Name: 使用生物发光监测小鼠乳腺癌生长和转移集落形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 学习使用生物发光和荧光技术在小鼠体内实时监测乳腺癌肿瘤生长动力学和转移集落形成。该方法适用于MCF-7、MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞系，可用于临床前抗肿瘤药物研究。

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我们感谢Y.D.S.实验室的成员。我们感谢耶路撒冷哈达萨医学中心Wohl转化医学研究所提供小动物成像设施。本研究得到了以下资助： 研究职业发展奖 来自以色列癌症研究基金。

所有小鼠实验均在希伯来大学机构动物护理和使用委员会批准的方案 MD-21-16429-5 下进行。此外，希伯来大学已获得实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）的认证。
1. 细胞系的维持
注意：本方案中使用了人乳腺癌细胞系（MCF-7、MDA-MB-468 和 MDA-MB-231）。
<ol>
	<li>在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、加湿、5% CO2培养箱中培养所有乳腺癌细胞系。 
	&#8203;注意：定期检查细胞密度；当细胞融合度达到70%时，进行传代并扩增以供后续使用。</li>
</ol>
2. 病毒制备
<ol>
	<li>用 1 mL 胰蛋白酶处理 HEK293T 细胞，直至细胞脱落。</li>
	<li>加入 10 mL DMEM（含 10% FBS）以中和胰蛋白酶活性，并将细胞悬液转移至新的 15 mL 离心管中。</li>
	<li>在 150 × g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。离心后弃去上清液，加入 1 mL 新鲜 DMEM 培养基。</li>
	<li>测定细胞浓度，并以每孔 1.2 × 106 个细胞的密度接种至六孔板中。</li>
	<li>次日，提前预热所有所需试剂，包括转染试剂、无血清 DMEM、包膜质粒（VSV-G）、慢病毒包装质粒（ΔVPR）以及 pLX304 Luciferase-V5 blast 质粒或 FUW GFP 质粒。</li>
	<li>在 1.5 mL 经高压灭菌的离心管中，将 50 µL 无血清 DMEM 与 0.3 µg VSV-G 质粒、1 µg ΔVPR 质粒以及 1.2 µg pLX304 Luciferase-V5 blast 质粒或 FUW GFP 质粒混合。</li>
	<li>将上述质粒与培养基充分混匀后，加入 5 µL 转染试剂，轻轻混匀，并在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，将混合液逐滴加入 HEK293T 细胞中。</li>
	<li>24 小时后，更换为 2 mL 含 30% FBS 的 DMEM 培养基。次日（转染后 48 小时），收集含有病毒的培养上清（&#34;pLX304 Luciferase-V5 或 FUW GFP 病毒&#34;）。 
	注意：使用 30% FBS 可提高病毒产量。</li>
	<li>为避免残留 HEK293T 细胞，将含病毒的培养基通过 0.45 µm 注射器滤器过滤，或在 150 × g 条件下离心 5 分钟后收集上清液。 
	注意：如需长期保存，应将病毒工作分装液置于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
3. 建立稳定表达GFP和荧光素酶（&#34;GFP  +&#160;Luc+细胞&#34;）的细胞系
<ol>
	<li>在感染细胞前一天，将 8 × 105 个细胞接种至六孔板的每个孔中。</li>
	<li>过夜培养后，弃去原培养基，更换为含有 8 µg/mL 多聚素（polybrene）的新鲜培养基，并将 200 µL FUW GFP 病毒液逐滴加入细胞中。</li>
	<li>可选步骤：为提高病毒感染效率，可将六孔板在 37 °C 条件下以 560 × g 离心 30 分钟（即旋转感染，spin infection）。</li>
