Name: 通过椎前途径直接吻合的小鼠模型用于跨神经转移手术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 学习通过椎前途径直接吻合C7神经的小鼠跨神经转移手术模型。该方案模拟临床手术，提高神经连接成功率，用于研究中枢及周围神经系统损伤后的神经修复机制与康复策略。

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本工作得到国家自然科学基金（82071406、81902296 和 81873766）的资助。

所有动物实验均经复旦大学实验动物伦理委员会和中国科学院批准，符合美国国立卫生研究院的指导方针。实验使用8周龄的雄性C57BL/6N小鼠。
1. 术前准备
<ol>
	<li>准备充足的经高压灭菌的外科手术器械、设备、镇痛药物和麻醉药物。</li>
	<li>确保手术台上有足够的操作空间。</li>
	<li>使用覆盖尿布的定制手术泡沫板作为小鼠的手术床，并用医用胶带将加热垫固定在泡沫板上，加热垫表面需覆盖无菌纱布。</li>
	<li>使用血管钳弯曲一根针灸针，将其对折，再将对折后的针尖弯成钩状，制成牵开器。在针灸针末端固定一条橡胶条，并用图钉将橡胶条的末端固定在泡沫板上。</li>
	<li>校准体视显微镜；选择具有足够焦距的体视显微镜。用灭菌的铝箔覆盖变倍/对焦按钮，以便术者在手术过程中进行调节。灭菌铝箔覆盖在&#160;变倍/对焦按钮上，使术者能够佩戴无菌手套操作&#160;该部件。</li>
</ol>
2. 小鼠麻醉与准备
<ol>
	<li>称重小鼠并进行麻醉&#160;根据体重给予异氟烷（3%），通过夹捏小鼠足垫间区域确认其无反应，以验证麻醉深度。整个操作过程中应维持适当的麻醉深度（1%）&#160;异氟烷</li>
	<li>双眼涂抹眼用软膏，以防止手术期间角膜受到刺激或干燥。</li>
	<li>使用电动剃毛器剃除颈部和胸部的毛发，准备手术区域。清除并清理散落的毛发。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置在覆盖无菌纱布的加热垫上。保持小鼠体温在 37 &#176;C 在整个操作过程中，使用医用胶带固定小鼠，使其前肢水平外展，并防止后肢和尾巴移动。&#160;已将带有适当开口的无菌一次性手术单铺于&#160;小鼠</li>
</ol>
3. 手术操作步骤
<ol>
	<li>注射&#160;曲马多作为&#160;预先镇痛（20 mg/kg，腹腔注射）。在锁骨上缘标记横向切口。使用碘伏消毒液和乙醇交替擦拭三个循环，对手术部位进行消毒。&#160;手术前通过捏脚趾确认麻醉深度。</li>
	<li>在显微镜下操作，使用无菌手术刀沿标记处做一个4 mm的横向切口。根据操作需要，在过程中可适当扩大切口。</li>
	<li>钝性分离皮下筋膜，辨认下颌下腺的下缘。将下颌下腺向上牵拉，以暴露锁骨上窝和胸骨。 
	注意：该区域可能存在小口径血管，可使用电凝止血。</li>
	<li>沿中线从头侧向尾侧切开胸骨，做部分正中胸骨切开术切口（约4 mm）。在胸骨切开过程中保护胸膜、心脏和血管。</li>
	<li>识别胸骨舌骨肌。用两根小型定制的针灸针制牵开器轻轻牵开胸骨，在气管和食管上方识别胸骨舌骨肌。牵开该肌肉以暴露颈总动脉、颈内静脉、膈神经、迷走神经、气管和食管。 
	注意：轻柔地牵拉胸骨以避免开放性气胸。与人类不同，小鼠的食管并不位于气管后方，而是紧邻气管左侧。</li>
	<li>识别左侧臂丛神经。在左侧颈内静脉外侧缘，将筋膜和脂肪组织向外牵拉，以暴露臂丛神经。寻找由C5和C6神经组成的上干，其具有三个分支。沿上干向小鼠尾侧方向，辨认由C7神经组成的中干以及由C8和T1神经组成的下干。 
	注意：臂丛表面有纵向走行的血管。使用电凝止血以防止出血。分离左侧臂丛时，应保护乳糜管，避免形成乳糜瘘。</li>
	<li>获取左侧C7神经。在锁骨下方，沿中干（C7神经）的前支和后支向远端解剖至分支汇入神经束的水平，并通过向神经干局部注入0.1 mL 2%利多卡因阻滞C7神经。使用Vannas弹簧剪在C7神经与外侧束和后束的汇合处将其切断。修整C7神经，使各分支长度相近。 
