Name: 提高可重复性以满足细胞外囊泡研究的最少信息 2018纳米颗粒跟踪分析指南 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习使用NanoSight LM10进行纳米颗粒追踪分析的标准化操作流程，以准确表征细胞外囊泡的大小和浓度。该方案为新手操作者提供详细步骤，确保实验结果的可重复性和可靠性。

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本工作获得了堪萨斯州对中西部比较干细胞生物学研究所（MICSCB）的资助，&#160;约翰逊癌症研究中心对 MLW 及美国国立卫生研究院（NIH）&#160;R21AG066488 至&#160;LKC获得了MICSCB的GRA资助。作者感谢Santosh Aryal博士提供本项目中使用的脂质体，以及Weiss和Christenson实验室成员提供的有益讨论和反馈。感谢Hong He博士提供的技术支持。MLW感谢Betti Goren Weiss给予的支持与指导。

1. 通用实验方案指南
<ol>
	<li>将显微镜放置在气浮台或至少无振动的实验台上。确保尽量减少外界振动（例如踩踏地板、触碰实验台、关门、实验室人员走动）的影响。</li>
	<li>在所有视频记录过程中，将激光模块的温度设置并维持在恒定温度。 
	注意：选择25 °C是因为纳米颗粒分析仪在此温度下进行了校准。因此，所有仪器使用者都必须知晓并使用该校准温度。室温不是可接受的设置，因其可能发生变化。</li>
	<li>确保所有稀释液（也称为阴性对照，如杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）、超纯蒸馏水[DW]）均使用与待测纳米颗粒样品相同的相机增益和检测阈值进行NTA表征。使用已表征的DPBS冲洗激光模块并对样品进行稀释。如果阴性对照DPBS中的污染物水平显著，应在样品结果中予以校正。</li>
	<li>样品在评估前应储存在4 °C环境中，切勿冷冻，以免造成脂质体样品降解。分析前将样品、标准品和稀释液在室温下复温30分钟。 
	注意：样品处理方式针对所检测材料的具体特性而定。</li>
	<li>使用快速测量模式检测样品和标准品，以确定合适的稀释倍数，使颗粒浓度达到107至109颗粒/mL（约每NTA视频画面50至100个颗粒），该范围被确定为NTA分析的最佳条件。 
	注意：作者发现，该范围内较高浓度的颗粒可产生更一致且可重复的结果。</li>
	<li>在SOP选项卡的采集框中，填写快速和标准测量的所有相关字段，包括所用稀释倍数和稀释液。</li>
</ol>
2. 50 nm 和 100 nm 尺寸校准标准品的制备
注意：参见材料表。
<ol>
	<li>50 nm 尺寸的传递标准品，稀释比例为 1:5,000
	<ol>
		<li>将 2 µL 的 50 nm 标准品加入到 9,998 µL 的经 0.22 µm 滤膜过滤的 10 mM 氯化钾（KCl）/0.03% Tween 20 超纯水中，置于已用超纯水冲洗两次的 15 mL 圆锥形离心管中。将稀释后的 50 nm 标准品在 4 °C 下保存，可稳定长达一年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>100 nm 尺寸的传递标准品，稀释比例为 1:333
	<ol>
		<li>将 30 µL 的 100 nm 标准品加入到 9,970 µL 的经 0.22 µm 滤膜过滤的 10 mM KCl/0.03% Tween 20 超纯水中，置于已用超纯水冲洗两次的 15 mL 圆锥形离心管中。将稀释后的 100 nm 标准品在 4 °C 下保存，可稳定长达一年。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 激光模块的清洁与组装
<ol>
	<li>目视检查激光模块和流动池盖板的窗口是否有划痕或缺陷。 
	注意：如果任一玻璃表面有划痕，可能会影响成像。</li>
	<li>使用高质量的镜头清洁剂和镜头纸轻轻清洁两个玻璃表面。请勿在玻璃表面使用擦拭纸巾或纸巾。</li>
	<li>组装前，确保O形圈密封圈正确安装在流动池盖板的凹槽内。</li>
	<li>将流动池盖板安装到激光模块上，确保电极接触点方向正确。将4个带弹簧的旋钮螺钉穿过流动池板，并旋入激光模块的螺纹孔中，但暂不单独拧紧。</li>
	<li>对流动池盖板施加均匀向下的压力，以对角交替的方式均匀拧紧旋钮螺钉，直至紧密贴合。仅需用手拧紧即可，切勿过度拧紧。 