	<li>继续培养细胞 48 小时，通过荧光显微镜检测 GFP 表达情况。</li>
	<li>利用荧光激活细胞分选技术（FACS）对表达 GFP 的细胞进行分选（GFP+）（图 1A）。</li>
	<li>按照步骤 3.2 的方法，用 pLX304 Luciferase-V5 blast 病毒感染经 GFP 分选后的细胞。</li>
	<li>感染后 30 小时，用含 10 µg/mL 灭瘟素（blasticidin）的培养基处理细胞，以富集表达 pLX304 Luciferase-V5 blast 的细胞（GFP+, Luc+ 细胞）。此后每隔两天更换含灭瘟素的新鲜培养基。同时，作为对照，将未感染的 naïve 细胞培养于相同含灭瘟素的培养基中。 
	注意：在使用灭瘟素处理数天后，应能明显观察到感染组与对照组细胞之间的差异。该效应依赖于细胞系，通常需要约 8–10 天。若细胞存活率过低，则提示病毒产量不足。此时应重新制备一批病毒，因低效病毒可能影响后续实验结果。</li>
</ol>
4. 验证 体外 荧光素酶活性
<ol>
	<li>培养表达 GFP 的 MCF-7、MDA-MB-468 和 MDA-MB-231 细胞+ Luc+ 在15 cm培养皿中将细胞培养至80%融合度。按照步骤2.1-2.2所述方法，用胰酶消化法收集细胞。</li>
	<li>在每个孔中接种数量递增的细胞（0.1、0.5、1、2、3、4 × 10）4) 加入黑色96孔板中。 
	注意：黑色96孔板更适合用于检测荧光素酶水平，因为白色或透明孔板会产生自发光信号。作为对照，可在其中一个孔中仅加入磷酸盐缓冲液（PBS），以确保PBS本身不产生自发光信号。</li>
	<li>用 100 µL DMEM 填充所有孔，于 16–24 小时内孵育。</li>
	<li>用PBS将30 mg/mL的荧光素原液稀释至1.5 mg/mL，配制荧光素溶液。分装荧光素原液，于-20 °C保存。</li>
	<li>用 PBS 轻柔洗涤细胞一次，每孔加入 100 µL 荧光素溶液，孵育 2 min。最后，利用生物发光法检测所有乳腺癌细胞中的荧光素酶活性。 
	注意：检查 体外 在动物实验之前，检测GFP和荧光素酶的表达至关重要。此外，需使用空白孔扣除背景值。</li>
</ol>
5. 向小鼠注射GFP+ Luc+细胞
<ol>
	<li>转移 5 × 106 （MCF-7 和 MDA-MB-468）或 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP+ Luc+ 分别将细胞重悬于200 µL或100 µL PBS中。</li>
	<li>注射前，用5%消毒液清洁无菌生物安全柜（参见 材料表然后，使用含4%异氟烷的过滤空气（0.2 µm滤膜过滤），以1 L/min的气流速度麻醉小鼠，持续2−3分钟。 
	注意：必须确认小鼠已正确麻醉；可轻捏小鼠脚趾，观察是否有反应。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠置于仰卧位，在其头部放置一个鼻罩。在小鼠眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止麻醉期间眼睛干燥。</li>
	<li>用棉签蘸取乙醇擦拭小鼠乳腺上方的腹部区域，并提起第4对乳腺th 用镊子夹住乳腺组织。</li>
	<li>将27 G × 3/4（0.4 × 19 mm）针头插入脂肪垫下方，缓慢注射100 µL细胞悬液。 
	注意：皮肤下会出现圆形隆起。此外，注射不当可能导致同一实验组中肿瘤生长速率出现偏差或无法形成肿瘤。</li>
	<li>注射操作完成后，将小鼠移出超净台，转入新笼具中。持续观察小鼠，直至其恢复意识。 
	&#8203;注意：所有使用过的针头和注射器均须丢弃至锐器盒中。</li>
</ol>
6. 检测GFP+ Luc+小鼠中荧光素酶的水平
<ol>
	<li>在进行生物发光检测之前，用左手固定清醒的小鼠颈部。然后将手向左侧倾斜，使小鼠面部朝上，下半身呈仰卧位。</li>
	<li>使用1.0 mL注射器（针头规格为27 G x 3/4（0.4 x 19 mm）），将100 µL荧光素酶底物（30 mg/mL）注射至小鼠左下腹部区域的腹腔内。 
	注意：针尖插入腹壁的深度不应超过3–5 mm，以免刺穿内脏器官。此外，建议在无麻醉状态下进行腹腔注射，因为麻醉小鼠体内荧光素的分布速度较清醒小鼠慢。因此，在清醒小鼠中监测荧光素酶水平的操作更为快速。</li>