	注意：C7 神经的前、后支以及上、下干的前、后支在汇合前走行距离较长，因此在切除前应充分游离 C7 神经。事实上，C7 神经并不总是分为两支；有时可分为三支，极少数情况下甚至可分为四支。</li>
	<li>切除左侧C6腹侧椎板。在C6节段水平小心保护膈神经，并切断前斜角肌以暴露C7神经根。用显微镊剪断C7神经支配椎旁肌的小分支。轻柔牵出C7神经，并仔细切除C6腹侧椎板。 
	注意：左侧颈动脉内侧与食管外侧之间存在一个骨性突起，该骨性突起为第6颈椎的腹侧板th 颈椎。第6颈椎腹侧板外侧缘的纵行肌为前斜角肌，膈神经走行于前斜角肌表面。</li>
	<li>切取右侧C7神经。在右侧切断前斜角肌，方法与左侧相似，并在靠近椎间孔处横断右侧C7神经根。从右侧C7神经的分支水平开始游离该神经。 
	注意：仔细切断右侧C7神经，以避免损伤神经下方的血管。</li>
	<li>移植左侧C7神经。
	<ol>
		<li>部分剥离椎体两侧的颈长肌，钝性分离并扩大气管-食管与椎体之间的间隙。</li>
		<li>通过椎前路径，将5-0尼龙缝线从椎体右侧穿过至左侧。</li>
		<li>用输液管套住左侧C7神经，并通过椎前路径将神经引导至右侧。</li>
		<li>轻柔地牵开气管和食管，将左侧C7神经的前股和后股无张力地与右侧C7神经根对接，使用12-0尼龙缝线。用4-5针缝合神经周围神经束膜，以牢固对接神经。 
		注意：选择适当厚度的塑料灌注管至关重要。灌注管过细可能损伤神经，过粗则可能损伤气管和食管。此外，气管-食管与椎体之间的间隙是一个 &#34;V&#34;-形空间，并切断部分颈长肌可缩短移植物的走行路径。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 伤口闭合
<ol>
	<li>用无菌生理盐水冲洗伤口，并用无菌纱布擦干。</li>
	<li>缝合胸骨，并使用5-0单丝缝线缝合皮肤。&#160;</li>
</ol>
5. 术后护理
<ol>
	<li>等待小鼠从麻醉中苏醒。将小鼠转移至一个无垫料但用加热毯预热过的清洁笼具中。观察小鼠直至其能够自主活动。&#160;术后镇痛使用曲马多（20 mg/kg，腹腔注射）。</li>
	<li>将小鼠置于恢复笼中并持续监测其&#160;恢复情况。手术后恢复小鼠的饮水和饮食&#160;。术后每日监测小鼠是否出现功能障碍或感染迹象，包括营养不良、蜷缩姿势和毛发竖立。&#160;术后两周应进行拆线。 
	注意：每天在伤口表面涂抹红霉素软膏，连续三天。</li>
	<li>若观察到任何并发症，例如伤口水肿，应立即处理。</li>
</ol>
6. 行为学分析
注意：所有行为学测试和分析均由对实验分组不知情的观察者完成。
<ol>
	<li>圆筒实验 
	注意：圆筒实验用于评估动物在圆筒内自发垂直探索过程中前肢的使用情况&#160;在 4&#160;术后8周21.&#160;
	<ol>
		<li>将小鼠置于透明圆柱体（直径9 cm，高度15 cm）内，圆柱体放置在抬高的支架上。</li>
		<li>为便于观察和记录，将一面镜子固定在 45&#176; 圆柱下方的角度。</li>
		<li>借助镜子观察并记录每只小鼠10分钟内的自发站立行为。
		<ol>
			<li>手动测定（i）右前爪、（ii）左前爪或（iii）双侧前爪与玻璃壁接触的持续时间。每次实验记录总共20次运动。将测试期间不活跃的小鼠从分析中排除。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将测试表现评分如下： 
		<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/63051/63051eq01v2.jpg" /></li>
	</ol>
	</li>
	<li>网格行走测试 
	注：网格行走试验用于评估动物在自发探索过程中前爪在网格横杆上落点的准确性&#160;在 4&#160;术后8周22.
