提高可重复性以符合《2018年细胞外囊泡研究最低信息标准》中的纳米颗粒追踪分析指南
2021年11月17日
纳米颗粒追踪分析（NTA）是一种广泛用于表征细胞外囊泡的方法。本文重点介绍了NTA实验参数与对照，以及分析和表征样品及稀释液的统一方法，这些内容是对MISEV2018和EV-TRACK指南的必要补充，以实现实验室间的可重复性。
本方案专为 NanoSight LM10 的初学者操作者设计。通过遵循逐步操作说明，可获得准确且可重复的结果。该技术有助于确保不同用户在多次试验中获得一致的结果，而不论其操作技能水平如何。
纳米颗粒表征，尤其是定量分析，在细胞外囊泡研究领域仍然是一个挑战。本方案可实现对悬浮液中纳米颗粒的粒径和浓度进行一致性的分析。首先，使用高质量的镜头清洁剂和镜头纸清洁激光模块的玻璃表面。
在组装模块之前，请确保 O 型圈密封件已正确安装在流通池盖的凹槽内。然后将流通池盖放置在激光模块上，确保电触点方向正确。接着，将四个弹簧加载的旋钮螺钉穿过流通池板，并与激光模块的螺纹啮合，但暂不逐一拧紧。
在对流动池盖施加均匀向下的压力的同时，以对角交替的方式均匀拧紧拇指螺钉，直至拧紧到位。使用带有滑动锁接头的1毫升结核菌素注射器，用1毫升DPBS冲洗两次，每次重复三次。在将第一个结核菌素注射器插入剩余端口之前，先取出并丢弃其活塞，使其作为废液稀释剂或样品储液池使用。
然后用一毫升 DPBS 填充第二个注射器，并将其连接到流动池盖的入口端口。倾斜持握激光模块，使出口注射器端口朝上，以便在将 DPBS 缓慢注入激光模块时排出腔室中的空气。通过向入口端口注入一毫升空气，将激光模块中残留的 DPBS 冲洗出来。
重复冲洗两次。最后一次冲洗后，尽可能完全排空激光模块，并装载模块以进行聚焦和定位。打开软件。
在左上角框内的“捕获”选项卡中，点击“启动相机”。如果相机在五分钟后自动关闭，请点击“启动相机”以重新启动。在同一选项卡中，将相机亮度调节至14到16，以增强激光线的亮度，并简化颗粒识别与聚焦。
通过向内或向外移动头件左侧上方的滑块，将图像从相机切换至目镜。在视野中找到密度增加的区域（称为指纹区），将其居中，并在垂直方向上对指纹区进行聚焦。在视野中使激光线居中，然后移动上方滑块，将光线导向相机，此时可在计算机屏幕上观察到相应变化。
计算机屏幕上的图像是显微镜目镜中视野的镜像。使用调焦旋钮调节焦距，使屏幕上单个运动颗粒的图像更加清晰。加载样品时，用已冲洗的一毫升结核菌素注射器吸取一毫升样品，并将注射器连接到流动池盖的进样口。
继续推进活塞，直到连接在出口端口上的开放注射器中可见液体。应倾斜模块，以便从激光模块中排出空气。在相机视图中，将焦点移至激光线右侧粒子数量均匀的区域。
调整垂直方向，使水平光带居中，并重新对焦，直至视野中显示的粒子数量最多。确保在后续所有测量中保持对焦位置一致。调节相机亮度至相机视野右上角的暗信息符号间歇性闪烁。
对于纳米颗粒跟踪分析（NTA），将采集时长设置为30或60秒，视频数量设置为5个。若要更改现有的基础文件名，请点击选项卡以指定新生成数据的存储位置，并设置新的文件名。然后勾选目标温度框，输入所需的温度，再点击“创建脚本”以重复使用标准测量程序。
样本加载完毕且实验准备就绪后，点击“创建并运行脚本”。在弹出的“设置报告详情”窗口中，填写操作人员、样本和稀释液的相关必要信息。所有所需字段填写完成后，点击“设置”以确认并启动脚本。
每次视频采集前，请留意提示，手动推进活塞。向激光腔内注入约 0.05 毫升样品。当颗粒静止后，点击“确定”。完成第五次视频采集后，将同时弹出设置确认框和进程框。
当从视频屏幕底部手动逐帧推进时，注意屏幕上显示的蓝色十字标记的颗粒数量，并为样品的处理设置检测阈值。等待视频自动处理生成结果直方图，直至弹出完成提示对话框，然后点击“确定”。导出设置窗口出现后，点击“导出”以保存结果。高亮选中当前实验中列出的全部五个采集视频。
接下来，单击“处理所选文件”，并等待处理框中出现设置确认窗口，提示闪烁以更改检测阈值。然后将检测阈值调整至所需水平，进入设置并单击“确定”。视频将自动处理，结果显示为直方图，并弹出对话框提示处理完成。单击“确定”。在代表性分析中，展示了脂质体样品及代表性 DPBS 稀释液的纳米颗粒追踪分析（NTA）结果。过滤后的样品平均粒径为 108 纳米，浓度为 7.4 × 10⁸ 个颗粒/毫升。
相比之下，未过滤样品的平均粒径为159纳米，浓度为每毫升7.6 × 10⁸个颗粒。在合并相机水平下，随着检测阈值从2提高到5，过滤样品的平均粒径和众数粒径均显著减小。在合并相机水平下，随着检测阈值的提高，颗粒浓度有所降低。
在过滤样品与未过滤样品之间，颗粒浓度未检测到显著差异。在联合检测阈值下，随着相机水平从12升高至14，过滤样品的平均粒径和众数粒径均有所减小。在联合检测阈值下，随着相机水平从12升高至14，颗粒浓度随之增加。
过滤样品与未过滤样品之间未观察到显著差异。步骤4.1至5.2对于找到正确的观察区域至关重要。在多次试验运行中获得一致结果依赖于这一可重复的技术。
动态光散射通常作为纳米颗粒跟踪分析的辅助手段，主要用于获取颗粒的表面电荷，即泽塔电位。在纳米颗粒分析中，NTA 仍然是细胞外囊泡研究中颗粒定量的一种非常有价值的方法。
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概述
本文介绍了一种用于表征细胞外囊泡的纳米颗粒追踪分析（NTA）方案。该方案提供了逐步操作说明，以确保无论操作者技能水平如何，均可获得准确且可重复的实验结果。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 细胞外囊泡研究
