Name: 一种持续分离小鼠心肌细胞的简单有效的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 学习一种非Langendorff技术分离小鼠心肌细胞的方法，该方法在体内进行初始灌注以缩短缺血时间，提高细胞产量和存活率，无需大量培训即可操作。

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本研究工作由美国国立卫生研究院基金资助，项目编号：R01 HL114940（Biesiadecki）、R01 AG060542（Ziolo）和 T32 HL134616（Sturgill 和 Salyer）。

本研究中进行的所有实验程序均经俄亥俄州立大学机构动物照护与使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）指南要求。
1. 溶液配制
注意：缓冲液浓度请参见表2。
<ol>
	<li>分离前准备（心肌细胞分离前最多提前两周）
	<ol>
		<li>灌流缓冲液基础液：在1 L超纯18.2 MΩ·cm H2O中配制1 L灌流缓冲液基础液（含NaCl、KCl、NaH2PO4、HEPES、葡萄糖和BDM）。在经0.22 µm无菌过滤前调节pH至7.4。4 °C保存至分离当天。</li>
		<li>清洗缓冲液：在1 L超纯18.2 MΩ·cm H2O中配制1 L清洗缓冲液（含NaCl、KCl、NaH2PO4、HEPES、葡萄糖、EDTA和BDM）。在经0.22 µm无菌过滤前调节pH至7.4。4 °C保存至分离当天。</li>
		<li>100 mM CaCl2储备液：称取1.11 g CaCl2，溶于100 mL超纯18.2 MΩ·cm H2O中。室温保存至分离当天。</li>
		<li>Liberase分装液：将5 mg消化酶溶解于5 mL无菌、无RNase的水中。分装为0.8 mL每份，-20 °C保存至分离当天。</li>
		<li>包被培养皿：向无菌玻璃底30 mL培养皿中加入100 µL浓度为40 µg/mL的小鼠层粘连蛋白溶液。静置30分钟，吸除多余层粘连蛋白。将包被后的培养皿置于室温下经紫外照射孵育30分钟。4 °C保存至分离当天（包被的培养皿最多可使用两周）。</li>
		<li>DMEM培养基：在生物安全柜中，向46 mL DMEM中加入2.5 mL FBS、0.5 mL青霉素-链霉素（50 U/mL-50 µg）和1 mL 500 mM BDM。4 °C保存至分离当天（培养基最多可使用两周）。</li>
		<li>M199培养基：在1 L超纯18.2 MΩ·cm H2O中配制1 L M199培养基（含NaHCO3、HEPES、L-谷胱甘肽、M199、BDM和BSA）。在无菌过滤（0.22 µm滤膜）前调节pH至7.4。4 °C保存至分离当天。</li>
		<li>500 mM BDM储备液：将0.5 g BDM加入10 mL超纯18.2 MΩ·cm H2O中。4 °C保存至分离当天。</li>
		<li>稳定平台制作：将橡皮泥围绕固定在鲁尔接头上的针头基部塑形。将橡皮泥塑形至可固定盛放心脏的培养皿，并确保针头高度适合心室注射（约高于皿底5 mm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离当天
	<ol>
		<li>灌流缓冲液：在分离当天，向100 mL灌流缓冲液基础液中加入9.5 mg MgCl2。待完全混匀后，取出30 mL完全配制的灌流缓冲液，转移至洁净、广口、带螺旋盖的100 mL玻璃瓶中（作为消化缓冲液）。 
		&#8203;注：这些添加物可在分离当天加入，无需额外调节pH，因其对pH的影响可忽略不计。
		<ol>
			<li>取出12 mL灌流缓冲液并留置一旁（作为终止缓冲液）。将剩余的58 mL灌流缓冲液倒入另一洁净、广口、带螺旋盖的100 mL玻璃瓶中。在整个分离过程中将剩余的灌流缓冲液置于37 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>消化缓冲液：向30 mL灌流缓冲液中加入7.5 µL 100 mM CaCl2，终浓度为25 µM。在开始分离前立即向消化缓冲液中加入770 µL Liberase，终浓度为26 µg/mL。</li>
		<li>终止缓冲液：将240 mg BSA溶解于12 mL灌流缓冲液中。在整个分离过程中置于37 °C保存。</li>
