光可降解水凝胶界面用于细菌筛选、选择与分离

本方案旨在快速从筛选界面分离细胞，用于基因组表征，这一能力具有重要意义，因为它可将宏观上可观察的细胞特征与基因组信息相结合。利用该技术，可简便地以高空间定位精度从筛选界面分离目标细菌细胞。该水凝胶可应用于其他筛选界面。

该水凝胶材料可轻松整合至微流控通道中，用于按需从微流控装置中回收细胞。首先，用所需细胞密度接种交联缓冲液。在0.5毫升微量离心管中，加入12.5 µL交联缓冲液和5.6 µL PEG ONB二丙烯酸酯溶液，配制水凝胶前体溶液。

最后，向混合物中加入 6.9 µL 前臂 PEG 巯基溶液。进行细胞包封时，将巯基化处理的基底盖玻片置于洁净的培养皿中，并在盖玻片相对的两侧各放置一个间隔片。用胶带将间隔片固定在培养皿上，以固定其在基底盖玻片上的位置。

在非反应性的全氟烷基化玻璃载片上加入所需体积的前体溶液后，将载片放置在底部盖玻片上，并于室温下静置25分钟，使水凝胶完全形成。凝胶完成后，轻轻移除全氟烷基化玻璃载片。将基质放入含有添加了抗生素的ATGN培养基的60 mm × 15 mm培养皿中。

将OD600为0.1的700微升细菌细胞悬液接种至微孔阵列基底上，并按照先前所述方法，使用12.5微升pH为8的磷酸盐缓冲液ATGN配制水凝胶前体溶液。用移液器吸取12.5微升前体溶液滴加至一块非反应性全氟烷基化玻璃载片上，在已接种细胞的微孔阵列基底相对两侧放置两个38微米的钢制间隔片。然后将带有前体溶液液滴的全氟烷基化玻璃载片翻转，将液滴置于微孔基底中央。

室温孵育25分钟后，水凝胶形成，此时轻柔地将玻璃盖玻片从微孔基底上取下，并将基底放入含有添加抗生素的ATGN培养基的培养皿中。将样品置于PDMS支架中，并在样品上方加入指定培养基，以防止样品脱水，并为释放的细胞提供载体溶液。将校准镜调整到位后，调节显微镜焦距，以获得水凝胶或微孔阵列中菌落的清晰图像，并进行观察，识别感兴趣的菌落或微孔。

在此处设计光斑图案，同时通过相机视图观察样品内的菌落，以测试不同图案的细胞提取效果，并保存设定的图案。然后选择会话控制部分，在以图案化照明工具产品名称命名的标签页下添加已保存的序列。选择激发该图案的选项，以查看并调整所需的曝光位置。

接下来，在LED控制选项卡下将光强调整为60%，曝光时间调整为40秒，并启动曝光过程。通过实时明场模式监测水凝胶的降解情况，以确保细胞释放。为收集释放的细胞，将显微镜滤光片从明场切换至TRITC，以便肉眼观察样品的曝光区域。

确定暴露区域后，将管路末端置于辐照位置，然后将显微镜滤光片切换回明场模式，以实时监测细胞的回收过程。使用连接在管路另一端的注射器小心吸取含有释放细胞的200 µL溶液，并将该溶液转移至1.5 mL离心管中，用于DNA分析或接种培养。在从整体水凝胶中提取细胞时，采用了不同的紫外光微图案，这些图案影响了所释放细胞的形态。

以环形图案进行紫外光照射，导致被包裹在保护性 PEG 水凝胶中的整个菌落被释放出来。相比之下，通过将菌落的部分或全部暴露于紫外光下，可获得聚集的细胞簇或游离的单个细胞。细胞接种密度和水凝胶厚度对于细胞包封至关重要。

较薄的水凝胶形成了微小菌落，且菌落间重叠极少；而较厚的水凝胶则导致菌落相互重叠，可能导致提取到多个菌落。由于光斑图案的二维特性，菌落重叠在提取过程中可能引起交叉污染。当靶向顶部菌落时，其下方的菌落也会被一并提取。

还评估了不同紫外光微米图案对细胞活力的影响。当微米级细胞集落暴露于受控剂量的紫外光下，无论是圆形还是十字形图案，细胞恢复和DNA纯度均未受到影响。通过该方法可成功从微孔阵列中回收细胞，共聚焦显微镜的代表性图像显示，在圆形和环形图案照射后，细胞以相应的图案被去除。

从微孔阵列中提取后，评估了细胞活力和DNA含量。暴露模式对活细胞数量和DNA质量均无影响，表明可从微孔中选择性回收活细菌细胞且损伤最小，同时能够以高纯度提取其DNA，用于后续基因组分析。在移除全氟烷基化盖玻片之前，务必始终检查水凝胶是否已形成。

放置水凝胶沉积用的间隔片以及使用管路提取细胞时，需要精确和细致的操作。