免疫肽组学：小鼠和人类MHC I类和II类相关肽段的分离及其质谱分析

本方案具有重要意义，因其操作简便，任何实验室均可实施。该方案可用于从人或小鼠样本中分离HLA或MHC I类或II类肽段。该方法可应用于涉及免疫系统的各个研究领域的科学问题，无论是在癌症、病毒学还是自身免疫性疾病研究中。

本方案旨在为任何在科研实验室工作的人员提供便利。只需按照以下步骤操作即可。首先，称取每份样品80毫克的Sepharose溴化氰活化珠，转移至15毫升锥形管中，开始活化。

加入5毫升1毫摩尔盐酸。用移液器上下吹打5次，以促进干燥微珠的重悬，然后用额外的8.5毫升1毫摩尔盐酸补充满锥形管。使用旋转仪装置，在室温下以20转/分钟的速度旋转微珠30分钟。

在室温下以200×g离心磁珠两分钟，并通过抽吸去除上清液。向磁珠板中加入500微升偶联缓冲液，然后将磁珠悬液转移至一个新的2毫升离心管中，备用。为将抗体偶联到这些磁珠上，取2毫克选定的抗体加入一个新的2毫升微量离心管中，再用偶联缓冲液定容至1毫升，使终浓度为2毫克/毫升。

将先前配制的磁珠溶液转移并加入抗体溶液中。然后，使用旋转仪装置在20 RPM条件下旋转微量离心管120分钟，离心磁珠，随后按前述方法去除上清液。接下来，开始对磁珠进行封闭和洗涤：首先向含有抗体偶联磁珠的微量离心管中加入1毫升0.2摩尔的甘氨酸，再使用旋转仪装置在室温下以20 RPM旋转60分钟。

离心并去除上清液后，用一毫升 PBS 洗涤磁珠，再次离心去除上清液，并将磁珠保存在四摄氏度的一毫升 PBS 中，直至使用。为分离 MHC I 类或 II 类肽段，用手掌加热管底以融化含有一亿细胞的冷冻细胞悬液。向细胞悬液中加入 500 微升 PBS，反复吹打直至悬浮液均匀。

将悬液转移至一个新的2毫升微量离心管中，并加入等体积的细胞裂解缓冲液。使用旋转仪在4°C、10 RPM条件下旋转孵育60分钟。将细胞裂解物在4°C、18,000×g条件下离心20分钟（使用全制动），然后将上清液转移至一个新的2毫升微量离心管中。

通过离心回收抗体偶联的磁珠，并移除上清液。然后将细胞裂解物上清液转移至抗体偶联的磁珠中，使用旋转仪在4°C下以10 RPM孵育14至18小时过夜。第二天，取下聚丙烯柱的底盖，将柱子置于聚丙烯柱架上，并在下方安装一个空容器以收集穿流液。

用 10 毫升缓冲液 A 冲洗聚丙烯柱，并让其依靠重力自然流干。如果液体流出速度过慢，可进一步剪去聚丙烯柱底部的尖端。测量并收集珠子/裂解液混合物，转移至聚丙烯柱中。

让液体混合物依靠重力自然流出。可选步骤：收集20微升等分试样并冷冻，用于蛋白质印迹分析。现在向聚丙烯柱中残留的珠粒加入10毫升缓冲液A，让其依靠重力自然流出，以洗涤珠粒。

从支架上取下聚丙烯柱，将其置于新的2毫升微量离心管上，用手握住柱子和离心管。向聚丙烯柱中加入300微升1%三氟乙酸（TFA），通过上下吹打5次混匀磁珠。然后，将洗脱液转移至新的2毫升微量离心管中。

为脱盐并洗脱MHC肽，先在C-18柱上加入200微升甲醇，于1,546×g离心3分钟以弃去穿流液。随后在C-18柱上加入200微升含0.1%三氟乙酸（TFA）的80%乙腈溶液，再次离心以弃去穿流液。接着加入200微升0.1% TFA溶液，通过离心弃去穿流液。

最后，将200微升MHC肽复合物加样至C-18柱顶部，通过离心弃去穿流液，并重复此步骤直至全部体积加样完毕。接着，加入200微升含0.1%三氟乙酸（TFA）的溶液，离心弃去穿流液，将C-18柱转移至一个新的2毫升微量离心管中，然后加入150微升含28%乙腈的0.1%TFA溶液洗脱MHC肽。离心后，将穿流液收集至一个新的1.5毫升微量离心管中。

重复洗脱过程两次，总体积为450微升，并在负20摄氏度下冷冻，直至进行LC-MS-MS分析。使用这些纯化的肽段通过质谱仪鉴定MHC I类和II类分子的肽段。当抗体共价结合到CNBr珠上后，与偶联前的抗体相比，轻链和重链的信号染色强度显著降低，表明珠子的结合效率较高。

通过使用抗-HAL-ABC重链抗体检测到强烈的信号，证实了在酸性洗脱后成功分离出MHC肽复合物。本实验方案在个体内部和个体之间的结果重复性也进行了评估。在三个不同的生物学重复样本中，所检测到的肽段数量的平均变异系数较小，范围为1.9%至11%。然而，肽段的鉴定结果差异较大，在三个生物学重复样本中可重复检测到的肽段比例范围为39%至63%。生成的热图显示了已鉴定肽段预测的MHC结合强度。

对于小鼠MHC I类和II类肽，预测的强结合或弱结合肽分别占89%和87%。对于人类HLA I类和II类肽，预测的强结合或弱结合肽分别占97%和70%。同时还生成了小鼠和人类LHC I类和II类肽的肽结合基序。

在优化本方案之前，小鼠MHC I类和II类肽段的分离较为困难。该优化后的方案将有助于从小鼠体内模型中分离小鼠MHC I类和II类肽段，例如常用于多种不同疾病相关研究验证的实验模型。