	<li>注射后让小鼠保持清醒状态7分钟，随后将其置于麻醉舱中3分钟，再开始测量肿瘤动力学。 
	注意：孵育时间因不同实验、细胞系及物种而异。因此，建议在正式实验开始前优化并校准孵育时间。</li>
	<li>按照步骤5.2–5.3所述方法对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>在孵育期间打开软件（材料表），初始化成像系统，并点击初始化按钮。 
	注意：相机冷却至-90 °C大约需要10分钟。此外，作为背景对照，应测量未处理小鼠（即注射了不表达荧光素酶基因细胞的GFP+小鼠）中的荧光素酶水平。</li>
	<li>将系统设置为自动曝光模式，参数如下：曝光时间自动，60 s；中等 binning，光圈F/Stop 1；激发滤光片阻断；发射滤光片打开。当初始化完成后，选择成像向导 | 生物发光，然后点击下一步 | 打开滤光片 | 在图像对象中选择小鼠。</li>
	<li>在视野中选择C级载物台（10 cm），并设置样本高度为1.50 cm。</li>
	<li>点击图像设置载物台至C，在点击采集按钮前，确保小鼠已正确放置于载物台上并保持仰卧位。</li>
	<li>关闭成像舱门，点击采集按钮，并等待图像出现在屏幕上。 
	注意：使用自动曝光模式时，强信号的采集时间为5–20 s（取决于信号强度）；弱信号则大约需要60 s。</li>
	<li>对其他小鼠重复此步骤。</li>
	<li>为检测肺转移灶，使用厚的黑色卡纸遮盖原发肿瘤的强信号区域，仅使肺部腹侧暴露于相机视野中。使用上述相同参数采集图像。</li>
</ol>
7. 采集 离体 利用生物发光和荧光进行成像
<ol>
	<li>使用干燥器中的二氧化碳（CO2）吸入法处死小鼠，并使用高压灭菌的剪刀和镊子解剖小鼠。</li>
	<li>用0.9%生理盐水灌注小鼠，取出器官，并用1×PBS冲洗以去除器官上的血迹。</li>
	<li>将冲洗后的器官转移至培养皿中，放入生物发光成像仪的载物台上。采用与步骤6.2–6.6中所述相同的生物发光设置。 
	注意：由于荧光素酶信号会随时间减弱，此步骤具有时间限制。因此，在处死小鼠后应立即进行器官的生物发光成像。</li>
	<li>对于GFP图像，采用与步骤6.3中所述相同的设置，但将生物发光模式替换为荧光GFP滤光片。</li>
	<li>使用体视显微镜拍摄肺部图像，以检测GFP+克隆的存在情况。</li>
</ol>
8. 生物发光数据的分析
<ol>
	<li>双击软件并选择 开放 来自 文件 菜单</li>
	<li>打开所有文件并将其最小化。确保所有单位均为 辐射度（光子）。此外，单击 全部应用 以保持所有图像参数一致。</li>
	<li>来自 查看 菜单，选择 工具面板，这将打开一个新窗口。</li>
	<li>从 工具面板 窗口，选择 ROI 工具 标签和在 类型，选择 平均背景 ROI.</li>
	<li>从 ROI 工具，选择 圆形，并在小鼠的胸部区域画一个小圆圈。</li>
	<li>双击圆圈，选择 用作未来感兴趣区域的背景 选项从 背景 ROI 标签，然后单击 完成.</li>
</ol>
9. 测量总通量
<ol>
	<li>从 工具面板 窗口，选择 ROI 工具 标签和在 类型，选择 ROI 的测量.</li>
	<li>从 ROI 工具，选择 圆，并在小鼠的原发肿瘤上画一个大圆圈。</li>
	<li>右键单击 复制感兴趣区域 并右键单击 粘贴感兴趣区域 到每只小鼠的各个单独文件中。</li>
	<li>点击 测量感兴趣区域 来自 ROI 工具 标签，将打开一个名为 ROI 测量. 在此选项卡中，保留 测量类型 作为 辐射度（光子） 和 图像属性 作为 所有已填充的值.</li>
	<li>将文件导出为 测量文件 (*.txt) 或 Csv (*.csv) 格式.</li>
	<li>在电子表格中打开导出的数据并进行 总通量（光子/秒） 以及各周的数值。 
	注意：此步骤可用于测量不同组别。例如，经溶剂处理的小鼠 与 那些经药物处理的</li>
	<li>生成一个 XY 散点图，其中 时间 呈现在X轴上 总通量（p/s） 沿Y轴。每周，取 总通量（p/s） 每个样本组的参数，并使用非参数 Student's 检验确定任何显著性差异 t-测试。</li>
</ol>

