Name: 基于面积的图像分析算法，用于巨噬细胞-成纤维细胞共生群的定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学习基于面积的图像分析算法，用于定量分析巨噬细胞与成纤维细胞共生群。该方法利用Raw 264.7和NIH/3T3细胞模型，通过自适应算法实现可靠细胞计数，为组织再生和细胞生物学研究提供简便有效的计算工具。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（R01 AR067247）资助，部分由特拉华州INBRE项目资助，该项目由美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所（NIGMS）（P20 GM103446）以及特拉华州政府提供的资助支持。本手稿内容不一定反映资助机构的观点。

1. 细胞培养与图像采集
<ol>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下，使用添加了10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素、1.5 g/L碳酸氢钠和5 µM β-巯基乙醇的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养RAW264.7巨噬细胞。
	<ol>
		<li>进行单层培养成像时，将RAW264.7细胞以25,000个细胞/cm2的密度接种于含1 mL培养基的5 mL细胞培养瓶中进行培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下，使用添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养NIH/3T3细胞11。</li>
	<li>进行共培养成像时，将RAW264.7巨噬细胞与NIH/3T3成纤维细胞按不同比例共同培养，总细胞密度为25,000个细胞/cm2。使用共培养基，其成分为1份RAW264.7培养基（含10% FBS、1%青霉素-链霉素、1.5 g/L碳酸氢钠和5 µM β-巯基乙醇的DMEM）与1份NIH/3T3培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM）混合而成。</li>
	<li>接种后，在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞，使其达到80%汇合度的活细胞密度。</li>
	<li>使用配备40倍物镜的倒置显微镜对细胞进行成像。所有图像以灰度模式采集，并以原始'.czi'文件格式导出。
	<ol>
		<li>评估该算法准确分析不同成像质量图像的能力。采集焦距不同的图像，获得“非膨大”形态图像（图2）和“膨大”形态图像（图3）。</li>
		<li>在进行MATLAB分析前，使用ImageJ软件中的“批量转换”功能将原始'.czi'文件导出并转换为8位TIFF（.tiff）图像格式。将转换后的图像存储于本地文件夹，并手动将这些图像文件转移至相应的MATLAB目录中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 图像分析——主要利用 &#34;monoculture.m&#34; 文件进行单培养分析
注意：以下步骤使用 MATLAB 完成。MATLAB 协议使用了三个文件：&#34;process.m&#34;（补充代码文件 1），包含算法的文件；&#34;monoculture.m&#34;（补充代码文件 2），用于分析单培养图像的运行文件；以及 &#34;coculture_modified.m&#34;（补充代码文件 3），用于分析共培养图像的运行文件。
<ol>
	<li>使用基于面积的方法获取显示相对高度变化的细胞图像。利用 'imshow()' 函数对每个子图像输出图像结果。将用于分析的图像文件复制并粘贴到文件夹中，并在以下命令中输入文件名。按下 运行 以启动程序。 
	imread('filename.tiff')
	<ol>
		<li>通过“重建开运算”后接“重建闭运算”的方法分析图像，使用源函数8 来增强前景与背景之间的对比。使用第一个命令执行重建开运算，使用第二和第三个序列执行重建闭运算 
		'imopen()' 
		'imerode()' 
		'imreconstruct()'</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用基于百分位的识别系统将重建后的图像二值化为纯黑色和纯白色像素。注意，在该系统中，细胞被转换为像素值为“255”的纯白色，而背景和其他非细胞物体则被转换为像素值为“0”的纯黑色。
	<ol>
		<li>通过“最大相关像素”的百分位差值来区分细胞与背景，其中“最大相关像素”是指构成给定图像至少0.5%的最大像素值。</li>
		<li>分析并评估RAW264.7巨噬细胞的像素值。如果这些值在最大相关像素的4.5%范围内，则将该像素标记为细胞。 
		注：此命令可通过简单的if语句实现。</li>
		<li>对于包含肿胀状细胞轮廓的图像（如 图2 所示），需采用迭代程序校正细胞中心区域错误的二值化结果（称为“孤岛”；见下文），具体步骤如下。</li>
		<li>确定总细胞覆盖率的初始估计值；本研究中采用60%。应注意，图像中细胞数量应取决于细胞覆盖率，因此细胞数量与细胞覆盖率之间的关系可通过实验确定。利用该关系确定变量“Alpha”和“kappa”。 
		注：“Alpha”表示一个3×1向量，包含以下相对高度百分位：识别细胞的高度百分位、识别背景的高度百分位，以及“孤岛”（即强度值显著低于细胞值的区域）通常所处的高度百分位。“Kappa”表示图像中细胞覆盖的总面积。</li>
		<li>运行算法，该算法将（i）使用alpha和kappa的初始估计值分析图像，以填充部分孤岛区域，并（ii）利用分析后的细胞计数和覆盖率重新计算kappa。如果kappa值在初始估计值的10%范围内，则进入下一步。 
		注：对于包含RAW264.7和NIH/3T3细胞的图像，alpha被确定为[4.3, 5.5, 10]。换言之，与最大相关像素相差4.3%确定了识别细胞的高度百分位，相差5.5%确定了识别背景的高度百分位，相差10%确定了孤岛通常所处的高度百分位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像二值化后，使用开源的圆检测算法自动确定平均细胞面积，该算法对二值化图像执行霍夫变换12,13,14。使用以下命令获取图像中所有检测到的圆的中心位置和半径组成的向量。 
	'[centers, radii] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])' 
	该命令中的'A'为所选图像，[minradius, maxradius]为算法尝试检测的半径范围。 
	注：该确定平均细胞面积的方法假设巨噬细胞的形态为圆形且细胞间形态一致10。根据实验数据，在40倍放大下，巨噬细胞的半径通常介于30至50像素之间。该像素范围被定义为圆检测算法的可接受范围。其他细胞类型的半径可能显著不同，需通过实验分析确定。
	<ol>
		<li>利用输出的半径值，通过取平均计算平均细胞面积。至少分析10个细胞以确保面积识别的准确性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用平均细胞面积确定图像中细胞的总数。
	<ol>