	<ol>
		<li>将小鼠置于带有25 mm方形孔洞的金属丝网（20 cm × 24 cm）上，让其自由探索10分钟，同时用摄像机记录其行为表现。</li>
		<li>若出现以下任一情况，则记录一次足部滑动：
		<ol>
			<li>观察爪子完全错过横杆的情况（此时肢体陷入横杆之间，动物失去平衡）。</li>
			<li>观察爪子正确放置在横杆上但在承受体重时滑脱的情况。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将测试结果表示为右前肢踩空次数 / 总踩空次数。尽管圆筒实验和网格行走实验均无需训练，仍需在手术前对每只动物进行一次测试以获取基线评分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

在临床中，交叉神经移位手术已被用于治疗臂丛神经撕脱伤以及脑损伤（如中风和创伤性脑损伤）后的患者7,9,12。值得注意的是，脑损伤是一种严重的神经系统疾病，可能导致多种并发症，包括癫痫、脑疝和感染13。并非所有单侧脑损伤患者都适合接受CC7手术。通常，CC7手术适用于中枢性偏瘫患者在慢性期（伤后6个月）进行，以尽可能避免脑水肿的影响。脑损伤后伴有认知功能障碍和四肢瘫痪的患者被排除在CC7手术治疗之外。
大多数研究报道采用皮下途径以及腓肠神经或尺神经移植吻合来转移对侧C7神经根14,15。然而，通过此类方法实现神经再生通常需要六个月时间，这可能会阻碍运动功能的恢复过程，甚至可能影响脑可塑性14。在既往研究中，已在大鼠中实施对侧C7神经转移，通过4股自体移植的腓肠神经连接双侧C7神经。然而，目前尚无关于在小鼠中经椎前通路进行C7神经转移的报道。我们在小鼠中实施了改良椎前通路的CC7手术，并验证了C7神经转移后功能恢复的速度。本研究表明，经椎前通路进行对侧C7神经转移可在术后一个月内改善瘫痪肢体功能，反映出该神经移植动物模型具有更短的恢复时间。因此，该模型能够更精确地模拟临床情况，为后续实验奠定了基础。
如何解剖神经根并降低手术风险是C7神经移位术中的关键问题。与人类不同，小鼠的臂丛神经位于锁骨下方的胸腔内5,16。因此，必须调整入路策略，以便观察C7神经根及脊柱结构17。胸骨切开术是一种安全有效的手术入路，常用于小鼠心胸外科实验18,19。C6腹侧椎板也是神经移位过程中的障碍。因此，通过胸骨切开术暴露C7神经根，并切断C6腹侧椎板，以缩短神经移位的距离。
尽管椎前入路可显著提高神经移位手术中直接吻合的成功率，但并非所有小鼠均可进行直接吻合，这主要是由于小鼠个体间存在解剖学差异。中干（C7神经）在靠近椎间孔的位置即与上干或下干汇合，导致可用于切取的C7神经长度不足。目前唯一的解决方法是进行神经移植或更换实验小鼠。该模型通常采用8周龄小鼠（20–25 g），此时小鼠已发育成熟，C7神经具有足够大小便于操作。尽管该手术方案也可应用于幼龄小鼠，但在更年幼的小鼠中手术难度将显著增加。
TBI + CC7 组小鼠在术后一个月和两个月时前肢运动功能显著提高，提示移植的 C7 神经促进了受损前肢的功能恢复。髓鞘再生对神经功能恢复至关重要。既往研究表明，损伤神经的髓鞘在术后一个月开始再生，与本研究结果一致20。本研究中，移植神经逐渐成熟，与行为学测试结果相符。采用肌电图进一步评估神经移植后功能恢复的速度。结果显示，移植神经在术后 4 周已支配靶肌肉。值得注意的是，本研究首次确定了跨区域神经移植术后通过直接吻合实现再支配的时间点。
综上所述，我们通过模拟临床手术，建立了小鼠经椎前通路进行双侧臂丛神经直接吻合的实验方案，并证实了移位神经的功能。该小鼠模型有助于阐明中枢与周围神经系统损伤后，经交叉神经移位促进康复的神经机制。