		<li>清洗缓冲液：用清洗缓冲液填充一支3 mL注射器，并排除针头中的气泡。冰上保存至分离开始。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 多通管路的准备
<ol>
	<li>使用新配制的灌流缓冲液冲洗温控多通管，注意确保无气泡残留。使用鲁尔锁接头旋紧一根27 G针头，并排除气泡。清除气泡的多通管是成功分离的关键。</li>
</ol>
3. 动物准备
<ol>
	<li>在分离操作前，立即按照 100 mg/kg 体重剂量通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮，并以 20 mg/kg 体重剂量注射赛拉嗪。本实验使用一只雄性、4 月龄的 C57Bl/6 小鼠。</li>
	<li>如有需要，将小鼠置于加热的手术垫上以促进镇静。将小鼠四肢展开，并用胶带将四肢及尾部基部固定在蓝色实验用吸水垫上。通过脚趾夹捏反射的消失确认动物已完全麻醉&#160;。&#160;在手术区域周围覆盖无菌手术巾。</li>
</ol>
4. 心肌细胞分离步骤
<ol>
	<li>暴露小鼠胸骨，在中线外侧沿肋骨向近端及腋窝方向剪开。轻轻完全剪断膈肌，注意切口要浅，避免损伤心脏。用止血钳夹住胸骨，将肋骨向后折叠，以暴露胸腔。</li>
	<li>轻轻去除心脏表面的心包膜，并在靠近心脏远端处完全剪断下腔静脉。使用装有27 G针头的3 mL注射器，在1分钟内快速将3 mL冰冻澄清缓冲液注入右心室。</li>
	<li>用镊子轻轻夹住心脏并稍向外牵拉，尽可能暴露主动脉。使用止血钳夹闭升主动脉，注意避免夹到心房，随后将心脏从胸腔中完整切除。</li>
	<li>迅速将夹闭的心脏转移至聚丙烯培养皿盖中，其中预先加入约10 mL温热灌注缓冲液。将夹闭的心脏置于支撑平台上，使用连接在多通管上的固定式27 G针头，在5分钟内向左心室注入10 mL温度控制在37 °C的灌注缓冲液。</li>
	<li>将夹闭的心脏及其支撑平台转移至含有约5 mL消化缓冲液的培养皿中。更换输入端注射器，换用装有25 mL消化缓冲液的50 mL注射器。</li>
	<li>在注射前清除多通管中的气泡及残留灌注缓冲液。小心地将针头重新插入左心室心尖的相同位置。</li>
	<li>使用灌注泵，通过50 mL注射器在15分钟内将温度控制在37 °C的消化缓冲液注入左心室。通过预先校准的水浴夹套控制溶液温度，确保针头末端释放的溶液温度为37 °C。</li>
	<li>将心室与心房分离后转移至10 mL烧杯中。向烧杯中加入3 mL消化缓冲液，使用锋利的剪刀将心室组织剪成较大块状。用铝箔覆盖烧杯，并置于预热至37 °C的振荡水浴中孵育5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，注意避免丢失组织块。将组织块用3 mL消化缓冲液重悬，并吹打约4分钟，直至形成均匀混悬液。</li>
	<li>通过70 µm尼龙细胞筛过滤细胞，收集至50 mL聚丙烯离心管中。</li>
	<li>将滤液转移至14 mL圆底聚丙烯离心管中，以100 rpm离心1分钟。弃去上清液，将沉淀用3 mL终止缓冲液重悬。</li>
	<li>向重悬的细胞中加入54 µL 100 mM CaCl2储备液，使最终CaCl2浓度达到1.8 mM。此步骤也可分步进行，以提高细胞得率。</li>
	<li>让活细胞在重力作用下静置沉降10分钟，随后小心移除含有死细胞的上清液。将沉淀用保存液（含200 µM CaCl2的灌注液）重悬。这些细胞现在可用于功能实验（如钙成像/收缩分析、膜片钳等）、培养等。 
	&#8203;注意：细胞也可根据实验室或实验需求重悬于其他特定溶液中。</li>
</ol>
5. 细胞培养
<ol>
	<li>使用血细胞计数板或带网格的盖玻片通过视野计数法对细胞进行计数。由于心肌细胞体积较大，使用血细胞计数板计数并不总是准确，此步骤仅用于大致估算分离得到的细胞数量。</li>
	<li>用DMEM培养基将细胞稀释至约25,000个细胞/mL。向每孔加入1 mL细胞悬液。</li>
	<li>在37 °C、95% O2、5% CO2条件下孵育2小时。</li>
	<li>轻轻吸去各孔中的DMEM培养基，每孔加入2 mL M199培养基。</li>
	<li>在37 °C、95% O2、5% CO2条件下继续孵育最多24小时。</li>
</ol>