	注意：旋钮螺钉拧紧不均可能导致激光模块表面破裂。新型设计的旋钮螺钉在达到适当压力时会自动“触底”，从而避免过度拧紧。</li>
</ol>
4. 样品前及样品间激光模块的冲洗程序
<ol>
	<li>使用新开封的DPBS容器，并分装至经过三次冲洗的15 mL聚丙烯管中。确保用于冲洗或稀释样本的产品在使用前已通过NTA表征（参见步骤1.3）。</li>
	<li>用1 mL DPBS将两个带有滑动锁接头的1 mL结核菌素注射器冲洗3次，以去除任何颗粒残留物。可任选一个端口作为输入端口，但在实验过程中需始终使用同一端口。禁止使用更大的注射器，以免因注射器重量和体积增加而导致注射器端口破裂。</li>
	<li>移除并丢弃1 mL注射器的推杆st 结核菌素注射器并插入剩余的端口，作为废液/样本储液 reservoir。 
	注意：未取出柱塞将导致样品室压力升高，并在密封圈周围发生泄漏。</li>
	<li>填充 2nd 注射器中装入1 mL DPBS，然后将其连接到流室盖的进样口。</li>
	<li>将激光模块倾斜持握，使出口端的注射器接口朝上，以便在缓慢向激光模块内注入DPBS时排出腔内的空气。</li>
	<li>通过向入口注入1 mL空气，将激光模块中残留的DPBS冲洗干净。重复此冲洗步骤2次。</li>
	<li>最后一次冲洗后，应尽可能完全排空激光模块。 
	注意：在完成50 nm标准品的NTA分析后，必须进行彻底且仔细的冲洗，因为这些颗粒会残留在激光模块中。激光模块现已准备就绪，可供使用。</li>
</ol>
5. 将激光模块放置在显微镜载物台上
<ol>
	<li>找到显微镜臂上的激光模块聚焦对准导引（图2），并使用聚焦旋钮对其进行对准。</li>
</ol>
<img alt="用于光学精度的显微镜调焦机制，标有校准刻度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：激光模块调焦对准指南。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>面对显微镜，将激光模块放入带槽的载物台上，并轻轻向右滑动至极限位置。 
	注意：若操作仔细，可在样品之间更轻松地定位对准和焦点光斑。</li>
	<li>打开激光控制箱上的摇杆开关。</li>
</ol>
6. 激光模块的聚焦与定位
注意：此步骤必须在腔室内有液体的情况下进行。
<ol>
	<li>加载NTA软件（参见 材料表从桌面删除。 
	注意：可能会出现错误提示，“COM3 上未找到温度硬件。只需关闭并重新打开软件即可修复。</li>
	<li>点击 启动相机 在……之下 捕获 左上角方框中的标签。如果摄像头在5分钟后自动关闭，只需单击 启动相机 再次启动。</li>
	<li>在同一标签页中，调整 相机水平 到 14 至 16 增强激光线亮度，简化颗粒识别与聚焦。</li>
	<li>通过推入或拉出目镜筒左侧上方的滑块，将图像从相机转向目镜。</li>
	<li>找到密度增加的区域，通常称为 指纹将指纹在视野中垂直居中并调焦。 
	注意：激光线将位于指纹的左侧。调暗房间有助于找到指纹并聚焦于激光线。</li>
	<li>将激光线置于视野中央；根据计算机屏幕上的观察，移动顶部滑块以将光线引导至相机。 
	注意：屏幕上现在可见的激光线是目镜视野的镜像；目镜中的左侧在计算机屏幕上会显示为右侧。</li>
	<li>使用调焦旋钮调整焦距，使屏幕上单个运动颗粒的图像更清晰。 
	注意：由于景深限制，并非所有颗粒都能完全聚焦，这是可接受的。即使略微失焦的颗粒也会被相机捕获并由软件分析。</li>
</ol>
7. 将标准品/样品/稀释液加入激光模块以进行纳米颗粒跟踪分析（NTA）
<ol>
	<li>用已冲洗的1 mL结核菌素注射器吸取1 mL标准品/样品/稀释液，并将其连接至流式池盖的进样口。推动活塞，直至连接在出样口的开放注射器中可见液体流出。</li>
	<li>在相机视野中，向激光线右侧移动至颗粒数量均匀的区域。如有必要，调整垂直方向，使水平光带居中。重新对焦，直至视野中颗粒数量最多。确保在后续所有测量中尽可能保持此位置不变。</li>
	<li>调节相机水平，直至相机视图右上角的暗信息符号间歇性闪烁。 
	注意：这有助于确保在每次数据采集系列中，均在最低灵敏度水平下一致地选择相机水平。 
	注意：相机水平在采集过程中不可更改。</li>
</ol>
8. 校准的验证
