用于细菌筛选、选择和分离的可光降解水凝胶接口
November 4th, 2021
据报道，使用光降解水凝胶通过高分辨率光拍工具分离细菌细胞。回顾了该过程的基本实验程序，结果和优点。该方法可以快速、廉价地分离出来自异质群落或种群的具有罕见或独特功能的靶向细菌。
该协议旨在从筛选界面中快速分离细胞以进行基因组表征，并且此功能非常重要，因为它可以将宏观可观察的细胞特征与基因组信息相结合。使用该技术，可以以操作简单的方式分离来自筛选界面的靶向细菌细胞，具有高空间位置。水凝胶可以在其他筛选接口中实现。
水凝胶材料可以很容易地掺入微流体通道中，以便从微流体装置中按需检索细胞。首先接种具有所需细胞密度的交联缓冲液。通过加入12.5微升交联缓冲液和5.6微升PEG ONB二丙烯酸酯溶液，在0.5毫升微量离心管中制备水凝胶前体溶液。
最后，向混合物中加入6.9微升前臂PEG硫醇溶液。对于水凝胶前体溶液中的细胞封装，将硫醇化的基础盖玻片放在干净的培养皿上，并在盖玻片的两个相对侧放置两个垫片。通过将垫片贴在培养皿上，将垫片固定在底盖上。
在非反应性全氟烷基化载玻片上加入所需体积的前体溶液后，将载玻片放在基盖玻片上，并允许水凝胶在室温下完成25分钟。凝胶化完成后，轻轻除去全氟烷基化的载玻片。将底物置于含有补充有抗生素的ATGN培养基的60×15毫米培养皿中。
在微孔阵列底物上播种700微升具有0.1 OD 600的细菌细胞悬浮液，并使用pH 8的12.5微升磷酸盐缓冲盐水ATGN使水凝胶前体溶液如前所述。在非反应性全氟烷基化载玻片上移取12.5微升的前体溶液，并将两个38微米的钢垫片放在微孔阵列基板的两个相对侧，用细胞接种。然后用前体溶液液滴倒置全氟烷基化的载玻片，并将液滴置于微孔基板的中间。
当水凝胶在室温下孵育25分钟后形成时，轻轻地从微孔底物中取出载玻片，并将底物置于含有补充有抗生素的ATGN培养基的培养皿中。将样品放入PDMS支架中，并将定义的培养基添加到样品顶部，以防止样品脱水，并为释放的细胞提供载体溶液。将校准镜就位后，调整显微镜焦点以获得水凝胶或微孔阵列内菌落的清晰图像，并检查以识别感兴趣的菌落或孔。
在这里，设计光模式，同时相机视图显示样品内的菌落，以测试不同的细胞提取模式并保存定义的模式。然后选择会话控制部分，在标题为图案照明工具产品名称的选项卡下添加保存的序列。选择用于刺激图案的选项以查看和调整所需的曝光位置。
接下来，在LED控制选项卡下将光强度调整为60%，将曝光时间调整为40秒，然后开始曝光过程。实时监测水凝胶降解和明场模式，以确保细胞释放。要收集释放的细胞，请将显微镜滤光片从明场更改为TRITC，以肉眼可视化样品的暴露区域。
找到暴露区域后，将管子的末端放在照射的点上，然后将显微镜滤光片更换回明场以实时监测细胞检索。使用连接到管子另一端的注射器小心地抽出含有释放细胞的200微升溶液，并将溶液转移到1.5毫米离心管中进行DNA分析或电镀。使用不同的紫外光微模式从大量水凝胶中提取细胞，这影响了释放细胞的形态。
环形图案的紫外线暴露导致整个菌落释放，封装在保护性PEG水凝胶中。相反，通过将部分或全部菌落暴露在紫外线下，细胞可以作为聚集的细胞簇或游离的单个细胞被提取。水凝胶的细胞接种密度和厚度对于细胞封装很重要。
较薄的水凝胶产生具有最小菌落重叠的微菌落，而厚度增加的水凝胶导致重叠的菌落，这可能导致多个菌落的提取。由于光图案的二维性质，重叠的菌落在提取过程中会导致交叉污染。当一个顶级殖民地成为目标时，底层殖民地也被提取出来。
还评估了各种紫外光微模式对细胞活力的影响。当微菌落暴露于受控剂量的圆形或交叉模式的紫外线时，细胞恢复和DNA纯度不受影响。使用这种方法成功地从微孔阵列中检索细胞，这从代表性的共聚焦显微镜图像中可以明显看出，其中在圆形和环形图案中照射时，细胞以各自的图案被移除。
从微孔阵列中提取后，评估细胞活力和DNA数量。暴露模式既不影响活细胞计数，也不影响DNA质量，表明可以从微孔中选择性地检索活细菌细胞，损害最小，并且它们的DNA可以高纯度分离用于下游基因组分析。在除去全氟烷基化的盖玻片之前，请务必检查水凝胶是否已经形成。
放置用于水凝胶沉积的垫片和使用管道提取细胞需要精确和小心。
概述
本文讨论了一种使用光降解水凝胶和高分辨率光图样的细菌细胞分离协议。该方法允许快速且经济地从复杂的群落中提取特定细菌，促进基因组分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 基因组学
背景
- 分离特定的细菌细胞对于基因组表征至关重要。
- 光降解水凝胶为细胞封装和检索提供了一种新的方法。
- 该技术结合了可观察的细胞特征和基因组数据。
- 水凝胶可以集成到各种筛选界面中。
研究目的
- 开发一种快速分离目标细菌细胞的方法。
- 评估光图样在细胞提取中的有效性。
- 评估水凝胶厚度对细胞活力和提取效率的影响。
使用的方法
- 制备用于细胞封装的水凝胶前体溶液。
- 使用光图样工具降解水凝胶并释放细胞。
- 通过显微镜监控细胞提取。
- 评估提取后的细胞活力和DNA质量。
主要结果
- 细胞从微孔阵列中成功分离，损伤最小。
- 不同的紫外光图样影响了释放细胞的形态。
- 水凝胶厚度影响了菌落重叠和提取结果。
- 提取过程中细胞活力和DNA纯度得以维持。
结论
- 该方法允许选择性检索活力的细菌细胞。
- 水凝胶可以有效地用于细菌的基因组研究。