<ol><li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li>
<li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li>
<li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca%282%2B%29+handling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005(2012).</li>
<li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23%2F24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca%282%2B%29+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li>
<li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li>
<li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12%2C13-diHOME+to+mediate+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li>
<li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+increased+systolic+Ca2%2B+and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2%2B+transient+kinetics+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li>
<li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+3%27-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li>
<li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXL-1020%2C+a+novel+nitroxyl+%28HNO%29+prodrug%2C+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic%3A+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894(2017).</li>
<li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li>
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<li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li>
<li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22AIP+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140(2019).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688(2018).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866(2021).</li>
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<li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li>
<li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li>
<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li>
</ol>

无利益冲突需披露。

我们这种无需兰格多夫（Langendorff）装置的心肌细胞分离技术的主要优势在于，无需将心脏插管连接至兰格多夫装置，从而限制了缺氧和缺血时间。与经典的兰格多夫技术相比，后者通常需要数分钟时间来取出、清洗并悬挂心脏，常导致心肌细胞发生缺血性损伤，而我们的方法包括 体内 血液清除 通过 冰冷的透明溶液。该冰冷透明缓冲液含有乙二胺四乙酸（EDTA），可不可逆地螯合二价阳离子，有效去除钙离子，因此具有良好的抗凝作用，从而抑制收缩23使用冰冻的溶液可通过减缓离子交换和细胞代谢速率来抑制收缩，从而防止缺血引起的损伤24通过免去主动脉插管的步骤，无Langendorff法能够获得更稳定的心肌细胞，从而制备出更为可靠的心肌细胞样本，获得可信的数据，而传统的Langendorff分离方法并不总能达到这一效果。
这是一种先前发表的无Langendorff法离体分离技术的改良版本18 如所强调部分所示进行了调整 <stron...