		<li>遍历图像矩阵并统计细胞像素的总数。通过将细胞像素数除以图像中的总像素数来确定总细胞覆盖率。通过将细胞像素数除以单个细胞的平均面积来确定图像中细胞的总数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 利用 &#34;coculture_modified.m&#34; 文件进行共培养图像分析（以该文件为主）
注意：以下步骤使用 MATLAB 完成。
<ol>
	<li>使用基于面积的方法获取显示相对高度变化的细胞图像。通过为每个子图像调用 'imshow()' 函数来输出每一步的图像结果。将用于分析的图像文件复制到工作区，并在以下命令中输入文件名。按下 运行 以启动程序。 
	'imread('filename.tiff')'
	<ol>
		<li>利用源函数10 对图像进行“重建开运算”（opening by reconstruction），随后进行“重建闭运算”（closing by reconstruction），以增强前景与背景之间的对比。使用第一个命令执行重建开运算，使用第二和第三个命令序列执行重建闭运算。 
		'imopen ()' 
		'imerode()' 
		'imreconstruct()'</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过利用 RAW264.7 与 NIH/3T3 两种细胞之间的高度差异，采用两种选择性二值化方法对包含 RAW264.7 与 NIH/3T3 细胞的共培养样本进行分析。
	<ol>
		<li>利用 RAW264.7 和 NIH/3T3 细胞的图像实验测定参数 'phi'，其中 phi 表示两种细胞类型之间的相对高度差异。先猜测一个初始 phi 值，并通过迭代调整，使细胞计数与覆盖率与人工计数结果高度一致，适用于该特定的 RAW264.7 与 NIH/3T3 共培养体系。 
		注：本研究中使用的 phi 值确定为 3.2。phi 用于选择性地过滤图像，使其仅显示 RAW264.7 细胞，如 图 4C 所示。</li>
		<li>以与单培养图像相同的方法，确定 RAW264.7 细胞的数量和总细胞覆盖率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在不使用 phi 参数的情况下，再次分析经过分水岭变换的图像，以同时检测巨噬细胞和成纤维细胞。通过选择性减去使用步骤 2 中所述的标准阈值分割和基于面积的定量方法获得的 RAW264.7 细胞像素，获取 NIH/3T3 成纤维细胞的数据。
	<ol>
		<li>完成整幅图像的分析后，通过从总细胞像素数中减去 RAW264.7 细胞像素总数，确定 NIH/3T3 细胞的总像素数。通过将每种细胞系的细胞像素数除以图像总像素数，计算 NIH/3T3 和 RAW264.7 细胞的覆盖率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+sizing+of+cells+in+microscope+images+by+template+matching+and+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Fifth+International+Conference+on+Image+Processing+and+its+Applications%2C+1995%22%5BJournal%5D)">Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection.</a> Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).</li>
<li>Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+type+cell+detection+and+counting+method+based+on+FCN%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+-+2017+IEEE+17th+International+Conference+on+Bioinformatics+and+Bioengineering+%28BIBE%29%22%5BJournal%5D)">An extended type cell detection and counting method based on FCN.</a> Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).</li>
<li>Choudhry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+automated+colony+and+cell+counting+by+digital+image+analysis+based+on+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection.</a> PLoS One. 11 (2), 0148469(2016).</li>
<li>Torre, V., Poggio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22MIT+Artificial+Intelligence+Lab+Memo+768%22%5BJournal%5D)">On edge detection.</a> MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).</li>
<li>Fuller, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+vital+fluorescent+staining+method+for+monitoring+bacterial+transport+in+subsurface+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).</li>
<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+distance+and+watershed+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Processing%22%5BJournal%5D)">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).</li>
<li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html">https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html</a> (2022).</li>
<li>Bala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+watershed+image+segmentation+technique+using+MATLAB%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Scientific+and+Engineering+Research%22%5BJournal%5D)">An improved watershed image segmentation technique using MATLAB.</a> International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).</li>