背景
- NTA 是一种广泛用于表征细胞外囊泡的方法。
- 纳米颗粒的定量在该领域仍然是一个挑战。
- 获得一致的结果对于不同实验室之间的可重复性至关重要。
- 本方案解决了对统一分析方法的需求。
研究目的
- 为NanoSight LM10的新手操作者提供可靠的实验方案。
- 提高细胞外囊泡研究的可重复性。
- 补充现有的纳米颗粒表征指南。
使用的方法
- 使用NanoSight LM10的逐步操作说明。
- 激光模块的清洁程序。
- 样品制备与分析的指导原则。
- 获得准确结果的对照设置与实验参数。
主要结果
- 纳米颗粒的粒径和浓度分析具有良好的一致性。
- 对外泌体等细胞外囊泡的定量准确性显著提高。
- 多次重复实验均获得可重复的结果。
- 对纳米颗粒追踪分析（NTA）方法学的理解进一步加深。
结论
- 该方案可实现可靠的纳米颗粒表征。
- 它解决了细胞外囊泡研究领域中的挑战。
- 遵循该方案可确保获得一致的结果，且不受操作者技能水平的影响。
常见问题
行业应用价值
可重复的纳米颗粒追踪分析（NTA）对于细胞外囊泡（EV）的可靠表征至关重要，直接影响生物制药研发中的靶点验证和检测方法开发。遵循MISEV2018指南和透明报告标准，可减少实验中的不确定性，并在关键发现阶段支持可靠决策。标准化的NTA方案能够实现不同研究间的可靠比较，增强整个项目组合的数据完整性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 通过实现细胞外囊泡（EV）的稳定定量与粒径分析，支持严格的假设检验。
- 降低生物学变异，提高功能靶点验证的可信度。
- 通过控制样本和仪器变量，促进作用机制研究中的风险排除。
筛选与检测方法开发
- 为后续筛选工作流程制备经过验证的EV样本。
- 通过详细报告对照和仪器设置，实现检测方法的标准化。
- 提供定量输出结果，用于可靠的化合物评估和平台重复使用。
转化与临床前研究
- 在报告全面的情况下，使细胞外囊泡（EV）表征符合转化生物标志物的要求。
- 通过记录关键实验参数，确保从发现到临床前验证的连续性。
- 通过最大限度减少不受控的技术变异，支持基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
当NTA结合完整的报告和对照实验实施时，可通过提供可重复且定量的EV数据，弥合早期发现与临床前研究工作流程之间的差距。
- 发现生物学：通过标准化的EV检测实现可靠的假设检验和通路解析。
- 筛选：提供可重复的、定量的颗粒大小和浓度数据，确保检测的可用性。
- 分析：生成统计学结果，便于不同条件间及不同研究间的比较。
- 转化研究：当报告符合MISEV2018标准时，支持生物标志物的对接以及临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的实验方案框架，实现跨项目EV表征的一致性。
运营与企业影响
- 科学价值：提高EV研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：促进NTA工作流程的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过可靠的数据支持更优的决策，减少后期生物学风险。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的EV相关资产优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要操作人员接受纳米颗粒跟踪分析（NTA）仪器使用的培训，并严格遵守操作规程。
- 需要使用经过校准的NTA系统以及经过验证的分析软件。
- 要求严格记录对照、仪器设置和环境变量。
- 必须根据指南要求，针对不同类型的样品和稀释液调整操作方案。
- 由于需要全面报告以确保不同实验场所间的可重复性，因此存在局限性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Cleaning and Assembly of the Laser Module
1:29
Flushing Procedure for the Laser Module Prior to and Between Samples
2:28
Focusing and Positioning of the Laser Module
3:34
Loading Standards/Samples/Diluent into the Laser Module for Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)
4:28
Sample Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)
6:06
Re-Analysis of the Current Sample at Different Detection Threshold
6:40
Results: Effects of Camera Level and Detection Threshold on Measured Particle Size and Concentration of Filtered and Unfiltered Samples
8:02
Conclusion