几十年来，心脏生物学文献中的一个核心概念是作用的分子机制。要发表可靠的研究，必须明确其作用机制。确定分子机制的一个成熟策略是分离心肌细胞研究，而该方法需要高质量的心肌细胞以获得可信的数据。在心肌细胞上进行的细胞和分子实验，用于阐明作用机制，是研究心肌收缩1、电生理学2、钙（Ca2+）循环3、肌丝对Ca2+的敏感性4、细胞骨架5、代谢6、激素作用7、信号分子8以及药物研究9等领域的金标准。由于小鼠易于进行遗传操作、体型小、寿命相对较短且成本低等优势10，已成为大多数心脏生物学实验的首选物种。然而，利用现有技术可靠地分离出高质量的小鼠心肌细胞并非易事。
实验室分离心肌细胞已有近70年历史11几乎所有分离心肌细胞的技术都依赖于对心脏的消化处理 通过 各种酶（胶原酶、蛋白酶、胰蛋白酶等）。在早期（1950年代至1960年代），采用组织块法，即将心脏取出后切成更小的组织块，置于含有胶原酶/蛋白酶/胰蛋白酶的溶液中孵育1220世纪70年代，实验室采用了改良的“Langendorff”方法13，该方法采用基于冠状动脉灌流的分离技术（通过朗格多夫装置进行酶的逆向灌流）来分离心肌细胞；约50年后的今天，该技术仍是该领域中心肌细胞分离的主要方法14,15,16最近的研究已转向心脏插管技术 体内 以限制缺氧时间和缺血性损伤，从而获得更优质的 cardiomyocyte 分离效果（更高的得率和更佳的质量）17最近，这已发展为进行 体内无兰格多夫装置的心脏灌流18,19,20,21,22我们基于Ackers-Johnson等人的方法，改进了无Langendorff装置的心肌细胞分离技术。18 技术并借鉴了此前多种分离技术中的各个组分。这些关键改进包括注入冰冻的清除缓冲液，以及引入一个支撑平台以稳定针头，从而减少对心脏的操作。本技术中还详细描述了&#160; 注入缓冲液的温度控制（37 °C），可缩短两次之间的间隔时间 体内 注射和消化效果较差，原因是EDTA灌注减少，如先前发表的研究所示18通过减少对心脏的操作，从而最大限度地缩小穿刺部位的尺寸，实现冠状动脉的充分且持续的灌注。我们还采用二次组织块消化法对这一技术进行了优化。&#160;注射的透明化缓冲液中EDTA的含量，并改变了pH值。我们所描述的技术更为可靠、高效，且与使用Langendorff装置相比，无需 extensive training/practice。表1).

<table><tbody><tr><td>10 cc BD Luer-Lok 注射器</td><td>Fisher Sci</td><td>14-827-52</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pyrex 低型烧杯</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-34502-01</td><td></td></tr><tr><td>100 mL 聚丙烯盖玻璃培养基储存瓶</td><td>DWK Life Sciences</td><td>UX-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>带盖 14 mL 圆底聚丙烯试管</td><td>Fisher Sci</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-丁二酮单肟</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td>&gt;98%</td></tr><tr><td>3 cc BD Luer-Lok 注射器</td><td>Fisher Sci</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 无针 BD 注射器</td><td>Fisher Sci</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-22999-84</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS Space Gel 加热垫</td><td>Fisher Sci</td><td>14-370-223</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 27 G × 1/2&quot; 皮下注射针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A3803</td><td>热激组分，冻干粉末，基本无脂肪酸，&gt;98%</td></tr><tr><td>氯化钙二水合物</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>&gt;99%</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>适用于细胞培养，&gt;99.5%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Sci</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Sci</td><td>AAA1071336</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm 经组织培养处理的细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>R&amp;D Systems (Bio-techne)</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp 加热浸入式循环水浴器</td><td>Fisher Sci</td><td>13-874-432</td><td></td></tr><tr><td>Hartman 蚊式止血钳</td><td>World Precision Instruments</td><td>15921</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific Hy-Lite 计数板套装</td><td>Fisher Sci</td><td>02-671-11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>&gt;99.5%</td></tr><tr><td>标签胶带</td><td>Fisher Sci</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 注射泵</td><td>kdScientific</td><td>788100</td><td></td></tr><tr><td>L-谷胱甘肽</td><td>Fisher Sci</td><td>ICN19467980</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TH 研究级酶</td><td>Sigma</td><td>5401135001</td><td>高热蛋白酶浓度</td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher Sci</td><td>MT10060CV</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>小鼠层粘连蛋白</td><td>Corning</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>&gt;99%</td></tr><tr><td>Precision Digital 往复式水浴摇床</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSCIR19</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>适用于细胞培养</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>&gt;99%</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td>&gt;99%</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 无菌细胞滤网</td><td>Fisher Sci</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>学生用精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>VWR 吸水垫</td><td>Fisher Sci</td><td>NC9481815</td><td></td></tr></tbody></table>

