一种持续分离小鼠心肌细胞的简单有效的方法

与最常用的朗根道夫仪器技术相比，这种技术更可靠、更高效，不需要大量的练习或培训。该技术的主要优点是它限制了缺血时间，因为初始灌注发生在体内。在执行这种技术时，必须避免歧管中的气泡，并避免在消化过程中心脏过度运动，这些会降低产量。

展示这项技术的将是Mark Ziolo博士实验室的研究生Sarah Sturgill。首先使用新鲜制备的灌注缓冲液清除温控歧管。为此，请拧入 27 号针并使用鲁尔锁连接器清除气泡。

确保没有气泡残留。为了分离心肌细胞，暴露完全麻醉小鼠的胸骨，并在中线的外侧，通过肋骨和腋窝近端切开。然后切开横膈膜，确保浅切口以避免心脏。

用止血器夹住胸骨，并将肋骨向后折叠以露出胸腔。轻轻地从心脏上取出心包，然后切开紧邻心脏远端的下腔静脉。使用 27 号针头在一分钟内将三毫升冰冷的清除缓冲液注入心脏的右心室。

接下来，用镊子握住心脏。将其从身体上拉开，并尽可能多地暴露主动脉。然后使用止血器夹住升主动脉并切除心脏。

快速将夹紧的心脏转移到含有10毫升温灌注缓冲液的聚丙烯培养皿的盖子上。将夹紧的心脏放入支撑平台，并使用连接到歧管的稳定 27 号针头在 37 摄氏度下将 10 毫升温控灌注缓冲液注入左心室，持续 5 分钟。接下来，将夹紧的心脏和支持平台转移到带有约五毫升消化缓冲液的培养皿中。

将输入注射器更换为含有25毫升消化缓冲液的50毫升注射器。注射前清除歧管中的任何气泡和剩余的灌注缓冲液。小心地将针头更换到左心室心尖的相同针头位置。

在灌注泵的帮助下，使用50毫升注射器将37摄氏度的消化缓冲液注入左心室15分钟。用校准为喷射37摄氏度溶液的水套控制溶液的温度。从心房取出心室，然后将其转移到 10 毫升烧杯中。

在烧杯中加入三毫升消化缓冲液，用锋利的剪刀将心室切成大块。用铝箔盖住烧杯，然后将其放入预热至37摄氏度的摇动水浴中五分钟。弃去上清液后，将组织块重悬于三毫升消化缓冲液中，研磨约四分钟或直到获得均匀的混合物。

完成后，使用50微米尼龙细胞过滤器将细胞过滤到70毫升聚丙烯管中。用三毫升消化缓冲液清洗尼龙细胞过滤器。将滤液放回14毫升圆底聚丙烯管中并离心。

弃去上清液，然后将沉淀重悬于三毫升终止缓冲液中。向细胞悬液中加入54微升100毫摩尔氯化钙原液，使最终氯化钙浓度为1.8毫摩尔。让活细胞沉淀10分钟，并除去含有死细胞的上清液。

将沉淀重悬于储存溶液中后，细胞可用于功能实验和培养。分离细胞的明场显微镜图像显示，小鼠心肌细胞的分离产生了没有膜泡或圆角边缘的杆状静止细胞。这些细胞显示出大约80%的产量和高存活率，决定了分离技术的成功。

为了成功分离，最重要的是从歧管中去除气泡并将针头插入心脏的同一孔中。一旦分离，心肌细胞可用于细胞和分子功能实验。