臂丛神经（BP）由五条来自不同脊髓节段（C5-T1）的神经组成，负责上臂、手部和手指的感觉与运动功能。这五条臂丛神经自脊髓发出后，会合并形成三条神经干：上干（由C5和C6合并形成）、中干（来自C7）以及下干（由C8和T1的分支组成）。严重的损伤，尤其是交通事故所致的损伤，常导致臂丛神经根撕脱，此类功能障碍对患者造成毁灭性影响1。作为一种有效的临床手段，交叉神经移位手术已被用于修复臂丛神经撕脱伤，通过将受损神经断端重新连接至健侧臂丛神经2,3。该手术可改善患手的功能，并在患者双侧大脑半球的感觉运动皮层引发直接的重组4。动物研究表明，交叉神经移位术后可诱导皮层神经回路发生显著重组5。由于外周感觉运动系统的改变能够重新激活成熟大脑中处于静息状态的可塑性，交叉神经移位手术在修复脑损伤方面也展现出巨大潜力6。
近期，我们证实了交叉神经移位作为一种新的周围神经转接策略，在解决中枢神经系统问题方面的创造性应用潜力。其中一种交叉神经移位手术——对侧颈第七神经移位术（CC7），已应用于脑损伤患者，通过将健侧的C7神经移位至患侧，实现瘫痪上肢显著的功能恢复。7该手术操作的一个独特之处在于，瘫痪上肢的感觉和运动信号通过胼胝体传递至病灶对侧半球 &#34;左右交叉&#34; 移位的神经。值得注意的是，CC7手术引起的功能恢复并不仅限于C7神经本身所支配的功能8此外，CC7 手术不仅可用于治疗脑瘫患儿，还可用于中老年卒中患者的康复。因此，有充分理由相信，通过调节外周感觉运动系统，交叉神经移位能够激发神经可塑性，从而加速脑损伤后的运动功能恢复。
尽管跨侧神经移位手术在臂丛神经损伤（BPI）和脑损伤的临床治疗中已取得显著康复效果，但该手术背后的神经机制仍不明确。由于缺乏具有临床特征的合适动物模型，相关内在机制的研究受到限制。传统上，在临床实践中，将病灶对侧的C7神经根通过神经移植（如尺神经、腓肠神经或大隐静脉）转移至患侧，并与受损的臂丛神经（如正中神经、C7神经根或下干）相连接2,3,9。近年来出现的一种新改良术式是将健侧C7神经根通过椎前通路直接转移至患侧C7神经，无需桥接神经移植物且无缺损，被认为是一种更优的解决方案7。目前，小鼠在细胞类型特异性和遗传品系多样性方面具有优势，更适合用于研究神经生理机制。因此，本研究模拟临床手术，建立小鼠经椎前通路直接吻合双侧C7神经根的实验方案，以促进对跨侧神经移位术后康复相关神经机制的研究。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>KDL</td><td>K-20200808</td><td></td></tr><tr><td>12-0 尼龙缝线</td><td>Chenghe</td><td>20082</td><td></td></tr><tr><td>5-0 编织丝线</td><td>MERSILK,ETHICON</td><td>QK312</td><td></td></tr><tr><td>75% 乙醇</td><td>GENERAL-REAGENT</td><td>P1762077</td><td></td></tr><tr><td>针灸针</td><td>Chengzhen</td><td>190420</td><td>用于制作牵开器</td></tr><tr><td>自动剃毛器</td><td>Codos</td><td>CHC-332</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6N 小鼠</td><td>SLAC laboratory (上海)</td><td>C57BL/6Slac</td><td></td></tr><tr><td>电凝器</td><td>Gutta Cutter</td><td>SD-GG01</td><td></td></tr><tr><td>红霉素眼膏</td><td>白云山</td><td>H1007</td><td></td></tr><tr><td>碘伏消毒液</td><td>Lionser</td><td>20190220</td><td></td></tr><tr><td>医用胶带</td><td>Transpore,3M</td><td>1527C-0</td><td></td></tr><tr><td>显微持针器</td><td>Chenghe</td><td>X006-202003</td><td></td></tr><tr><td>显