- 这种方法提高了细胞分离的效率，用于下游应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution photodegradable hydrogel interfaces enable precise screening and isolation of bacterial phenotypes, directly linking observable traits to downstream genomic analysis. This capability addresses a critical bottleneck in early discovery by allowing rapid, high-purity retrieval of rare or emergent bacterial strains from heterogeneous populations. The approach supports portfolio-wide efforts to de-risk target selection and accelerate functional validation in microbiology-driven R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct correlation of phenotypic screening with genotypic analysis for functional target validation.
- Supports biological de-risking by isolating rare or emergent bacterial phenotypes from complex libraries.
- Facilitates predictive confidence in target selection by ensuring high-purity retrieval of candidate strains.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream workflows through precise, contamination-minimized isolation.
- Standardizes assay outputs by enabling reproducible, spatially controlled cell retrieval.
- Enhances screening readiness and scalability for mutant libraries and consortia studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling genomic characterization of phenotypically distinct isolates.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving cell viability and DNA integrity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing high-quality isolates for further functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This photodegradable hydrogel method integrates at the interface of phenotypic screening and genomic analysis, bridging early discovery and preclinical research stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling isolation of functionally relevant bacterial strains.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs through controlled cell encapsulation and release.
- Analytics: Provides high-purity samples for comparative genomic and phenotypic analyses.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by linking phenotype to genotype in isolated strains.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse microbiology screening and isolation needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling high-fidelity downstream analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of microbial targets and consortia.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microscopy, and light patterning instrumentation.
- Needs access to high-resolution light patterning tools and compatible microfluidic or microwell platforms.
- Demands cross-team standardization for hydrogel preparation and cell retrieval protocols.
- Adaptable to various bacterial models but sensitive to hydrogel thickness and colony overlap.
- Careful handling is essential to prevent cross-contamination and ensure high-purity isolation.