注意：建议在样品分析前使用尺寸标准品（见第2节）验证模块校准。常规验证对于确保测量结果的准确性十分必要。在多用户实验室中，个别用户对软件配置参数的调整可能无意中导致数据采集不准确。对于关键数据的采集，每日验证是良好实验室规范的基本要求。验证结果的日间重复性应包含在报告的结果中。通常，校准由技术人员设定，普通用户无法调整，除非该用户具有管理员权限。此措施可防止个别用户未经授权重新配置系统。
<ol>
	<li>将稀释的标准品（见第2节）在室温下预热30分钟。</li>
	<li>短暂涡旋振荡标准品，然后按照第7节所述方法上样。</li>
	<li>按照第10节所述进行样品NTA分析，并记录数值用于后续计算变异系数，若校准正确，变异系数应小于2%。</li>
</ol>
9. 优化 NTA 样本浓度
注意：当相机水平和样品浓度调节适当时，屏幕应显示 50 至 100 个可测量的颗粒。若对样品的颗粒数量是否合适存在疑问，此时可对该样品进行快速测量（参见步骤 9.1 至 9.7）。该操作用于在进行较长时间视频采集前快速评估样品特性。快速测量选项卡位于底部中间框内的SOP选项卡中。
<ol>
	<li>将捕获时长设置为30 s。</li>
	<li>接受现有的默认文件名，或通过点击...标签指定新的存储位置以生成数据文件。</li>
	<li>勾选目标温度复选框，并输入所需的温度值。</li>
	<li>按照前述方法加载样品（步骤 7.1），然后点击创建并运行脚本。</li>
	<li>30 s 视频采集完成后，等待视频屏幕右下角显示每帧的粒子数量。如果粒子数超过 100，需对激光模块冲洗 3 次（如步骤 4.6 中所述）。</li>
	<li>使用已表征的稀释液将样品稀释至所需浓度范围。</li>
	<li>将适当稀释后的样品加入已冲洗的激光模块中，运行快速测量以确认样品处于可接受范围内。</li>
</ol>
10. 样品NTA
注意：标准测量选项卡位于底部中间框内的SOP选项卡中，用于常规样品分析（见步骤 10.1 至 10.12）。
<ol>
	<li>将时长设置为 30 或 60 s，视频数量设置为 5。</li>
	<li>接受现有的基础文件名，或通过点击 ... 选项卡选择新的存储位置以生成新文件名。</li>
	<li>勾选 目标温度 复选框，并输入所需温度。</li>
	<li>点击 创建脚本 以重复使用此 标准测量 程序。</li>
	<li>按照第7节所述加载样品并准备好实验后，点击 创建并运行脚本。</li>
	<li>在 设置报告详情 弹出窗口中填写操作员信息、样品描述、样品稀释倍数及所用稀释液。 
	注意：此信息将被记录并打印在最终的实验报告上。</li>
	<li>当所有所需字段填写完毕后，点击 确定 以启动脚本。 
	注意：如果已选择 目标温度，加热器将在脚本开始测量前，先将激光模块中的样品稳定至目标温度并维持 5 秒。屏幕左下角的诊断面板将显示“HEATER ON”以及样品的温度。</li>
	<li>每次视频采集前，请注意提示手动 推进 推杆。向激光室注入约 0.05 mL 样品，使颗粒静止（即不再流动），然后点击 确定。</li>
	<li>在完成第 5个 视频采集后，等待出现 设置确认 对话框，并观察 处理框 是否闪烁。通过手动逐帧浏览视频底部画面，观察屏幕上标记颗粒的蓝色十字数量，设置样品的 检测阈值。若在逐帧前进时每个画面中标记颗粒的蓝色十字超过 3–4 个，则应提高 检测阈值。 
	注意：单个颗粒上的蓝色十字类似于流式细胞术中的“成群（swarm）”效应，应尽量减少以确保数据采集的最佳准确性和可重复性。</li>
	<li>当检测阈值设置合适后，点击 设置确定。</li>
	<li>等待系统自动处理视频，并显示结果直方图及完成提示对话框后，再点击 确定。</li>
	<li>当 导出设置 窗口出现时，点击 导出 保存结果。 
	注意：所有视频及分析结果将存储在第 10.2 步中定义的目标文件中，需占用大量存储空间。请根据需要监控并转移至辅助存储设备。</li>
</ol>
11. 在不同检测阈值下对当前样本进行重新分析
注意：在完成纳米颗粒追踪分析（步骤 10）后，可使用不同的检测阈值设置对数据进行重新分析。但是，相机水平在采集完成后无法更改。
<ol>
	<li>在当前实验中列出的5个捕获视频全部选中。</li>
	<li>点击处理选定文件，等待设置确认对话框出现，同时处理框闪烁，以调整检测阈值。</li>
	<li>将检测阈值调节至所需水平，然后点击设置确定。</li>
	<li>等待视频自动处理完成，结果直方图及完成提示对话框显示后，再点击确定。</li>