微镊子</td><td>Chenghe</td><td>B001-201908</td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>66VT</td><td>1911-2S276</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>眼科剪刀</td><td>Chenghe</td><td>X041D1251</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Sigma</td><td>20170608</td><td></td></tr><tr><td>塑料输液管</td><td>KDL</td><td>C-20191225</td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水</td><td>KL</td><td>L121021109</td><td></td></tr><tr><td>血管钳</td><td>金钟</td><td>J31020</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>RWD</td><td>69027</td><td></td></tr></tbody></table>

一种通过椎前路径直接吻合的鼠类神经跨接移植手术模型

A Mouse Model of Direct Anastomosis via the Prespinal Route for Crossing Nerve Transfer Surgery

交叉神经转接手术已成为治疗臂丛神经撕脱伤患者上肢损伤的一种有效方法。近年来，该手术被创造性地应用于脑损伤的临床治疗，并显著促进了瘫痪上肢的功能康复。手术后的功能恢复表明，外周感觉运动干预可诱导强烈的神经可塑性，以补偿脑损伤后丧失的功能；然而，其潜在的神经机制尚不明确。因此，迫切需要建立一种临床相关的动物模型。在此，我们模拟临床手术，在小鼠中建立了一种通过椎前通路直接吻合双侧臂丛神经的实验方案。通过神经解剖学、电生理学和行为学实验，我们证实这些小鼠的移植神经成功再支配了受损前肢，并促进了脑损伤后运动功能的加速恢复。因此，该小鼠模型揭示了在中枢与周围神经系统损伤后，通过交叉神经转接实现康复的神经机制。

单侧脑损伤常因成年个体神经可塑性的代偿能力有限，导致对侧肢体出现永久性功能障碍10,11。此前，我们报道过CC7手术可用于治疗脑损伤后成年患者的偏瘫上肢7。为了评估通过脊前通路直接吻合双侧C7神经方案的有效性，我们在小鼠单侧创伤性脑损伤（TBI）后实施了交叉神经移位手术。 图1 描述了TBI操作过程，并验证了损伤范围与效果。首先，使用电动皮层撞击器（eCCI）损伤成年小鼠左侧半球的大脑皮层（前后方向 = +1.0 mm 至 -2.0 mm，内外侧方向 = 0.5 mm 至 3.5 mm），以造成单侧脑损伤。两周后，解剖结构显示该TBI方案几乎完全破坏了感觉运动皮层，该区域是启动运动的重要部位。这些单侧TBI小鼠表现出明显的右侧前肢运动功能缺陷。
图2描述了CC7手术的操作流程。CC7手术的路径示意图显示，代表椎前通路的路径A相较于其他路径是最短的。路径A的长度甚至短于左侧（非瘫痪侧）获取的C7神经的长度。该发现为选择椎前通路完成神经移位手术提供了解剖学依据。在创伤性脑损伤（TBI）后两周，通过椎前通路直接吻合的方式实施CC7手术。将非瘫痪侧的颈7（C7）神经直接转移到瘫痪侧，而非维持其原有的脑部连接。图3展示了透射电子显微镜的结果，&#160;显示移植的C7神经已成功再生。移植的C7神经髓鞘厚度从CC7术后4周开始逐渐增加，在术后8周时几乎达到对照组水平。图4通过肌电图记录证实了移植C7神经对肌肉的再支配作用。术后4周，电刺激C7神经吻合口近端可在患侧前肢多个肌肉中稳定诱发动作电位，该结果与电子显微镜观察结果一致。图5通过霍乱毒素亚单位B（CTB）逆行标记法显示，移植的C7神经含有来自健侧脊髓C7节段前角的运动纤维和来自背根神经节的感觉纤维。
