胶带将间隔片固定在培养皿上，以固定其在基底盖玻片上的位置。在非反应性的全氟烷基化玻璃载片上加入所需体积的前体溶液后，将载片放置在底部盖玻片上，并于室温下静置25分钟，使水凝胶完全形成。凝胶完成后，轻轻移除全氟烷基化玻璃载片。将基质放入含有添加了抗生素的ATGN培养基的60 mm × 15 mm培养皿中。将OD600为0.1的700微升细菌细胞悬液接种至微孔阵列基底上，并按照先前所述方法，使用12.5微升pH为8的磷酸盐缓冲液ATGN配制水凝胶前体溶液。用移液器吸取12.5微升前体溶液滴加至一块非反应性全氟烷基化玻璃载片上，在已接种细胞的微孔阵列基底相对两侧放置两个38微米的钢制间隔片。然后将带有前体溶液液滴的全氟烷基化玻璃载片翻转，将液滴置于微孔基底中央。室温孵育25分钟后，水凝胶形成，此时轻柔地将玻璃盖玻片从微孔基底上取下，并将基底放入含有添加抗生素的ATGN培养基的培养皿中。将样品置于PDMS支架中，并在样品上方加入指定培养基，以防止样品脱水，并为释放的细胞提供载体溶液。将校准镜调整到位后，调节显微镜焦距，以获得水凝胶或微孔阵列中菌落的清晰图像，并进行观察，识别感兴趣的菌落或微孔。在此处设计光斑图案，同时通过相机视图观察样品内的菌落，以测试不同图案的细胞提取效果，并保存设定的图案。然后选择会话控制部分，在以图案化照明工具产品名称命名的标签页下添加已保存的序列。选择激发该图案的选项，以查看并调整所需的曝光位置。接下来，在LED控制选项卡下将光强调整为60%，曝光时间调整为40秒，并启动曝光过程。通过实时明场模式监测水凝胶的降解情况，以确保细胞释放。为收集释放的细胞，将显微镜滤光片从明场切换至TRITC，以便肉眼观察样品的曝光区域。确定暴露区域后，将管路末端置于辐照位置，然后将显微镜滤光片切换回明场模式，以实时监测细胞的回收过程。使用连接在管路另一端的注射器小心吸取含有释放细胞的200 µL溶液，并将该溶液转移至1.5 mL离心管中，用于DNA分析或接种培养。在从整体水凝胶中提取细胞时，采用了不同的紫外光微图案，这些图案影响了所释放细胞的形态。以环形图案进行紫外光照射，导致被包裹在保护性 PEG 水凝胶中的整个菌落被释放出来。相比之下，通过将菌落的部分或全部暴露于紫外光下，可获得聚集的细胞簇或游离的单个细胞。细胞接种密度和水凝胶厚度对于细胞包封至关重要。较薄的水凝胶形成了微小菌落，且菌落间重叠极少；而较厚的水凝胶则导致菌落相互重叠，可能导致提取到多个菌落。由于光斑图案的二维特性，菌落重叠在提取过程中可能引起交叉污染。当靶向顶部菌落时，其下方的菌落也会被一并提取。还评估了不同紫外光微米图案对细胞活力的影响。当微米级细胞集落暴露于受控剂量的紫外光下，无论是圆形还是十字形图案，细胞恢复和DNA纯度均未受到影响。通过该方法可成功从微孔阵列中回收细胞，共聚焦显微镜的代表性图像显示，在圆形和环形图案照射后，细胞以相应的图案被去除。从微孔阵列中提取后，评估了细胞活力和DNA含量。暴露模式对活细胞数量和DNA质量均无影响，表明可从微孔中选择性回收活细菌细胞且损伤最小，同时能够以高纯度提取其DNA，用于后续基因组分析。在移除全氟烷基化盖玻片之前，务必始终检查水凝胶是否已形成。放置水凝胶沉积用的间隔片以及使用管路提取细胞时，需要精确和细致的操作。

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