	<li>点击导出设置。当对最近的样本进行额外评估时，务必在当前实验中点击导出结果框，因为在样本重新分析后，导出结果弹窗将不再显示。 
	注意：由于系统不会提醒执行此操作，容易被忽略，导致分析结果丢失。但原始数据仍将保留，可后续重新分析。</li>
</ol>
12. 归档文件的分析
注意：如果先前分析的实验未保存，或需要对这些样品进行额外分析，可将各个文件重新载入NTA软件，以进行额外的检测阈值评估。相机水平在采集完成后无法更改。
<ol>
	<li>从桌面启动NTA软件。</li>
	<li>在下方中间面板中点击分析 选项卡。</li>
	<li>点击打开实验 ，并导航至所需的.nano文件。 
	注意：所选.nano实验关联的视频文件必须与主实验文件位于同一文件夹中；否则，在处理文件时将出现错误。文件名的前6位数字为实验运行的日期（xx-xx-xx），后6位数字为视频录制的时间（xx-xx-xx）以及单个视频的标识符。每个合并实验的PDF文件中列出了该分析所包含的.nano文件。</li>
	<li>点击处理所选文件 以运行分析。</li>
	<li>当处理 窗口闪烁并允许更改检测阈值时，将阈值设置为所需水平，然后点击确定。</li>
	<li>等待视频自动处理完成，并显示结果直方图及完成提示对话框后，再点击确定。</li>
	<li>点击导出结果。请务必在当前实验中点击导出结果 框，因为重新分析后将不再显示导出结果弹出窗口。 
	注意：由于系统不会提醒执行此操作，因此很容易被忽略，导致分析结果丢失。</li>
</ol>
13. 激光模块的清洁与拆卸
<ol>
	<li>关闭激光控制箱。</li>
	<li>将激光模块中的全部样品冲洗出来，并妥善丢弃。</li>
	<li>将激光模块倾斜放置，使开口的注射器端口朝上，缓慢向激光模块内注入DPBS，同时从出口注射器端口排出液体，以排出腔室内的空气。</li>
	<li>将激光模块中残留的DPBS冲洗干净并丢弃。</li>
	<li>重复冲洗2次，最后一次冲洗后尽可能彻底排空激光模块。</li>
	<li>均匀下压流动池盖板，以对角交替方式均匀松开手拧螺钉直至脱离螺纹，取下螺钉并存放于激光模块箱内。</li>
	<li>从激光模块上取下流动池盖板。</li>
	<li>使用高质量的镜头清洁剂和镜头纸轻轻清洁两片玻璃表面。切勿使用纸巾或纸巾布清洁玻璃表面。</li>
	<li>使用后目视检查激光模块和流动池盖板的“窗口”是否存在划痕或缺陷，并向主管报告。</li>
	<li>将激光模块和流动池盖板放回其存放箱中，以防止储存期间玻璃表面受损。</li>
</ol>
14. 样品分析方案
<ol>
	<li>未过滤样品
	<ol>
		<li>上样前涡旋混匀样品，并按照上述方法在Camera Level 12和Detection Threshold Level 3条件下记录5段60秒视频。使用Detection Thresholds 2和5对这些视频重新分析。</li>
		<li>对同一样品在Camera Levels 13和14以及Detection Threshold Level 3条件下重复采集视频。使用Detection Thresholds 2和5对额外采集的2段视频进行重新分析。在SOP设置下，重复整个过程，采集5段30秒视频。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过滤样品
	<ol>
		<li>涡旋混匀样品后，立即通过0.22 µm注射器滤膜直接将样品加载并过滤至激光模块中。 
		注意：使用前，用相当于滤膜死体积2倍的样品冲洗滤膜，以去除残留微粒。所用注射器滤膜（见材料表）的实测死体积为0.5 mL，测量前用1.0 mL样品冲洗。在SOP数据字段中记录滤膜类型。过滤后的样品按照步骤14.1中所述未过滤样品的处理方法进行完全相同的操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
15. NTA 结果的统计分析
<ol>
	<li>在分析主效应或交互作用时，应先检验方差分析（ANOVA）的假设条件（正态性、单峰性、方差齐性），然后进行方差分析。若不满足ANOVA的假设条件，则采用Kruskal-Wallis秩和检验进行单因素方差分析。</li>
	<li>当主效应显著时，采用Dunn法对预先设定的比较进行均值检验。双尾检验中以p值小于0.05为具有统计学意义。 
	注：此处生成的数据文件可在签署材料转移协议后向作者索取。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均无利益冲突。