图6 显示，小鼠模型在单侧创伤性脑损伤（TBI）后也表现出显著的运动功能恢复，这与临床研究的结果一致。为了验证CC7手术对TBI后受损运动功能恢复的影响，建立了TBI + 假手术组和对照 + 假手术组。TBI + 假手术组和TBI + CC7组的小鼠同时接受相同的TBI损伤操作，而对照 + 假手术组的小鼠仅接受假手术。TBI + CC7组的小鼠接受神经移位手术，而TBI + 假手术组和对照 + 假手术组的小鼠则接受双侧颈7（C7）神经切除术。在圆筒实验中，TBI + CC7组在CC7手术后4周和8周时，受损前肢的使用率均显著高于TBI组（p &#60; 0.01）。在网格行走实验中，TBI + CC7组在CC7手术后4周的错误率低于TBI组。此外，在CC7手术后8周，TBI + CC7组的错误率显著低于TBI组（p &#60; 0.05）。这些行为学结果表明，CC7手术可改善TBI小鼠患肢的运动功能。综上所述，这些结果提示，通过CC7手术经椎前通路重建的移植C7神经成功再生并重新支配了受损前肢，从而促进了单侧TBI成年小鼠的运动功能恢复。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63051/63051fig01.jpg" /> 
图 1：单侧创伤性脑损伤的表征。 （A）&#8239;显示小鼠在电控皮层挫伤撞击（eCCI）中的位置示意图。（B）eCCI 的参数与损伤范围。（C）代表性冠状切面显示损伤皮层（TBI 后 2 周，比例尺 = 500 µm）。缩写：eCCI = electric cortical contusion impactor。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63051/63051fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63051/63051fig02.jpg" /> 
图2：手术示意图。（A）示意图展示在创伤性脑损伤（TBI）小鼠中进行对侧C7神经移位的实验设计。红色圆圈表示创伤位置。虚线矩形内的红色双斜线表示缝合的神经。（B）横截面图显示小鼠中对侧C7神经移位的三条可选路径。路径A（蓝线）表示移位神经的椎前通路；路径B（绿线）表示移位神经的气管前通路；路径C（红线）表示移位神经的皮下隧道通路。（C）图表显示（B）中各路径长度与获取的C7神经长度的比较。路径A的长度（3.3 ± 0.10 mm）显著短于获取的C7神经长度（4.05 ± 0.11 mm；* p &#60; 0.05，单因素方差分析，每组n = 20）。路径C的长度（14.15 ± 0.20 mm）显著长于获取的C7神经长度（*** p &#60; 0.001，单因素方差分析，每组n = 20）。路径B的长度为4.2 ± 0.08 mm（n = 20）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63051/63051fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63051/63051fig03.jpg" /> 
图3神经横切面的电子显微镜分析 (A,B) 对照组小鼠神经图像。比例尺 = 5 &#181;m (A）和 1 &#181;m (B). (C,D) 术后一个月的再生神经图像。比例尺 = 5 &#181;m (C）和 1 &#181;m (D). (E，F) 术后1.5个月再生神经的图像。比例尺 = 5 &#181;m (E）和 1 &#181;m (F). (G，H) 术后两个月再生神经的图像。比例尺 = 5 &#181;m (G）和 1 &#181;m (H）。A、C、E 和 G 放大倍数为 2,000×；B、D、F 和 H 放大倍数为 15,000×。（I) G比率（髓鞘内径与外径之比）在对照组样本中低于术后4周样本，且与术后6-8周样本相当（***：p &#60; 0.001；不同组轴突间的比较 t-检验；每组 n = 3 只小鼠）。缩写：CC7 = 对侧颈第七神经移位；CC7-XW = 术后 X 周 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63051/63051fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63051/63051fig04.jpg" /> 