<li>Glaros, T., Larsen, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation%2C+tissue+damage+and+organ+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Landmark+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).</li>
<li>Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+and+fibroblast+interactions+in+biomaterial-mediated+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451(2019).</li>
<li>Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+growth+factor+gene+delivery+with+collagen-triggered+wound+repair+cascades+using+collagen-mimetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%26+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides.</a> Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).</li>
<li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html">https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html</a> (2022).</li>
<li>Atherton, T., Kerbyson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+invariant+circle+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Image+and+Vision+Computing%22%5BJournal%5D)">Size invariant circle detection.</a> Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).</li>
<li>Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+Hough+transform%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Computer+Applications%22%5BJournal%5D)">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform.</a> International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).</li>
<li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-analysis+based+readout+method+for+biochip%3A+Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads%2C+micropads+and+patient+leukemia+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell.</a> Micron. 133, 102863(2020).</li>
<li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads+and+leukemia+cells+from+optical+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Signal+Processing+and+Control%22%5BJournal%5D)">Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images.</a> Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).</li>
<li>Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+and+astrocyte+co-culture+assay+for+high+content+analysis+of+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173(2009).</li>
<li>Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+signaling+in+co-cultures+of+macrophages+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts.</a> Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).</li>
<li>Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+implant+acceptance+and+wound+healing%3A+material+selection+and+implant+location+modulate+macrophage+and+fibroblast+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).</li>
<li>Wang, Z., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalizing+cell+segmentation+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Generalizing cell segmentation and quantification.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 189(2017).</li>
<li>Zou, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+validation+of+image+segmentation+quality+based+on+a+spatial+overlap+index%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+Radiology%22%5BJournal%5D)">Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index.</a> Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