目前有多种方法可用于估算纳米颗粒的尺寸和浓度11。这些方法包括基于群体分析以获得尺寸估算值的集合方法，如动态光散射（DLS）、离心沉降法，以及在单颗粒水平上进行分析的方法，如电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、原子力显微镜和可调电阻脉冲传感技术。其中，DLS和NTA是基于理想介质中布朗运动的常用非破坏性尺寸与浓度测量方法。DLS依赖于光的散射，其散射光强度与颗粒体积的平方成正比。因此，相较于NTA，DLS对大颗粒、聚集体或粒径分布不均的颗粒群体更为敏感。
NTA 通过测量单个粒子在连续视频帧中的运动路径长度来计算其扩散系数。NTA 的主要局限性在于其可检测的粒子浓度范围较窄，相较于动态光散射（DLS）及其他测量方法，必须确保单个粒子的路径长度处于显微镜的衍射极限以及追踪软件的能力范围之内。由于 DLS 和 NTA 均依赖于布朗运动，因此在单分散体系中两者通常表现出良好的粒径一致性；但在多分散体系或含有聚集体的样品中，结果则会出现偏差。后者会使 DLS 失效，并显著增大 NTA 的粒径估算值12<...

对细胞外囊泡（EVs）及其他纳米级颗粒进行准确且可重复的分析，在科研与工业领域均面临诸多挑战。由于数据采集相关参数的报告缺乏统一标准，EV研究的重复性一直较为困难。为解决这些问题，国际细胞外囊泡学会（ISEV）提出了一套行业指南，作为EV研究人员应遵循的最低限度的生化、生物物理和功能标准，并以立场声明的形式发布，通常称为MISEV20141。随着EV研究进展的加快，亟需更新指南内容，因此“MISEV2018：国际细胞外囊泡学会的立场声明”对MISEV2014指南进行了扩展2。MISEV2018论文包含了表格、建议的实验方案提纲，以及用于记录特定EV相关表征的具体步骤。为进一步促进实验结果的解读与重复，EV-TRACK被开发为一个众包知识库（http://evtrack.org），以提高EV生物学研究及其发表成果所用方法的透明度3。尽管已有这些标准化报告建议，该领域在重复和验证已发表结果方面仍持续面临困难。
本文响应美国国立卫生研究院（NIH）和国家科学基金会（NSF）对质量评估工具的倡导，提出国际细胞外囊泡学会（ISEV）应要求对方法和细节进行标准化报告，以便应用数据评估工具，实现不同实验室间结果的可重复性。报告细胞来源、细胞培养流程以及细胞外囊泡（EV）分离方法，是定义EV群体特性的关键因素。在纳米颗粒追踪分析（NTA）仪器中，检测参数设置、载液折射率、导致多分散性的异质性颗粒群体、缺乏标准化报告要求，以及缺少实验室内部和实验室之间的观测者测量结果一致性，使得不同实验室间的NTA结果难以或无法进行比较。
自2006年起投入使用，纳米颗粒追踪分析（NTA）是一种广泛用于纳米颗粒尺寸和浓度测定的方法，目前约80%的细胞外囊泡（EV）研究人员正在使用该方法4。MISEV2018指南要求采用两种单囊泡分析方法，其中NTA是常用选项之一。由于其设备普及度高、单个样品检测成本低以及理论基础简单（基于斯托克斯-爱因斯坦方程），NTA在EV表征中仍被广泛使用。通过NTA对EV进行评估时，利用激光光散射和布朗运动分析生成颗粒尺寸分布及浓度估算结果，其检测下限由EV的折射率决定。当使用已知黏度和温度的液体样品时，通过追踪EV的运动轨迹，测定其在二维空间中的均方位移，从而计算出颗粒的扩散系数，并利用修正的斯托克斯-爱因斯坦方程将其转换为等效球形流体动力学直径5,6,7。与其他表征方法相比，NTA的逐颗粒分析在异质性EV群体中受聚集体或较大颗粒的干扰更小7。尽管少数较大颗粒对尺寸测定准确性影响较小，但即使存在极微量的强光散射大颗粒，也会因软件对EV的检测与追踪能力下降，显著降低对小颗粒的检出率8。作为一种测量技术，NTA通常被认为不会偏向于检测较大颗粒或颗粒聚集体，并且能够通过单颗粒分析分辨出不同尺寸的颗粒亚群9。由于该方法依赖颗粒的光散射特性，其局限性之一是：任何在折射率和尺寸特性上与EV相似的微粒（如灰尘、塑料碎屑或粉末）均无法通过此方法与真实的EV区分开来。
NanoSight LM10（纳米颗粒尺寸分析仪）和LM14（激光模块）自2006年起开始销售，尽管该仪器已推出更新的型号，但此特定型号仍广泛存在于许多核心设施中，并被视为可靠的主力设备。为了对粒径和浓度进行高分辨率测量，需要经过培训以正确优化NTA的设置。实现最佳视频录制的两个关键设置是：（1）相机水平和（2）检测阈值。这些参数必须由操作人员根据样品的特性进行设定。NTA分析的一个主要限制是建议样品浓度范围为每毫升107至109个颗粒，为此可能需要对样品进行稀释10。用于稀释的溶液（如磷酸盐缓冲液、0.15 M生理盐水或超纯水）很少能完全不含粒径小于220 µm的颗粒，这些杂质可能会影响NTA的测量结果。应对所用稀释液在与分析纳米颗粒样品相同的相机水平和检测阈值下进行NTA表征。在涉及细胞外囊泡（EV）NTA分析的研究论文中，很少报告用于EV样品稀释的稀释剂中存在的纳米颗粒的尺寸和浓度。
本方案采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）对合成的类似细胞外囊泡（EV）的脂质体进行分析，通过选择特定的相机灵敏度水平、检测阈值以及对样品进行机械过滤，系统研究相机水平、检测阈值或样品过滤对NTA数据集的影响。脂质体的合成方法见补充文件 S1。本实验选用合成脂质体，因其粒径均一、物理特性明确，且在4 °C储存条件下稳定性良好。尽管实际的EV样品也可用于实验，但EV在储存过程中存在的异质性和不稳定性可能会增加本研究及其结果解读的复杂性。（A）脂质体与（B）EV的NTA分析结果相似，表明本文在脂质体中揭示的系统性影响很可能同样适用于EV的表征（图1）。综上，这些发现支持以下观点：关键软件参数的完整报告，以及对样品处理过程（如稀释液、稀释倍数和过滤方式）的详细描述，对NTA数据的可重复性具有重要影响。
本文的目的是证明，改变NTA设置（温度、相机水平和检测阈值）以及样品制备方法会影响所获得的结果：在粒径和浓度上均观察到系统性且显著的差异。由于NTA是满足MISEV2018表征标准的常用方法之一，这些结果凸显了报告样品制备过程和NTA设置参数的重要性，以确保实验的可重复性。
<img alt="纳米颗粒示踪分析报告；脂质体/细胞外囊泡样本的粒径分布与浓度图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：用于比较脂质体与细胞外囊泡的代表性纳米颗粒示踪分析（NTA）报告。（A）脂质体：2020年3月12日通过NTA表征的未过滤样品。（B）细胞外囊泡（EVs）：2021年8月26日通过NTA表征的未过滤样品。缩写：NTA = 纳米颗粒示踪分析；EVs = 细胞外囊泡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>自动移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管，锥形，Nunc 15 mL</td><td>Thermo Sci.</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>吸水纸（Kimwipes）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镜头清洁剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镜头纸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM-10</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM-14 激光模块</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 软件版本 3.2</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，1–200 &amp;micro;L，带滤芯，无菌，低吸附</td><td>BioExpress</td><td>P -3243-200X</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，50–1,000 &amp;micro;L，带滤芯，无菌</td><td>BioExpress</td><td>P-3243-1250</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲盐水（不含钙或镁）</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>标准品，乳胶微球转移标准品，100 nm（3 mL）</td><td>Malvern</td><td>NTA4088</td><td></td></tr><tr><td>标准品，乳胶微球转移标准品，50 nm&amp;nbsp;（3 mL）</td><td>Malvern</td><td>NTA4087</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器，33 mm，0.22 &amp;micro;m，MCE 材质，无菌</td><td>Fisher brand</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>结核菌素注射器，1 mL，滑动式针头接口</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>废液收集容器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