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<li>Cheng, R. Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+triple+negative+breast+cancer+using+orthotopic+breast+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316(2020).</li>
<li>Bajikar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-suppressor+inactivation+of+GDF11+occurs+by+precursor+sequestration+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer.</a> Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).</li>
<li>Khatib, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutathione+peroxidase+8+%28GPX8%29%2FIL-6%2FSTAT3+axis+is+essential+in+maintaining+an+aggressive+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).</li>
</ol>

所有作者均已声明不存在任何利益冲突。

动物实验是癌症研究的必要手段7,8,9，事实上已有许多相关实验方案被开发出来3,6,10,11,12,13,14。然而，大多数研究仅在实验结束时评估生物学效应，因此对肿瘤生长动力学或转移灶定植的影响仍不明确。本文中，我们提供了一种非侵入性的双荧光素酶成像方法，即将表达GFP和荧光素酶的细胞接种至乳腺脂肪垫。利用这一强大工具，可在活体小鼠中实时监测肿瘤的发生与发展及转移过程<sup class=...

乳腺癌是全球常见的癌症类型，在美国每年约有25万例新诊断病例1。尽管其发病率较高，但一系列新型抗癌药物已显著改善了乳腺癌患者的预后2。然而，目前的治疗手段仍不充分，许多患者会出现疾病复发并发生向重要器官的转移性扩散2，而转移是导致患者发病和死亡的主要原因。因此，乳腺癌研究面临的主要挑战之一是鉴定调控远处转移形成的分子机制，以开发抑制转移发生的新方法。
癌症转移是一个动态过程，其中细胞从原发性肿瘤脱落，并通过血液循环侵入邻近组织。因此，细胞经历类似转移级联过程的动物模型有助于揭示调控该过程的机制3,4此外，这些 体内 模型对于开发乳腺癌治疗药物至关重要5,6然而，这些原位模型无法反映肿瘤实际的生长动力学，因为其效应只能在实验终点进行评估。因此，我们建立了一种基于荧光素酶的工具，用于实时检测肿瘤的发生及转移定植。此外，这些细胞表达绿色荧光蛋白（GFP），可用于检测转移灶。该方法相对简便，且不涉及任何侵入性操作3因此，结合荧光素酶与荧光检测是一种推动乳腺癌治疗及疾病管理临床前研究的有效策略。