我们设计了一种基于面积的通用方法，可根据细胞高度准确且高效地计数细胞，从而实现在共培养体系中无需染色即可对细胞进行定量分析。该方法的关键步骤包括建立相对强度系统，以区分不同细胞。采用相对高度分析具有两个优势：一是无需引入外部参数，因为相对参数对于特定细胞类型和参数而言是恒定的；二是无需为每幅图像单独设置绝对的亮度/对比度水平。此外，基于百分位数的系统使得在同一图像中可同时分析多种细胞类型，前提是不同细胞类型在图像中处于不同的高度位置。
基于百分位数的系统定义为与最大像素值的差异，而不是与平均值的差异。这样做是为了避免算法因平均强度值而产生偏差，因为平均强度值依赖于图像中细胞的数量和融合程度。此外，引入了“最大相关像素”以防止最大强度异常值显著影响数据——最大相关像素需要至少代表0.5%的群体，这是一个实验确定的数值。其他步骤包括使用基于面积的定量系统，而非计数单个实体。这确保了在计数细胞时，细胞碎片化或错误的二值化会被最小化，因为受影响的总面积与单个细胞的面积相比非常小。
该算法中实施了多种故障排除方法。最初对单层细胞图像进行...

在图像分析技术中，通常会使用软件以确保结果的准确性、高效性和无偏性。对于基于细胞的检测，一个常见问题是细胞的误识别。当图像的焦距和对比度设置不当时，可能导致细胞模糊，使得单个细胞的边界难以辨认1。图像中若存在无关特征，如孔隙、气泡或其他不需要的物体，可能干扰计数过程，减慢计数速度并导致误识别。此外，细胞计数工作可能十分繁重，对数百个重复样本进行计数极为耗时。更重要的是，人工计数过程中存在固有的主观偏差，因此在细胞识别方面的决策往往不够准确2。自动化软件具有突破上述所有问题的巨大潜力，它可根据明确定义的识别标准，快速而精确地区分细胞与无关物体，甚至能检测到远超人类识别能力的微小结构，从而降低研究者主观因素的影响。利用自动化软件识别细胞的常用技术主要包括两种方法：分割（segmentation）和阈值化（thresholding）3。本文展示了一种可广泛适用的基于区域的实验方案，可在一种广泛可及的软件框架内实现快速、准确且低成本的细胞计数。
分割技术（如边缘检测）通过利用图像内的强度差异来分离单个细胞。将细胞与图像其余部分区分开的强度变化通常表现为亮度的急剧变化4。边缘检测包括一个正则化滤波步骤，随后是一个检测强度变化的微分步骤。该微分过程可识别图像中高强度变化的边缘和轮廓，并将这些边缘和轮廓与细胞的存在相关联。&#160;尽管含噪声的图像可通过去噪算法进行处理4，但边缘检测技术最适合用于分析背景噪声较低的图像。当细胞边界清晰易辨，且未受到与细胞存在无关的亮度轮廓、细胞模糊、无关物体或明确的细胞内结构干扰时，该方法的效果最佳1,2。如果图像噪声特别严重，可通过荧光染色或转染荧光蛋白进一步区分细胞2,5。虽然这能显著提高分割技术的准确性，但需要额外的成本和更多时间投入来准备用于成像的细胞培养物。
阈值分割技术涉及将图像划分为两个类别：前景和背景，其中细胞被归类为前景3。这些技术利用颜色/对比度的变化来定义物体的表观高度；通常比背景“更高”的物体可被轻易识别为细胞。分水岭变换即通过将亮像素对应的表面视为前景、暗像素对应的表面视为背景来实现这一过程6,7。通过基于高度的识别，只要噪声与目标物体位于同一焦平面内，阈值分割技术通常能够有效区分噪声与目标物体。当与基于面积的定量方法结合使用时，分水岭变换可在常规分割技术（如边缘检测）难以准确识别的环境中，精确识别出物体群组。
流域变换通常与分割技术结合使用，以对图像进行更清晰的分析，从而提高细胞计数的准确性。在此过程中，流域变换用于在分割前突出显示潜在的兴趣区域。流域变换通过识别图像前景中的细胞，提供独特的优势，可消除诸如背景不均匀区域等潜在的细胞假阳性，从而提高分割分析的准确性。然而，在将基于细胞的图像适配到流域变换时可能会遇到困难。细胞密度较高的图像容易出现欠分割问题，即成簇的细胞被识别为单一整体而非独立个体。此外，噪声或剧烈的强度变化可能导致过分割，即算法过度分离细胞，从而产生过多且不准确的细胞计数8。
本文详细介绍了一种通过在基于区域的定量算法中引入阈值分析的组成部分，以最大限度减少分水岭变换主要缺点的方法，如图1所示。值得注意的是，该算法采用开源和/或广泛可获得的软件实现，且该细胞计数框架的应用无需昂贵的试剂或复杂的细胞制备技术。选用RAW264.7巨噬细胞来演示该方法，因其在调控结缔组织维持和伤口愈合过程中发挥关键作用9。此外，由于NIH/3T3成纤维细胞在组织维持与修复中具有重要作用，也对其进行了分析。成纤维细胞常与巨噬细胞共存并提供支持，因此在共培养研究中需要区分这些表型不同的细胞类型。
通过计算细胞所覆盖的面积以及单个细胞的平均占据面积，可对高活细胞密度（VCD）图像中的细胞数量进行可靠且高效的定量分析。相较于分割方法，采用阈值法进行细胞识别还支持更复杂的分析，例如同时分析共培养体系中不同类型细胞的实验。研究发现，NIH/3T3成纤维细胞通常与RAW264.7巨噬细胞共定位于伤口愈合部位，但其生长所处的焦平面与巨噬细胞的焦平面明显不同10。因此，针对不同类型的细胞分别运行多个阈值算法，以定义背景和前景，从而实现在同一图像中对两种不同细胞类型的准确计数。