提高可重复性以符合《2018年细胞外囊泡研究最低信息标准》中的纳米颗粒追踪分析指南

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

自2006年以来，纳米颗粒追踪分析（NTA）已成为细胞外囊泡（EV）研究中多种表征方法之一。许多人认为，NTA仪器及其配套软件在经过最少培训后即可轻松使用，且尺寸校准可在实验室内自行完成。由于NTA的数据采集和软件分析均属于EV表征的一部分，因此在《细胞外囊泡研究最小信息标准2018》（MISEV2018）中对此进行了阐述。此外，透明报告与细胞外囊泡研究知识集中平台（EV-TRACK）也对这些方法进行了监控，以提高EV实验的稳健性（例如，尽量减少由未受控因素引起的实验变异）。
尽管已有努力推动研究方法和对照的报告，但许多已发表的研究论文仍未能报告重现原始纳米颗粒追踪分析（NTA）观测结果所需的关键参数。很少有论文报告阴性对照或稀释液的NTA表征，显然假设市售产品（如磷酸盐缓冲液或超纯蒸馏水）不含颗粒物。同样，研究人员很少报告使用阳性对照或尺寸标准品来验证颗粒尺寸测定的准确性。斯托克斯-爱因斯坦方程通过引入样品黏度和温度变量来确定颗粒的布朗运动位移，因此，在整个样品视频采集过程中报告稳定的激光腔温度，是实现准确重复实验的关键对照措施。样品或稀释液的过滤操作也未被常规报告，即使提及，也很少包括滤膜的具体信息（如生产厂家、膜材料、孔径大小）以及储存条件。国际细胞外囊泡学会（ISEV）所规定的可接受实验细节最低标准中，应包含一份详细记录的NTA操作流程，用于细胞外囊泡（EVs）的表征。以下实验表明，研究人员需自行建立NTA分析方案，并将其纳入发表文献的方法部分，作为满足MISEV2018单囊泡表征要求的可选手段之一。