图4：对侧C7神经移位术后肌电图分析显示神经再生速率。（A）示意图显示电刺激传递及体内肌电图记录过程。刺激强度在整个测试过程中保持一致（2 mA）。刺激部位为吻合口近端的C7神经。（B, C）术后两周（B）和四周（C）在胸大肌记录到的动作电位图。（D, E）术后四周（D）和八周（E）在指伸肌记录的肌电图。（F）术后三周，肱三头肌出现复合肌肉动作电位（CMAP）。（G）术后四周和八周，肱三头肌的CMAP增强。（H）胸大肌的平均波幅在术后4周达到约0.25 mV ± 0.16 mV，8周时为0.45 mV ± 0.03 mV，两个时间点之间差异显著（*** p &#60; 0.001，t-检验，每组n = 6）。（I）肱三头肌的平均波幅在术后4周达到约0.15 mV ± 0.01 mV，8周时为0.46 mV ± 0.02 mV，两个时间点之间差异显著（***：p &#60; 0.001，t-检验，每组n = 6）。（J）指伸肌的平均波幅在术后4周达到约0.11 mV ± 0.01 mV，8周时为0.29 mV ± 0.02 mV，两个时间点之间差异显著（***：p &#60; 0.001，t-检验，每组n = 6）。缩写：EMG = 肌电图；CMAP = 复合肌肉动作电位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63051/63051fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63051/63051fig05.jpg" /> 
图 5：转移的 C7 神经运动神经元和感觉神经元的 CTB 逆行标记。 （A-C）在 CC7 手术后 4 周，于 C7 神经吻合口远端注射 CTB。（A）感觉神经元在背根神经节（DRG）中被标记。（B, C）转移的 C7 神经的运动神经元在脊髓前角中被标记。放大倍数：20×。比例尺 = 200 µm（A, B）；100 µm（C）。缩写：CTB = 霍乱毒素 B 亚基；DRG = 背根神经节；DAPI = 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63051/63051fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63051/63051fig06.jpg" /> 
图6：CC7手术后的行为变化。（A）图像显示小鼠的圆筒实验。（B）汇总图显示CC7移植在术后4周和8周对TBI小鼠的影响（n = 6只小鼠）。p = 0.001；非配对t检验。对照+假手术组患侧前肢的平均使用率为54.17% ± 3.01%，TBI+假手术组为22.5% ± 2.14%；在CC7手术后4周，TBI+CC7组为35.83% ± 2.39%，差异具有显著性（单因素方差分析；p &#60; 0.05，每组n = 6）。在CC7移植后8周，对照+假手术组、TBI+假手术组和TBI+CC7组的使用率分别为53.33% ± 3.80%、24.17% ± 3.01%和40.00% ± 1.83%，差异显著（*p &#60; 0.05，单因素方差分析，每组n = 6）。（C）图像显示网格行走实验。（D）该图显示TBI+假手术组患侧前肢的平均错误率为85.41% ± 1.59%（n = 6），与TBI+CC7组的80.17% ± 2.19%（n = 6）相当，两者均高于对照+假手术组（50.99% ± 11.69%）。