<table><tbody><tr><td>1.7 mL 离心管</td><td>Lifegene</td><td>LMCT1.7B-500</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 吸头</td><td>Lifegene</td><td>LRT10</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 吸头</td><td>Lifegene</td><td>LRT1000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Lifegene</td><td>LTB15-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 吸头</td><td>Lifegene</td><td>LRT200</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>COSTAR</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 孔黑色平底板</td><td>Bar Naor</td><td>BN30496</td><td></td></tr><tr><td>全自动细胞计数仪</td><td>Thermofisher</td><td>A50298</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III 分选仪</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 针头 27 G (3/4'')</td><td>BD</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>BD Plastipak 注射器 1 mL × 120</td><td>BD</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm × 20 mm 培养皿</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Corning 150 mm × 20 mm 培养皿</td><td>CORNING</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板载玻片</td><td>Thermofisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基（不含谷氨酰胺）</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i 显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810 R 离心机</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP5820740000</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>FUW GFP</td><td></td><td></td><td>由耶路撒冷希伯来大学 Yossi Buganim 博士实验室惠赠</td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td>由耶路撒冷希伯来大学 Lior Nissim 博士实验室惠赠</td></tr><tr><td>异氟烷，USP Terrell</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-01-25</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum 活体成像系统</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>Biological industries</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Living Image 软件</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>用于生物发光检测</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-468</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>NORMAX</td><td>2430-475</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hylabs</td><td>BP655/500D</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2-dvpr</td><td>Addgene</td><td>#8455</td><td>由美国波士顿怀特黑德研究所 David M. Sabatini&amp;rsquo;s 实验室提供</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>由美国波士顿怀特黑德研究所 David M. Sabatini&amp;rsquo;s 实验室提供</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>90 mm 培养皿（90×15）</td><td>MINI PLAST</td><td>820-090-01-017</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010010S</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 移液管</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010050S</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 移液管</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010005S</td><td></td></tr><tr><td>pLX304 Luciferase-V5 blast 质粒</td><td>Addgene</td><td>#98580</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#107689</td><td></td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>试剂储液槽</td><td>Bar Naor</td><td>BN20621STR200TC</td><td></td></tr><tr><td>SMZ18 体视显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Bio-Lab</td><td>190359400</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Lifegene</td><td>LG-FPV403030S</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 台盼蓝溶液</td><td>Biological industries</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA 溶液 B（0.25%），EDTA（0.05%）</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1a</td><td></td></tr><tr><td>真空驱动滤器</td><td>SOFRA LIFE SCIENCE</td><td>SPE-22-500</td><td></td></tr><tr><td>Virusolve</td><td></td><td>消毒剂</td><td></td></tr><tr><td>VivoGlo 荧光素，活体级</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA 转染试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#6366236001</td><td></td></tr></tbody></table>

利用生物发光技术监测小鼠体内乳腺癌生长及转移灶形成

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

乳腺癌是一种常见的异质性恶性肿瘤，也是女性死亡的第二大原因，主要归因于远处器官转移。目前已建立了多种动物模型，包括广泛使用的原位小鼠模型，即将癌细胞注射到乳腺脂肪垫中。然而，这些模型无法帮助监测肿瘤生长动力学和转移定植过程。用于在小鼠体内实时监测癌细胞的前沿技术将显著推动对肿瘤生物学的理解。
在此，建立了稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白（GFP）的乳腺癌细胞系。该技术具体包含两个连续步骤，首先通过检测荧光素酶活性开始 体外 随后将癌细胞植入非肥胖型糖尿病-重度联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠的乳腺脂肪垫中。注射后，通过非侵入性生物发光成像系统实时监测肿瘤生长和转移定植情况。随后，利用荧光显微镜检测肺组织中表达绿色荧光蛋白（GFP）的转移灶，以验证生物发光成像结果。该复杂系统结合了荧光素酶和荧光检测技术，用于评估癌症转移 体内 在乳腺癌治疗和疾病管理方面具有巨大应用潜力。