表1 包含了脂质体样品（18个过滤样品和18个未过滤样品）以及代表性DPBS稀释液的NTA视频分析结果。本文中，对两组样品的比较均不考虑相机灵敏度水平或检测阈值的影响。过滤样品的平均粒径为108.5 nm，粒径众数为86.2 nm，浓度为7.4 × 108 个颗粒/mL。相比之下，未过滤样品的平均粒径为159.1 nm，粒径众数为105.7 nm，浓度为7.6 × 108 个颗粒/mL。无论相机灵敏度水平或检测阈值如何，过滤与未过滤样品在平均粒径和粒径众数上的差异均具有统计学意义（p &lt; 0.05）。而两组样品在颗粒浓度上的差异，无论相机灵敏度水平或检测阈值如何，均无统计学意义（p = 0.86）。
<table fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="13">过滤样品与未过滤样品的比较</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>...

纳米颗粒追踪分析（NTA）是一种广泛用于表征细胞外囊泡的方法。本文重点介绍了NTA实验参数与对照，以及分析和表征样品及稀释液的统一方法，这些内容是对MISEV2018和EV-TRACK指南的必要补充，以实现实验室间的可重复性。

纳米颗粒追踪分析（NTA）自2006年以来已成为用于细胞外囊泡（EV）研究的多种表征方法之一。许多……

本方案专为 NanoSight LM10 的初学者操作者设计。通过遵循逐步操作说明，可获得准确且可重复的结果。该技术有助于确保不同用户在多次试验中获得一致的结果，而不论其操作技能水平如何。纳米颗粒表征，尤其是定量分析，在细胞外囊泡研究领域仍然是一个挑战。本方案可实现对悬浮液中纳米颗粒的粒径和浓度进行一致性的分析。首先，使用高质量的镜头清洁剂和镜头纸清洁激光模块的玻璃表面。在组装模块之前，请确保 O 型圈密封件已正确安装在流通池盖的凹槽内。然后将流通池盖放置在激光模块上，确保电触点方向正确。接着，将四个弹簧加载的旋钮螺钉穿过流通池板，并与激光模块的螺纹啮合，但暂不逐一拧紧。在对流动池盖施加均匀向下的压力的同时，以对角交替的方式均匀拧紧拇指螺钉，直至拧紧到位。使用带有滑动锁接头的1毫升结核菌素注射器，用1毫升DPBS冲洗两次，每次重复三次。在将第一个结核菌素注射器插入剩余端口之前，先取出并丢弃其活塞，使其作为废液稀释剂或样品储液池使用。然后用一毫升 DPBS 填充第二个注射器，并将其连接到流动池盖的入口端口。倾斜持握激光模块，使出口注射器端口朝上，以便在将 DPBS 缓慢注入激光模块时排出腔室中的空气。通过向入口端口注入一毫升空气，将激光模块中残留的 DPBS 冲洗出来。重复冲洗两次。最后一次冲洗后，尽可能完全排空激光模块，并装载模块以进行聚焦和定位。打开软件。在左上角框内的“捕获”选项卡中，点击“启动相机”。如果相机在五分钟后自动关闭，请点击“启动相机”以重新启动。在同一选项卡中，将相机亮度调节至14到16，以增强激光线的亮度，并简化颗粒识别与聚焦。通过向内或向外移动头件左侧上方的滑块，将图像从相机切换至目镜。在视野中找到密度增加的区域（称为指纹区），将其居中，并在垂直方向上对指纹区进行聚焦。在视野中使激光线居中，然后移动上方滑块，将光线导向相机，此时可在计算机屏幕上观察到相应变化。计算机屏幕上的图像是显微镜目镜中视野的镜像。使用调焦旋钮调节焦距，使屏幕上单个运动颗粒的图像更加清晰。加载样品时，用已冲洗的一毫升结核菌素注射器吸取一毫升样品，并将注射器连接到流动池盖的进样口。继续推进活塞，直到连接在出口端口上的开放注射器中可见液体。应倾斜模块，以便从激光模块中排出空气。在相机视图中，将焦点移至激光线右侧粒子数量均匀的区域。调整垂直方向，使水平光带居中，并重新对焦，直至视野中显示的粒子数量最多。确保在后续所有测量中保持对焦位置一致。调节相机亮度至相机视野右上角的暗信息符号间歇性闪烁。对于纳米颗粒跟踪分析（NTA），将采集时长设置为30或60秒，视频数量设置为5个。