一种简单高效且可重复分离小鼠心肌细胞的方法

该技术比最常用的兰格多夫装置技术更可靠、更高效，且无需大量练习或培训。该技术的主要优势在于限制了缺血时间，因为初始灌注是在体内进行的。在操作该技术时，必须避免灌流管路中产生气泡，并避免心脏在消化过程中过度移动，这些因素都可能降低细胞得率。

本技术的示范者为马克·齐奥洛博士实验室的研究生莎拉·斯特吉尔（Sarah Sturgill）。首先使用新配制的灌流缓冲液冲洗温控歧管。具体操作为：旋入27号针头，并使用鲁尔锁接头排除气泡。

确保无气泡残留。为分离心肌细胞，暴露完全麻醉小鼠的胸骨，在中线外侧，从肋骨近端剪至腋窝。随后剪开膈肌，注意剪切深度较浅，以避免损伤心脏。

用止血钳夹住胸骨，将肋骨向后折叠以暴露胸腔。轻轻移除心脏表面的心包膜，然后在靠近心脏处的下腔静脉远端剪开。使用27号针头在1分钟内向右心室注射3毫升冰冻澄清缓冲液。

接下来，用镊子夹住心脏，将其从体内拉出，并尽可能暴露主动脉。然后使用止血钳夹闭升主动脉，并切除心脏。

迅速将夹住的心脏转移至含有10毫升温热灌注缓冲液的聚丙烯培养皿盖中。将夹住的心脏放入支撑平台，并使用连接在多通管上的固定27号针头，在五分钟内向左心室注入10毫升温度控制在37摄氏度的灌注缓冲液。随后，将夹住的心脏及其支撑平台转移至含有约5毫升消化缓冲液的培养皿中。

将输入端的注射器更换为含有25毫升消化缓冲液的50毫升注射器。在注射前，清除 manifold 中的所有气泡及残留的灌注缓冲液。小心地将针头重新插入左心室心尖的相同位置。

借助灌注泵，使用50毫升注射器将37摄氏度的消化缓冲液注入左心室，持续15分钟。通过校准至排出37摄氏度溶液的水浴夹套控制溶液温度。在将心室组织转移至10毫升烧杯前，将其与心房分离。

向烧杯中加入 3 毫升消化缓冲液，用锋利的剪刀将心室组织剪成较大的组织块。用铝箔覆盖烧杯，置于已预热至 37 °C 的摇动水浴中孵育 5 分钟。弃去上清液后，将组织块重悬于 3 毫升消化缓冲液中，吹打约 4 分钟，直至形成均一的混合物。

操作完成后，使用70微米尼龙细胞滤网将细胞过滤至一个50毫升聚丙烯管中。用3毫升消化缓冲液冲洗尼龙细胞滤网。将滤液转移回14毫升圆底聚丙烯管中，并进行离心。

将沉淀重悬于3毫升终止缓冲液之前，弃去上清液。向细胞悬液中加入54微升100毫摩尔/升氯化钙储备液，使终浓度为1.8毫摩尔/升氯化钙。静置活细胞10分钟，去除含有死细胞的上清液。

将细胞沉淀重悬于保存溶液后，细胞可用于功能实验和培养。分离细胞的明场显微镜图像显示，小鼠心肌细胞的分离获得了杆状静息细胞，无膜出泡或边缘圆缩现象。细胞得率约为80%，且存活率高，表明该分离技术成功。

为了成功分离，最重要的是从灌流装置中去除气泡，并将针头插入心脏的同一孔洞中。分离后，心肌细胞可用于细胞和分子水平的功能实验。