我们构建了表达GFP和荧光素酶载体的乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-468）。具体方法为连续感染：首先，用表达荧光GFP的慢病毒载体感染乳腺癌细胞系，筛选出GFP阳性细胞（GFP+感染后2天进行分选（图1A，B）并用 pLX304 Luciferase-V5 载体感染。随后使用杀稻瘟菌素筛选以获得荧光素酶表达，从而生成指定的（GFP+，Luc+) 细胞。为了验证该结果 体外 荧光素酶活性，我们证明了荧光素酶活性水平随细胞数量增加而升高（图1C此外，荧光素酶活性与细胞数量之间存在线性相关性（图1D).
为确认小鼠中荧光素酶的检测效果，将三种GFP+、Luc+乳腺癌细胞系分别注射至雌性NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。...

本文介绍了一种非侵入性监测方法，该方法涉及在多种乳腺癌细胞系中表达荧光素酶和绿色荧光蛋白。本方案提供了一种在小鼠体内实时监测肿瘤形成和转移定植的技术。

乳腺癌是一种常见的异质性恶性肿瘤，是女性癌症死亡的第二大原因，主要归因于远处器官转移。多种……

利用这种复杂且无创的工具，我们可以实时监测小鼠体内肿瘤的生长动力学及转移定植过程，在乳腺癌治疗和疾病管理方面具有巨大潜力。结合荧光素酶与荧光检测是一种有效的策略，有助于推动乳腺癌进展及疾病管理的临床前研究，该方法可应用于抗癌药物的研究。该方案不仅限于乳腺癌，还可应用于其他癌瘤，例如肺癌和胰腺癌。首先将 MCF-7、MDA-MB-468 以及 MDA-MB-231 的 GFP 和荧光素酶阳性细胞分别在 16 厘米培养皿中培养至 80% 汇合度。通过胰酶消化收集细胞后，将数量递增的细胞接种至黑色 96 孔板的各个孔中。然后，向所有孔中加入 100 µL DMEM，于 37°C、5% CO₂ 培养箱中孵育 16 至 24 小时。用 PBS 配制浓度为 1.5 mg/mL 的荧光素溶液，并将溶液在 -20°C 下保存。孵育结束后，轻轻用 PBS 洗涤细胞一次，然后向每孔加入 100 µL 荧光素溶液。等待两分钟，然后使用生物发光法检测所有乳腺癌细胞中的荧光素酶活性。在注射小鼠前，将五百万个 MCF-7 和 MDA-MB-468 细胞转移至 200 微升 PBS 中，将两百万个 MDA-MB-231 GFP 及荧光素酶阳性细胞转移至 100 微升 PBS 中。将麻醉后的小鼠置于仰卧位，并在其头部放置一个锥形罩，以准备注射。接下来，使用棉签蘸取乙醇擦拭小鼠乳腺上方的腹部区域，用镊子提起第四对乳腺，将27号针头插入脂肪垫下方，缓慢注入100 µL制备好的细胞悬液。注射完成后，将小鼠移出超净台，转移至新笼中，在观察下直至其恢复意识。进行生物发光检测前，用左手固定清醒小鼠的颈部，并将手向左侧倾斜，使小鼠面部朝上，下半身呈仰卧位。 使用1毫升注射器，向小鼠左下腹部象限腹腔注射100微升浓度为30毫克/毫升的荧光素。小鼠在无麻醉状态下保持7分钟，随后在麻醉舱内麻醉3分钟，之后测量肿瘤动力学。小鼠孵育期间，打开软件，点击“Initialize”按钮以初始化成像系统。将设备设置为自动曝光模式，曝光时间自动设定为60秒，binning设为中等，光圈值为f/1，激发滤光片关闭，发射滤光片打开。初始化结束后，选择成像向导（Imaging Wizard）和生物发光（Bioluminescence），然后点击“下一步”，点击“打开滤光片”（Open Filter）以在图像对象中选择小鼠。在视野范围内，选择载物台位置C，距离为10厘米，样本高度为1.50厘米。然后，单击图像设置阶段至 C。在关闭舱门并单击“采集”按钮之前，确保小鼠以正确的仰卧位放置在成像台上。等待图像出现在屏幕上。对另一只小鼠重复此操作。为检测肺转移，使用厚纸板遮挡原发肿瘤的强信号，仅使肺的腹侧面向相机暴露。使用与之前所述相同的参数采集图像。乳腺癌细胞系被表达荧光GFP的慢病毒载体感染，并进行FAC分选。感染后两天对GFP阳性细