<table><tbody><tr><td>Axio Observer 7 倒置显微镜</td><td>Zeiss</td><td>1028290770</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>12430047</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 软件</td><td>MathWorks</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3 细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL - 1658</td><td></td></tr><tr><td>青霉素&amp;ndash;链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB - 71</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-25G</td><td></td></tr><tr><td>T75 细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>CLS3814-24EA</td><td></td></tr></tbody></table>

基于面积的图像分析算法用于定量巨噬细胞-成纤维细胞共培养

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

细胞定量对于广泛的生物学和生物化学研究是必要的。传统的细胞图像分析通常采用荧光检测方法，例如免疫荧光染色或转染荧光蛋白，或采用边缘检测技术，但由于图像背景中的噪声和其他非理想因素，这些方法往往容易产生误差。
我们设计了一种新算法，能够准确计数并区分巨噬细胞和成纤维细胞，这两种不同表型的细胞在组织再生过程中常发生共定位。该算法采用 MATLAB 实现，通过细胞与背景高度的差异来区分不同的细胞类型。主算法基于面积的方法开发，以应对细胞大小/结构的变异以及高密度接种条件。
利用基于特定细胞类型实验数据计算得到的细胞覆盖率等内部参数，通过二次迭代算法对细胞结构中的非理想因素进行了校正。最后，采用一种隔离算法分析共培养环境，该算法根据图像中相对高度差异的评估结果选择性地排除不同类型的细胞。该方法在单细胞培养中的细胞计数准确度误差控制在5%以内，在共培养条件下的误差控制在10%以内。

在单培养条件下对非球状 RAW264.7 巨噬细胞进行了分析，细胞密度为 25,000 个细胞/cm2。对细胞培养物拍摄了代表性图像，并在 ImageJ 中将其转换为 8 位 tiff 格式后，使用 MATLAB 进行处理。整个过程中算法的输出结果已在 图 2 中针对该代表性图像进行了记录和展示。在此图像中，算法计数结果为 226 个细胞，通过与手动计数结果（241 个细胞）进行比对验证，误差为 6.2%。对至少 10 张 RAW264.7 细胞图像进行算法计数，其平均误差为 4.5 ± 1.9%。
使用迭代算法对呈膨胀状的RAW264.7巨噬细胞进行了分析。在大多数图像中，观察到的膨胀效应主要是由于对焦平面略高于细胞所贴附的基底平面所致。因此，大多数图像均以非膨胀形态采集，此类图像的分析显著更为简便。针对因弯月面效应或其他光学干扰而无法避免采集次优图像的情况，开发了用于分析膨胀状图像的算法。整个过程中典型的算法输出结果已记录并展示于图3中。...