一种简单高效且可重复分离小鼠心肌细胞的方法

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

获得可重复且技术简便的高质量心肌细胞制备方法，对于心脏生物学研究至关重要。在心肌细胞上进行的细胞和分子功能实验（例如收缩、电生理、钙循环等）是揭示疾病机制的金标准。小鼠是功能实验的首选物种，而本方法专门用于小鼠心肌细胞的分离。以往依赖兰格多夫（Langendorff）装置的方法需要对主动脉进行插管，操作要求高超的技术和精确性，常导致缺血。目前研究领域正转向无需兰格多夫装置的分离方法，这类方法操作简单、可重复性强，并能获得可用于生理数据采集和培养的活心肌细胞。与主动脉插管相比，这些方法显著缩短了缺血时间，能够稳定地获得心肌细胞。我们对无兰格多夫装置方法的改进包括：首先使用冰冻的灌流清洗液进行初始灌注，采用稳定平台以确保灌注过程中针头稳固，以及增加消化步骤，以确保稳定获得适用于功能检测和培养的心肌细胞。该方法操作简便、快速，对技术要求较低。

在判断分离效果是否成功时，需考察几个关键因素。首先，心肌细胞应呈杆状，且无细胞膜出泡现象，例如成功分离出的细胞即具有此类形态特征 图1典型的分离结果中，约有80%的心肌细胞呈杆状。若分离所得杆状细胞比例低于50%，则视为分离失败，此类心肌细胞不予使用。最后，心肌细胞应处于静息状态。自发性收缩的心肌细胞表明其对Ca2+不耐受，将产生不可靠的数据。采用上述技术进行的所有分离操作中，几乎全部均被视为成功。培养的心肌细胞若呈杆状、无膜泡形成、边缘不圆缩且存活率高，则视为培养成功图2).
表1. 本方法、Langendorff法及先前发表的无Langendorff法在分离小鼠心肌细胞方面的显著差异比较。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63056/Table1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
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在心脏病学领域，细胞和分子功能实验的金标准是心肌细胞。本文介绍了对非兰格多夫技术进行的改进，用于分离小鼠心肌细胞。

获得可重复且技术上简便、能生成高质量心肌细胞的方法，对于心脏生物学研究至关重要。细胞和……

该技术比最常用的兰格多夫装置技术更可靠、更高效，且无需大量练习或培训。该技术的主要优势在于限制了缺血时间，因为初始灌注是在体内进行的。在操作该技术时，必须避免灌流管路中产生气泡，并避免心脏在消化过程中过度移动，这些因素都可能降低细胞得率。本技术的示范者为马克·齐奥洛博士实验室的研究生莎拉·斯特吉尔（Sarah Sturgill）。首先使用新配制的灌流缓冲液冲洗温控歧管。具体操作为：旋入27号针头，并使用鲁尔锁接头排除气泡。确保无气泡残留。为分离心肌细胞，暴露完全麻醉小鼠的胸骨，在中线外侧，从肋骨近端剪至腋窝。随后剪开膈肌，注意剪切深度较浅，以避免损伤心脏。用止血钳夹住胸骨，将肋骨向后折叠以暴露胸腔。轻轻移除心脏表面的心包膜，然后在靠近心脏处的下腔静脉远端剪开。使用27号针头在1分钟内向右心室注射3毫升冰冻澄清缓冲液。接下来，用镊子夹住心脏，将其从体内拉出，并尽可能暴露主动脉。然后使用止血钳夹闭升主动脉，并切除心脏。迅速将夹住的心脏转移至含有10毫升温热灌注缓冲液的聚丙烯培养皿盖中。将夹住的心脏放入支撑平台，并使用连接在多通管上的固定27号针头，在五分钟内向左心室注入10毫升温度控制在37摄氏度的灌注缓冲液。随后，将夹住的心脏及其支撑平台转移至含有约5毫升消化缓冲液的培养皿中。将输入端的注射器更换为含有25毫升消化缓冲液的50毫升注射器。在注射前，清除 manifold 中的所有气泡及残留的灌注缓冲液。小心地将针头重新插入左心室心尖的相同位置。借助灌注泵，使用50毫升注射器将37摄氏度的消化缓冲液注入左心室，持续15分钟。通过校准至排出37摄氏度溶液的水浴夹套控制溶液温度。在将心室组织转移至10毫升烧杯前，将其与心房分离。向烧杯中加入 3 毫升消化缓冲液，用锋利的剪刀将心室组织剪成较大的组织块。用铝箔覆盖烧杯，置于已预热至 37 °C 的摇动水浴中孵育 5 分钟。弃去上清液后，将组织块重悬于 3 毫升消化缓冲液中，吹打约 4 分钟，直至形成均一的混合物。操作完成后，使用70微米尼龙细胞滤网将细胞过滤至一个50毫升聚丙烯管中。用3毫升消化缓冲液冲洗尼龙细胞滤网。将滤液转移回14毫升圆底聚丙烯管中，并进行离心。将沉淀重悬于3毫升终止缓冲液之前，弃去上清液。向细胞悬液中加入54微升100毫摩尔/升氯化钙储备液，使终浓度为1.8毫摩尔/升氯化钙。静置活细胞10分钟，去除含有死细胞的上清液。将细胞沉淀重悬于保存溶液后，细胞可用于功能实验和培养。分离细胞的明场显微镜图像显示，小鼠心肌细胞的分离获得了杆状静息细胞，无膜出泡或边缘圆缩现象。细胞得率约为80%，且存活率高，表明该分离技术成功。 为了成功分离，最重要的是从灌流装置中去除气泡，并将针头插入心脏的同一孔洞中。分离后，心肌细胞可用于细胞和分子水平的功能实验。