术后8周，TBI+CC7组的错误率为76.87% ± 1.07%（n = 6），显著低于TBI+假手术组（83.06% ± 1.41%；p &#60; 0.05，单因素方差分析，每组n = 6）。缩写：CC7 = 对侧颈第七神经移植；TBI = 创伤性脑损伤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63051/63051fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们模拟了临床手术，建立了小鼠通过椎前通路进行双侧臂丛神经直接吻合的实验方案，这有助于研究中枢和周围神经系统损伤后通过交叉神经移位促进康复的神经机制。

交叉神经移位手术已成为修复臂丛神经撕脱伤患者上肢损伤的有效方法。

该方案可用于建立接受C7神经移位手术的小鼠模型，有助于研究该手术背后的内在神经机制。因此，本方案的主要优势在于能够提高直接神经吻合的成功率，并且能很好地模拟临床手术。该方案为相关研究提供了良好的动物模型。当然，神经转接技术及其研究成果可应用于加速患者术后恢复。在锁骨上缘做横向切口，暴露锁骨上窝和胸骨后，沿中线从头侧向尾侧切开胸骨，注意避免损伤胸膜、心脏及血管。借助两枚特制的小型针灸针拉钩，在牵开覆盖于气管和食管上方的胸骨舌骨肌之前，轻柔地牵开胸骨。在左侧颈总静脉外侧缘，将筋膜和脂肪组织向外牵拉，以暴露左侧臂丛神经。随后寻找由C5和C6神经组成的上干，其具有三个分支。辨认由C7神经组成的中干以及沿上干至小鼠尾部方向走行的下干。在锁骨下方，从中间干远端至其分出前、后股的位置，解剖至束的水平。使用Vannas弹簧剪在C7神经与外侧束和后束的汇合处切断C7神经，然后修剪C7神经，使各分支长度相近。接下来，在C6节段水平切断前斜角肌，注意勿损伤膈神经，并暴露C7神经根。然后拉出C7神经，并切除左侧C6椎体的腹侧椎板。按前述方法取右侧C7神经。在移取左侧C7神经之前，需部分切除椎体两侧的颈长肌。随后分离并扩大气管、食管与椎体之间的间隙。操作完成后，将一根由7-0尼龙缝线形成的环从椎体右侧穿过椎前根到达左侧，用尼龙缝线环钩住左侧C7神经，并通过椎前根将其引导至右侧。在牵开气管和食管后，使用12-0尼龙缝线将左侧C7神经的前支和后支无张力地吻合至右侧C7神经根。用4到5针缝合神经周围的神经外膜，以牢固地对接神经。缝合完成后，用无菌生理盐水冲洗伤口，随后用无菌纱布擦干，然后缝合胸骨并使用5-0单丝缝线闭合皮肤。在代表性分析中，显示出成功再生的C7神经。从CC7手术后四周开始，移位的C7神经髓鞘厚度逐渐增加，在手术后八周时已几乎接近对照组水平。对侧C7神经移位后的肌电图分析显示，在胸大肌和指伸肌记录到的动作电位表明神经已再生。术后三周，肱三头肌开始出现复合肌肉动作电位（CMAPs），并在术后四周和八周时逐渐增强。胸大肌的平均振幅从第4周到第8周显著增加。同样，肱三头肌、肱肌和指伸肌的平均振幅在第8周也表现出显著改善。霍乱毒素B亚单位（CTB）逆行标记显示，移植的C7神经包含来自脊髓前角的运动纤维和来自背根神经节的感觉纤维。此外，还监测了动物在CC7手术后的行为变化。在筒状实验中，TBI联合CC7组在CC7手术后4周和8周时，使用受损前肢的频率显著高于TBI组。在网格行走实验中，TBI联合CC7组在CC7手术后4周时的错误率低于TBI组。在第八周时，TBI联合CC7组的错误率显著低于TBI组，表明CC7手术改善了患肢的运动功能。尽可能轻柔地分离C7神经以获得足够的神经长度，是实现双侧C7神经直接吻合的关键。该技术有助于阐明神经机制，并为中枢及周围神经系统损伤后强制性神经移位的分层康复提供说明。

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神经科学

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小鼠中诱导机械性异常性疼痛的 spared nerve injury（SNI）模型

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