我们提出一种方法，该方法利用一种可推广的基于区域的图像分析方法来识别细胞数量。对不同细胞群体的分析利用了不同细胞类型之间显著的细胞高度和结构差异，并通过自适应算法实现。

细胞计数在广泛的生物学和生物化学研究中是必要的。传统的细胞图像分析通常采用……

该方法可用于帮助研究人员利用简单有效的基于面积的分析手段，对共培养的细胞进行分析和计数。该技术使用广泛可得的软件即可实现，操作相对简便，能够可靠且准确地识别共培养环境中的各类细胞类型。该方法可为特定细胞共培养体系如何协同作用以促进组织再生提供深入见解。该方法还可用于验证单培养体系下的生物标志物研究。首先，在5毫升细胞培养瓶中加入1毫升DMEM培养基，该培养基需添加胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素、碳酸氢钠和β-巯基乙醇，将264.7巨噬细胞以每平方厘米25,000个细胞的密度接种，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下进行单培养成像。NIH/3T3细胞则在添加10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。进行共培养成像时，使用共培养基在不同比例和总密度为每平方厘米25,000个细胞的条件下共同培养RAW 264.7巨噬细胞和NIH/3T3成纤维细胞，共培养基由等体积的RAW 264.7培养基和NIH/3T3培养基混合而成。接种后，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育细胞，使其达到80%的细胞汇合度。使用配备40倍物镜的倒置显微镜采集细胞图像，以评估该算法准确分析不同成像质量图像的能力。以灰度获取不同焦距下的图像，生成非球状和球状图像，并将其导出为原始 czi 文件。若要使用基于面积的方法获取细胞图像，请将用于分析的图像文件复制并粘贴到 bin 中，并通过执行命令输入文件名。按运行以启动程序。通过先进行重建开运算，再执行重建闭运算，并使用源函数运行相应命令，从而增强前景与背景的对比度，实现图像分析。采用基于百分位的识别系统对重建后的图像进行二值化处理，通过计算与最大相关像素的百分位差值来区分细胞与背景，其中最大像素值应至少占给定图像的0.5%。对原始264.7巨噬细胞的像素值进行分析与评估，确保其值位于最大相关像素值的4.5%范围内。然后将该像素标记为细胞。对于包含膨大细胞轮廓的图像，采用迭代程序校正细胞中心处错误的二值化结果。确定细胞总覆盖面积的初始估计值。运行算法，使用 alpha 和 kappa 的初始估计值分析图像，以填充部分岛状区域。然后利用分析后的细胞计数和覆盖率重新计算 kappa 值。为确定图像二值化后的平均细胞面积，执行命令以获取图像中所有检测到的圆的中心位置和半径向量。利用半径输出值，通过取平均值计算平均细胞面积，并分析至少10个细胞以确保面积识别的准确性。按照此前所述命令进行图像分析。然后，通过使用raw 264.7和NIH/3T3细胞的图像实验测定参数phi，对含有raw 264.7和NIH/3T3细胞的共培养体系进行分析。假设一个初始的 phi 值，并进行迭代，直至细胞计数和覆盖面积与原始 264.7 和 NIH/3T3 共培养的手动计数结果高度接近。按照先前单层培养图像的分析方法，确定原始 264.7 细胞在总细胞覆盖面积中的数量。再次分析经过分水岭变换的图像，但不使用 phi 参数，以同时检测巨噬细胞和成纤维细胞。通过选择性减去使用前述标准阈值法和基于面积的定量方法获得的原始264.7细胞像素，获取NIH/3T3成纤维细胞数据。对非膨大型原始264.7巨噬细胞进行了分析，并记录了算法输出结果。利用该算法对图像进行平均面积计算，共计数226个细胞，而人工计数结果为241个细胞，误差值约为6%。同时对膨大型原始264.7巨噬细胞进行了分析。使用算法对图像进行平均面积计算，共计数221个细胞，经人工计数验证为252个细胞，误差值约为12%。对同时包含RAW 264.7巨噬细胞和NIH/3T3成纤维细胞的共培养样本进行了分析。算法输出的RAW 264.7巨噬细胞计数为137个，而人工计数结果为155个细胞，误差值约为11%。为评估细胞计数算法的稳健性，采用自动细胞识别与人工计数两种方法对五幅RAW 264.7巨噬细胞图像进行了计数。五幅图像的Dice系数平均参数为0.85。本方案中的关键步骤是使用基于百分位数的参数，这使得在单培养和共培养图像中均能实现稳健的细胞检测。该方案可用于鉴定目标细胞，进而利用分子生物学技术对共培养体系中定义特定细胞群体的生物标志物及生物标志物的发育进行分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