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癌症研究

使用生物发光监测小鼠乳腺癌生长和转移集落形成

通过心内注射表达荧光素酶的乳腺肿瘤细胞，建立小鼠骨转移实验模型。利用生物发光成像和微型CT对肿瘤的发展及其导致的溶骨性病变进行纵向监测。...

监测肿瘤转移和溶骨性病变的生物发光与微型CT成像技术

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in vivo 生物发光成像技术在小鼠模型中对乳腺癌脑转移瘤缺氧动态的观察

来源：Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1, Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró...

生物发光成像观察雌性小鼠模型中乳腺肿瘤的进展

生物发光成像是一种用于定位肿瘤和转移灶的常用工具，但这些图像的定量分析通常需要复杂的计算和特定的仪器。我们介绍了易于使用的luminoscore方法，该方法基于精确的成像采集条件，无需任何计算，即可在小鼠模型中监测肿瘤负荷及治疗反应。...

基于生物发光的肿瘤定量方法用于监测小鼠淋巴瘤模型中的肿瘤进展及治疗效果

本文描述了一种原位乳腺癌原发肿瘤模型，以及通过手术切除原发肿瘤以延长小鼠生存期从而产生自发性转移的方法。肿瘤的生长和进展通过荧光素酶成像进行监测和定量。...

一种自发性乳腺癌转移的原位小鼠模型

我们介绍了一种利用生物发光技术量化肿瘤负荷的小鼠原位乳腺癌模型和根治性乳房切除术模型，以模拟人类乳腺癌的进展过程。...

建立小鼠原位转移性乳腺癌模型及实施小鼠根治性乳房切除术

本方案描述了建立荷瘤小鼠模型，通过双荧光素酶成像实时监测肿瘤进展和血管生成的方法。...

双生物发光成像监测肿瘤进展与血管生成

本研究提出了一种先进的方案，通过检测绿色荧光蛋白和生物发光信号，并结合定量分子检测技术，精确评估肿瘤负荷。...

利用原位乳腺癌模型研究三阴性乳腺癌

所述方法结合了实验性尾静脉转移模型与活体动物实时成像技术，可实现对乳腺癌转移灶形成和生长的实时监测，同时还能对肺部转移灶的数量和大小进行定量分析。...

联合使用尾静脉转移实验与活体实时成像技术定量分析乳腺癌肺部转移定植及负荷

该论文描述了一种方法，用于建立原位注射乳腺肿瘤后自发性肺转移模型，并对转移级联各阶段进行纵向生长监测，适用于干预转移过程的各个阶段。...

体内成像检测原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

本文描述了在动物模型中将携带RNA寡核苷酸的磁性氧化铁纳米颗粒递送至转移性乳腺癌的体内给药方案，为癌性核酸的治疗性沉默提供了一种具有临床可行性的方法。...

监测纳米药物在小鼠乳腺癌转移灶中的蓄积

学习使用生物发光和荧光技术在小鼠体内实时监测乳腺癌肿瘤生长动力学和转移集落形成。该方法适用于MCF-7、MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞系，可用于临床前抗肿瘤药物研究。

利用生物发光技术监测小鼠体内乳腺癌生长及转移灶形成

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