若要更改现有的基础文件名，请点击选项卡以指定新生成数据的存储位置，并设置新的文件名。然后勾选目标温度框，输入所需的温度，再点击“创建脚本”以重复使用标准测量程序。样本加载完毕且实验准备就绪后，点击“创建并运行脚本”。在弹出的“设置报告详情”窗口中，填写操作人员、样本和稀释液的相关必要信息。所有所需字段填写完成后，点击“设置”以确认并启动脚本。每次视频采集前，请留意提示，手动推进活塞。向激光腔内注入约 0.05 毫升样品。当颗粒静止后，点击“确定”。完成第五次视频采集后，将同时弹出设置确认框和进程框。当从视频屏幕底部手动逐帧推进时，注意屏幕上显示的蓝色十字标记的颗粒数量，并为样品的处理设置检测阈值。等待视频自动处理生成结果直方图，直至弹出完成提示对话框，然后点击“确定”。导出设置窗口出现后，点击“导出”以保存结果。高亮选中当前实验中列出的全部五个采集视频。接下来，单击“处理所选文件”，并等待处理框中出现设置确认窗口，提示闪烁以更改检测阈值。然后将检测阈值调整至所需水平，进入设置并单击“确定”。视频将自动处理，结果显示为直方图，并弹出对话框提示处理完成。单击“确定”。在代表性分析中，展示了脂质体样品及代表性 DPBS 稀释液的纳米颗粒追踪分析（NTA）结果。过滤后的样品平均粒径为 108 纳米，浓度为 7.4 × 10⁸ 个颗粒/毫升。相比之下，未过滤样品的平均粒径为159纳米，浓度为每毫升7.6 × 10⁸个颗粒。在合并相机水平下，随着检测阈值从2提高到5，过滤样品的平均粒径和众数粒径均显著减小。在合并相机水平下，随着检测阈值的提高，颗粒浓度有所降低。在过滤样品与未过滤样品之间，颗粒浓度未检测到显著差异。在联合检测阈值下，随着相机水平从12升高至14，过滤样品的平均粒径和众数粒径均有所减小。在联合检测阈值下，随着相机水平从12升高至14，颗粒浓度随之增加。过滤样品与未过滤样品之间未观察到显著差异。步骤4.1至5.2对于找到正确的观察区域至关重要。在多次试验运行中获得一致结果依赖于这一可重复的技术。动态光散射通常作为纳米颗粒跟踪分析的辅助手段，主要用于获取颗粒的表面电荷，即泽塔电位。在纳米颗粒分析中，NTA 仍然是细胞外囊泡研究中颗粒定量的一种非常有价值的方法。

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提高可重复性以满足细胞外囊泡研究的最少信息 2018纳米颗粒跟踪分析指南

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利用纳米等离子体增强散射与低倍显微镜成像定量肿瘤来源的外泌体

本方案旨在通过纳米颗粒跟踪分析法（NTA）测量球形纳米颗粒（更具体而言是金纳米颗粒）在水相介质中的流体动力学直径。该方法通过追踪颗粒由布朗运动引起的位移，并结合斯托克斯-爱因斯坦方程计算出其流体动力学直径。...

通过实验室间比对对水相介质中金纳米颗粒进行纳米颗粒追踪分析

我们演示如何使用一种新型纳米颗粒跟踪分析仪器，来估算从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离出的细胞外囊泡的粒径分布及总颗粒浓度。...

纳米颗粒追踪分析用于细胞外囊泡的定量与粒径测定

本实验方案描述了一种从外周血和实体组织中提取细胞外囊泡，并对其表面抗原和蛋白载荷进行分析的方法。...

从血浆和实体组织中分离与分析可示踪且功能化的细胞外囊泡

最新一代的细胞外囊泡（EV）表征工具能够同时对单个EV的多个参数进行分析。纳米流式细胞术可对大于45...

单个细胞外囊泡跨膜蛋白的纳米流式检测表征

本文提出了一种新一代的多参数分析平台，可提高细胞外囊泡亚群表征的通量。该方法结合了多重生物传感技术与原子力显微镜的计量学和形貌力学分析，并耦合拉曼光谱，用于对捕获在微阵列生物芯片上的囊泡靶标进行定性分析。...

基于多重表面等离子体共振成像芯片的多模态分析平台用于细胞外囊泡亚群分析

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