基于面积的图像分析算法，用于巨噬细胞-成纤维细胞共生群的定量

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利用微图案化细胞改善药物效应的可视化与定量分析

本文介绍了一种从大鼠肝细胞原代培养中获取巨噬细胞的新方法。该方法利用巨噬细胞在培养过程中的增殖特性，随后通过振荡培养瓶并利用巨噬细胞对塑料培养皿的特异性贴附能力进行纯化。该技术无需复杂设备和操作技能，即可高效地获得肝脏巨噬细胞。...

一种从成年肝细胞混合原代培养物中分离巨噬细胞的简单高效方法

细胞分化受到多种微环境因素的调控，包括基质成分和基底材料特性。本文介绍一种技术，该技术结合细胞微阵列与牵引力显微镜，用于评估在不同微环境背景下细胞的分化状态以及细胞与基底之间的生物力学相互作用。...

一种用于细胞分化与牵引力相关性分析的高通量细胞微阵列平台

靶向特异性探针是分析多种疾病（例如，炎症、感染和肿瘤发生）中分子机制（如蛋白质表达）的一种创新工具。本研究描述了一种利用F4/80特异性荧光介导断层成像技术，对结肠炎小鼠模型中肠道巨噬细胞浸润进行定量三维断层评估的方法。...

用于检测与定量小鼠肠道巨噬细胞相关炎症的荧光介导断层成像技术

小胶质细胞是大脑中的免疫细胞，可通过形态学变化来监测并响应大脑生理状态的改变，这些形态变化可进行定量评估。本方案概述了一种基于 ImageJ...

使用 ImageJ 对免疫组织化学处理组织的显微照片进行小胶质细胞形态定量分析

本文介绍一种简单且易于实施的策略，用于对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片中的免疫细胞进行可视化、定量和定位分析。该方法结合了现有的成像技术和数字分析手段，旨在拓展成像检测的多重检测能力和多参数分析水平。...

肿瘤微环境中免疫细胞群体的可视化、定量与定位分析

本文描述了从MCF7细胞融合单层的共聚焦图像中定量分析1）黏着斑的大小和数量，以及2）细胞形态指数及其分布。...

MCF7细胞单层中细胞-基质黏附面积与细胞形态分布的量化分析

在免疫治疗和单细胞基因组分析的时代，癌症生物学需要新型的体外和计算工具，以在适当的时空背景下研究肿瘤-免疫界面。本文介绍了在二维和三维条件下利用肿瘤-免疫微流控共培养的实验方案，可兼容对细胞功能进行动态、多参数的监测。...

用于解析体外肿瘤微环境中免疫应答的微流控共培养模型

神经退行性疾病与小胶质细胞功能失调相关。本文介绍了一种利用iPSC来源的巨噬细胞体外吞噬神经母细胞瘤细胞的检测方法。文中描述了活细胞延时成像和固定细胞高内涵成像的定量显微镜读数分析方法。...

诱导多能干细胞来源巨噬细胞吞噬死亡神经母细胞瘤细胞的体外定量成像分析

本文介绍了一种研究原代人单核细胞来源的巨噬细胞与三维（3D）I型胶原基质中肿瘤球体相互作用的实验方案，可用于比较微环境的可溶性因素和物理特性对细胞侵袭的影响。...

巨噬细胞-肿瘤类球体共侵袭实验

学习基于面积的图像分析算法，用于定量分析巨噬细胞与成纤维细胞共生群。该方法利用Raw 264.7和NIH/3T3细胞模型，通过自适应算法实现可靠细胞计数，为组织再生和细胞生物学研究提供简便有效的计算工具。

基于面积的图像分析算法用于定量巨噬细胞-成纤维细胞共培养

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