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一种持续分离小鼠心肌细胞的简单有效的方法

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新生小鼠心肌细胞的分离与培养

本文介绍了使用兰格多夫灌流系统分离成年小鼠心肌细胞的方法。所获得的细胞具有钙耐受性，电生理静息，并可进行培养，以及利用腺病毒或慢病毒感染来调控基因表达。此外，还可利用MMSYS系统和膜片钳技术分析其功能特性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与功能表征

为了研究心肌细胞的收缩功能和钙瞬变，可从野生型和突变型小鼠心脏中分离出单个心肌细胞。这有助于表征由任何原因引起的心功能障碍中细胞功能障碍所起的作用。...

小鼠心肌细胞的分离与生理学分析

我们描述了一种分离成年小鼠心肌细胞的可靠方法。该方案可稳定地从多种基因修饰小鼠中培养出具有功能的成年心肌细胞。...

成年小鼠心肌细胞的分离与培养用于细胞信号转导研究 体外 心脏肥大

本方案描述了一种可重复地分离成年小鼠心肌细胞并进行长期培养的逐步操作方法，具有较高的得率、纯度和细胞活性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与转导

本方案采用组织块消化法从成年小鼠心脏中分离单个心房心肌细胞。该方法可用于分离右心房或左心房心肌细胞，进而用于膜片钳实验中对心房心肌细胞电生理特性的表征研究。...

从成年小鼠中分离心房心肌细胞

本文介绍了一种用于成年小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染及长期培养的实验方案。...

成年小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染及长期培养

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小鼠模型可用于研究心律失常发生的关键机制。为此，需要高质量的心肌细胞以进行膜片钳测量。本文介绍了一种通过逆行酶解Langendorff灌流法分离小鼠心房和心室肌细胞的方法，该方法可实现钙瞬变与L型钙电流的同步记录。...

分离高质量小鼠心房和心室肌细胞用于同时检测Ca2+瞬变和L型钙电流

本方案描述了对朗根多夫（Langendorff）方法的改进，包括主动脉插管的深度，以实现从成年小鼠中同时分离心房和心室肌细胞。...

对Langendorff法的改良以实现从成年小鼠中同时分离心房和心室心肌细胞

学习一种非Langendorff技术分离小鼠心肌细胞的方法，该方法在体内进行初始灌注以缩短缺血时间，提高细胞产量和存活率，无需大量培训即可操作。

一种简单高效且可重复分离小鼠心肌细胞的方法

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